PHÂN lập và SÀNG lọc VI SINH vật BIỂN SINH ENZYM có KHẢ NĂNG cắt MẠCH FUCOIDAN

Vì một trong những lí do này mà các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu vào đối tượng rong nâu và tìm ra được rất nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như là kháng khuẩn, kháng khối u,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NHA TRANG, NĂM 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Ngô Đăng Nghĩa- giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và TS Trần Thị Thanh Vân- trưởng phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn toàn thể ban lãnh đạo, các cán bộ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ và giúp

đỡ tôi để tôi có đủ điều kiện thực hiện đồ án

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, phòng đào tạo Đại học và sau Đại học cùng các thầy cô Trường đại học Nha Trang đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn trong suốt quá trình học và làm đồ án

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để tôi hoàn thành đồ án này

Trần Nguyễn Hà Vy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về rong biển 5

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 5

1.1.2 Phân loại rong biển 6

1.1.3 Phân bố và ứng dụng rong Nâu trên thế giới 6

1.1.4 Rong Mơ Việt Nam 7

1.2 Tổng quan về enzyme 8

1.2.1 Khái niệm chung về enzyme 8

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 9

1.2.3 Tính chất của enzyme 11

1.3 Giới thiệu về Fucoidan 14

1.3.1 Fucoidan 14

1.3.2 Hoạt tính sinh học của Fucoidan 16

1.3.3 Ứng dụng của fucoidan và oligosacharit của nó 19

1.3.3.1 Một số ứng dụng của Fucoidan tự nhiên 19

1.3.3.2 Một số ứng dụng của oligosaccharit từ một fucoidan 20

1.3.3.3 Một số sản phẩm Fucoidan trên thế giới 20

1.4 Enzyme có khả năng phân cắt fucoidan 21

1.4.1 Enzyme fucoidanase 21

1.4.2 Một số nghiên cứu về fucoidanase trên đối tượng vi sinh vật 21

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Chủng giống 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật 23

2.2.2 Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật 25

2.2.3 Thử nghiệm họat tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan 26

2.2.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan 28

2.2.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào 28

2.2.4.2 Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme 28

2.2.4.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 28

2.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat tính enzyme 28

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật biển theo định hướng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan 29

3.2 Sàng lọc vi sinh vật biển theo định hướng sinh enzyme cắt ngắn mạch fucoidan 32

3.3 Khảo sát điều kiện tách chiết enzyme 35

3.3.1 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến việc thu nhận sinh khối tế bào 35

3.3.2 Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạtt tính enzyme 36

3.3.3 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 36

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 38

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 41

PHỤ LỤC 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số ứng dụng của fucoidan chiết từ rong nâu 19

Bảng 1.2: Ứng dụng của ologosacarit từ fucoidan 20

Bảng 1.3: Vi sinh vật biển và enzym của chúng 22

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của một số loại fucoidan 23

Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn biển đã phân lập được 30

Bảng 3.2: Hoạt tính enzyme khi lên mem vi sinh vật trên môi trường lỏng chứa fucoidan từ rong S mcclurei 33

Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme khi ly tâm với tốc độ khác nhau 35

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các loại đệm lên hoạt tính enzyme 36

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 37

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Một số loài rong có chứa fucoidan 15

Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus 16

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập vi sinh vật biển 24

Hình 2.2: Xử lý mẫu rong trước khi phân lập 25

Hình 2.3: Sơ đồ nuôi cấy và tách chiết enzyme từ vi sinh vật 26

Hình 2.4: Đường chuẩn fucose 27

Hình 3.1: Lên men vi sinh vật để tạo enzym fucoidanase 32

Hình 3.2: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme 37

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 38

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate DNA Deoxyribonucleic acid

269 loài rong đỏ, 143 loài rong nâu và 76 loài rong lam [13]

Ngay từ xa xưa nhiều loài rong tảo đã được con người sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc, một số nước tại vùng biển Châu Á, Châu Mỹ một số loài rong còn được sử dụng để làm thuốc Câu chuyện về tỉ lệ người chết thấp và tỉ lệ người cao tuổi sống khỏe mạnh (trên 100 tuổi) khác thường ở đảo Tonga (Nam Thái Bình Dương) vẫn hấp dẫn các nhà khoa học khi những người dân đảo này cho biết họ sống được như vậy là nhờ rong nâu, loài thực vật mà họ đã thu hoạch và sử dụng hơn 3000 năm nay Người Tonga tin rằng rong nâu chính là nguồn dược liệu giúp

họ tăng tuổi thọ, sức khỏe và sinh lực Vì một trong những lí do này mà các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu vào đối tượng rong nâu và tìm ra được rất nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như là kháng khuẩn, kháng khối u, tăng cường khả năng miễn dịch Đăc biệt là fucoidan được tìm thấy trong rong nâu là chất có rất nhiều hoạt tính sinh học quý giá Ngoài fucoidan trong rong nâu còn có nhiều hợp chất có giá trị kinh tế như: laminaran, mannitol, gibberelin, cytokinin, auxin, iod, khoáng, axit béo … và nhiều loại vitamin

Việt Nam có hơn 120 loài rong nâu với sản lượng ước tính trên 10000 tấn khô/năm, nhưng đa số người dân thường thu hoạch rong này để làm phân bón và thức ăn chăn nuôi Thấy được tiềm năng này Viện Nghiên Cứu và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang đã triển khai nghiên cứu và sản xuất thành công fucoidan là một hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học và có giá trị thực tiễn [1],[2]

Fucoidan, một sulphat polysaccharide sinh học được chiết từ rong nâu, đặc biệt được quan tâm nghiên cứu nhờ nhiều hoạt tính dược lý đặc biệt như chống đông tụ, chống viêm nhiễm, điều tiết miễn dịch, ức chế sự phát triển ư bướu, kháng

ung thư và kháng virus kể cả virus HIV … và hơn nữa nguồn cung cấp chủ yếu là rong nâu tự nhiên có trữ lượng lớn tại các vùng biển nước ta

Tuy nhiên mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của chúng vẫn chưa được giải thích rõ ràng do cấu trúc phức tạp và không theo quy luật của fucoidan từ các nguồn gốc loài rong khác nhau mà nó được chiết ra Trong mạch phân tử của chúng chứa chủ yếu các gốc fucose được sulphat hóa ở các vị trí khác nhau và liên kết với nhau thông qua một số liên kết như (1-3) (1-4), (1-2) glycosit ít theo quy luật Ngoài ra trong phân tử còn có mặt một số đường đơn khác như:

galactose, manose, xylose, glucose và các mạch nhánh có chứa gốc fucosyl, galatosyl …Chính vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố cấu trúc lên hoạt tính sinh học của fucoidan là một thách thức không nhỏ đối với các nhà khoa học

Điều này chỉ được giải quyết hiệu quả nhất khi sử dụng các loại enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan như là một công cụ để nghiên cứu cấu trúc cũng như tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan

Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra 2 loại ezyme O-glycosyl hydrolase có hoạt tính với fucoidan đó là fucoidanase và α-L-fucosidase Hoạt tính của α-L-fucoisidase được mô tả dễ dàng như là sự giải phóng L-fucose khỏi đoạn cuối của một phân tử polysaccharide, thì việc xác định hoạt tính của fucoidanase được giải thích bởi hai kiểu bẻ gãy liên kết glycosit Fucoidanase có thể bẻ gãy các liên kết glusosit bên trong phân tử polysaccharide làm giảm nhanh chóng trọng lượng phân tử (endo-fucoidanase) hoặc ở phía rìa ngoài của phân tử để lấy đi một số phân tử oligosaccharide làm cho trọng lượng phân tử giảm từ từ (exo-fucoidanase) [23],[46]

Do fucoidan được chiết từ các loài rong khác nhau thì khác nhau nên các nghiên cứu về cơ chế tác động của fucoidanase còn rất hạn chế và khó để so sánh các kết quả thực nghiệm với nhau

Các nhà khoa học Pháp và Nhật đã công bố tìm thấy một số loại fucoidanase

từ một số loại động vật thân mềm biển như: bào ngư Haliotis sp, điệp Pectenmaximus, động vật thân mềm Pectinidae Patinopecten Yessoensis Các

enzyme này có khả năng thủy phân fucoidan một cách rất hiệu quả để tạo thành các oligosaccharide [7],[8] Tuy nhiên việc tiềm kiếm enzyme từ động vật thân mềm biển chỉ có ý nghĩa về mặt nghiên cứu nhưng khó có thể đưa vào ứng dụng ở quy

mô sản xuất công nghiệp Vì vậy, người ta đặc biệt quan tâm đến enzyme cắt mạch fucoidan có nguồn gốc vi sinh vật là vì các lí do sau: thứ nhất tốc độ sinh trưởng và sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất cao, thứ hai có thể kiểm soát được điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật sinh tổng hợp các chất theo định hướng của chúng ta, thứ ba nuôi cấy vi sinh vật ta có thể thu toàn bộ sinh khối vi sinh một cách dễ dàng và ít tốn diện tích nuôi cấy Một số nhóm các nhà khoa học Nhật Bản [9],[10] đã phân lập được vi khuẩn có khả năng cắt mạch fucoidan từ trầm tích biển và nước biển Trong vài thập kỉ trở lại đây có nhiều nghiên cứu thú vị về enzyme fucoidanase phân lập từ vi sinh vật biển được công bố

Chẳng hạn, Sakai và cộng sự [43],[44] đã phân lập từ biển Nhật Bản vi khuẩn

Flavobateriacea có thể phân cắt nhiều loại fucoidan khác nhau được chiết từ các loài rong Laminariales, Kiellmaniella crassifolia, Lessonia nigrescens và Undaria pinatifida Cho đến năm 2004, chúng tôi chưa tìm thấy một công bố nào trong nước

đề cập một cách toàn diện polysaccharide từ rong nâu Việt Nam cũng như việc cắt mạch chúng thành oligosaccharide sử dụng enzyme từ vi sinh vật biển [1],[2]

Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên tế bào sinh vật

và tiến tới sử dụng chúng để làm dược liệu thì việc xác định cấu trúc hóa học của chúng là điều kiện tiên quyết Các phương pháp sử dụng hóa lý hiện nay (thủy phân, đề-sulphat hóa, đề-actyl hóa) trước khi phân tích thường đòi hỏi điều kiện acid hoặc kiềm mạnh ở nhiệt độ cao, do đó có thể làm thay đổi cấu trúc của polysaccharide [7],[8],[9],[11] Các phương pháp enzyme đặc hiệu có thể được sử dụng để điều chế các oligosaccharide thích hợp cho các nghiên cứu sinh học cũng như các mẫu đơn giản hóa, từ đó có thể suy luận ra cấu trúc của fucoidan ban đầu Ngoài ra việc cắt ngắn mạch fucoidan bằng enzyme vi sinh vật còn tạo ra các tổ hợp oligosaccharide

mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu và hiệu lực cao hơn so với fcoidan ban đầu, đây

là xu hướng phát triển trên thế giới [22]

Chính vì vậy, trong khuôn khổ đồ án tốt nghiệp này tôi chọn đề tài nghiên

cứu là “Phân lập và sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme có khả năng cắt mạch fucoidan”

Nội dung luận văn bao gồm:

 Phân lập vi sinh vật biển theo định hướng phân cắt fucoidan

 Sàng lọc vi sinh vật biển sinh enzyme cắt mạch fucoidan

 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme fucoidanase

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về rong biển

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển

Rong biển là kho chứa gồm: thực phẩm, thuốc chữa bệnh, nguyên liệu cho công nghiệp, nông nghiệp Đã bao đời nay trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và đang sử dụng rong biển là thực phẩm trực tiếp trong bữa ăn hằng ngày

Rong biển (marine algae) là một loại thực vật bậc thấp sống ở biển hoặc vùng nước lợ ven biển Sự có mặt trong thủy vực của chúng đóng hai vai trò quan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn và còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển [6]

Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục mét, hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt Hằng năm đại dương cung cấp cho con người khoảng 200 tỷ tấn rong Trong 90% cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằng năm nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% từ rong biển [33],[38]

Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo như: agar, alginat, carrageenan dùng cho thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ sinh học

Các polysaccharide từ rong biển được coi là những chất hữu cơ không được thay thế trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khi được sử dụng như là chất tạo đông, làm đặc, chất ổn nhũ và chất ổn định Các oligosaccharide có tác dụng kháng nấm bệnh, ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV nhiều hợp chất hữu cơ trong rong biển có tác dụng điều hòa kích thích sinh trưởng đối với cây trồng nên đã được sản xuất thành phân bón hữu cơ [6]

Giá trị dinh dưỡng của rong biển là cung cấp đầy đủ các chất khoáng, các acid amin cần thiết, các loại vitamin, các carbohydrat đặc trưng và các chất có hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể và có khả năng phòng bệnh tật Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng và ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Theo Algorythme (2000) sản lượng thu hoạch rong biển kinh tế thế giới đạt 8 triệu tấn Doanh thu hằng năm từ kinh tế rong biển trên thế giới ước tính vào khoảng trên 8 tỷ USD [38]

1.1.2 Phân loại rong biển

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia làm 9 ngành sau đây:

1) Ngành rong lục (Chlorophyta) 2) Ngành rong nâu (Phaeophyta) 3) Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 4) Ngành rong trần (Englenophyta) 5) Ngành rong giáp (Pyrophyta) 6) Ngành rong khuê (Bacillareonphyta) 7) Ngành rong kim (Chrysophyta) 8) Ngành rong vàng (Xantophyta) 9) Ngành rong lam (Cynophyta)

Rong đỏ và rong nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong nghành công nghiệp và đời sống Đối với rong lục thì

loại tảo clorella được xếp vào loại tảo kì diệu, có tốc độ sinh khối cực nhanh, đang

được nghiên cứu phục vụ cho đời sống con người [6]

1.1.3 Phân bố và ứng dụng rong nâu trên thế giới

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là

Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile,

Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha Trong

đó, bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận

nhiệt đới

Phân bố về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ Tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải, điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong

Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng

27.000 tấn

Ngành rong nâu có khoảng 190 chi, trên 900 loài phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm thấy trong nước lợ và nước ngọt không nhiều lắm Rong có màu nâu đậm, nâu vàng Màu sắc khác nhau ở các loài phụ thuộc vào thành phần và tỉ lệ của các loại sắc tố có trong rong Rong nâu được coi là nguồn polysaccharide có ứng dụng rộng lớn nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng như: axit alginic, fucoidan, laminaran Trước tiên axit alginic và các muối của chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y học

Laminaran được biết đến như là những chất kháng ung thư, chất bảo vệ phóng xạ và chất đông lạnh Fucoidan và những chất chuyển hóa phân tử thấp như mannitol, các axit tự do, polyphenol, các hợp chất iod, các vitamin và các acid béo được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và nghiên cứu y sinh học

1.1.4 Rong Mơ Việt Nam

Ở Việt Nam, các loài rong Mơ thuộc chi Sargassum, họ Sargassaceae, bộ Fucales, ngành rong nâu là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất, chúng phân bố

khá phổ biến ở ven biển và hải đảo phía Nam Việt Nam (từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu

bón, nấu lấy nước uống để chữa bệnh hoặc làm thức ăn cho gia súc, ngày nay rong

mơ được dùng để chiết các polysaccharide dùng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Sinh lượng trung bình từ 2000-4000g/m2, có nơi đến 7000g/m2 như ở Hòn Chồng, Nha Trang [6]

1.2 Tổng quan về enzyme [3],[5]

1.2.1 Khái niệm chung về enzyme

Định nghĩa

- Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein

- Enzyme có trong tế bào của mọi sinh vật

- Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao

đổi chất trong cơ thể sinh vật) gọi là in vivo mà còn xúc tác phản ứng ngoài cơ thể gọi là in vitro

- Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản, phát triển bình thường được Sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại

Phân loại enzyme

Hội Nghị Sinh Hóa quốc tế lần thứ 5 tiến hành phân loại enzyme thành 6 nhóm lớn

- Nhóm 1: Oxydroreductase: xúc tác phản ứng oxy hóa khử

Ví dụ: Dehydrogenase, oxydase, peroxydase…

- Nhóm 2: Transferase: xúc tác cho phản ứng chuyển vị một nhóm nào đó

từ chất này sang chất khác

Ví dụ: Photpho – transferase Amoniac – transferase

Metyl – transferase, Cacboxyl – transferase

- Nhóm 3: Hydrolase: xúc tác phản ứng thủy phân

Ví dụ: Esterase: xúc tác thủy phân liên kiết este

Glucosidase: thủy phân liên kết glucoside trong glucid và glucoid

Peptidase: thủy phân liên kết peptid trong protein

Amidase: phản ứng thủy phân các amin

- Nhóm 4: Lyase: enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không cần có sự tham gia của nước

Ví dụ: Aspagagin – synthetase: enzyme tổng hợp Aspagagin

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme

Thường thì enzyme hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, khi tăng nhiệt độ quá giới hạn( thường 600C), phân tử protein trong enzyme bắt đầu biến tính, hoạt tính xúc tác sẽ giảm nhanh, vận tốc phản ứng giảm theo

Nhiệt độ mà tại đó v = vmax gọi nhiệt độ tối ưu top Mỗi enzyme có một top Trong phản ứng do enzyme xúc tác, chừng nào enzyme chưa bị biến tính thì vận tốc phản ứng tăng lên gấp 2 khi nhiệt độ tăng 100C

Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính enzyme giảm, ở 00C hoạt tính enzyme không còn đáng kể, khi tăng nhiệt độ lên thì hoạt tính enzyme tăng trở lại, vì vậy ứng dụng bảo quản enzyme ở nhiệt độ lạnh( -200C đến -300C)

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme

Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường Bất cứ sự thay đổi nhỏ nào của

pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất Do đó pH tác dụng rất lớn đến vận tốc phản ứng của enzyme

Mỗi enzyme có một pH mà tại đó vận tốc phản ứng của enzyme đạt cực đại

Người ta gọi đó là pH tối ưu của enzyme Thông thường pHop của enzyme nằm ở vùng acid yếu hay kiềm yếu hay trung tính Đặc biệt có một số enzyme có pHop nằm

ở vùng rất acid như pepsin có pHop ≈ 1.5 - 2.5 hoặc rất kiềm như tripsin ≈ 8 – 9

Lý do pH ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzyme

Enzyme có nhóm định chức ion hóa (-) hoặc (+) như –COOH, -NH2, -OH do

đó pH môi trường thay đổi sẽ làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm chức này, vì vậy làm thay đổi điện tích của enzyme, khi đó ái lực giữa enzyme và cơ chất giảm

Trong một số trường hợp các ion H+ và OH- có thể tham gia trực tiếp vào phản ứng làm pH môi trường thay đổi, điện tích H+

và OH- thay đổi, vận tốc phản ứng giảm xuống

Sau khi enzyme kết hợp với cơ chất sẽ tạo hợp chất trung gian ES Sự biến đổi từ chất trung gian đến sản phẩm thì ứng với một dạng ion hóa đặc biệt của phức

ES Do đó nếu pH môi trường thay đổi sẽ ảnh hưởng đến dạng ion hóa của phức ES làm vận tốc phản ứng giảm

Ảnh hưởng của sự oxy hóa và bức xạ

Một số enzyme trong cấu tạo có nhóm –SH, nhóm này rất quan trọng đối với phản ứng của enzyme Nó là nhóm định chức ở trung tâm hoạt động và giữ cho enzyme có cấu hình thích hợp Tuy nhiên –SH rất dễ bị oxy hóa bởi không khí tạo cầu S-S làm cho cấu hình của enzyme không còn phù hợp nữa, enzyme mất hoạt tính

Enzyme còn bị ảnh hưởng bởi tia bức xạ, đặc biệt rất nhạy cảm với bức xạ có

độ dài sóng thấp (năng lượng cao) Tia UV ảnh hưởng đến hiệu ứng của DNA, ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme, dẫn đến hiệu ứng enzyme bị ảnh hưởng và vận tốc phản ứng thay đổi

1.2.3 Tính chất của enzyme Tính chất lý hóa chung

- Enzyme có cấu tạo là protein do đó chúng có đầy đủ tính chất của protein:

dễ biến tính, dễ kết tủa, dễ mất hoạt tính sinh học…

- Enzyme không thẩm tích qua màng bán thấm

- Enzyme không chịu được nhiệt độ cao, dễ biến tính bởi nhiệt độ cao và có thể mất hoạt tính xúc tác

- Tan trong nước, dung môi có cực khác, dung dịch muối loãng, glycerin

- Khối lượng phân tử lớn

Cường lực xúc tác và cơ chế tác dụng của enzyme

- Khi có xúc tác vô cơ (platin) năng lượng này là 11700 calo/ptg

- Khi có xúc tác là enzyme catalase năng lượng này là 5500 calo/ptg

- Người ta có thể khẳng định rằng enzyme tham gia vào vai trò chất xúc tác,

có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa và làm cho phản ứng xảy ra nhanh chóng, dễ dàng

Cơ chế xúc tác của enzyme

- Enzyme tiếp xúc với cơ chất tạo thành phức chất trung gian E-S

- Khi tạo phức E-S, dưới tác dụng của enzyme, cấu tạo cơ chất bị biến đổi, phân tử cơ chất S bị phân cực, các điện tích bị phân phối lại do đó làm thay đổi sự phân bố điện tích, giảm độ bền các liên kết trong phân tử cơ chất, làm giảm năng lượng hoạt hóa, tăng tốc độ phản ứng

E + S  E-S  E + P

 Fise: thuyết chìa khóa với ổ khóa

Trung tâm hoạt động của enzyme phải có cấu trúc không gian tương ứng, phù hợp với cấu trúc không gian của S

 Kosland bổ sung thêm thuyết của Fise

Sự trùng khớp enzyme và cơ chất về cấu trúc không hoàn toàn tĩnh và cứng nhắc như chìa khóa với ổ khóa mà giữa cơ chất và enzyme có sự linh đông khi tương tác giữa cơ chất và enzyme Giả thuyết này được gọi là thuyết “tiếp xúc cảm ứng”

Một số enzyme tiêu hóa như pepsin, trypsin, chimotrypsin … khi mới tiết ra

ở dạng không hoạt động gọi là tiền enzyme (zimogen) có tên là pepsinnogen, trypsinogen, chymotrypsinogen … chúng chỉ hoạt động khi được hoạt hóa Trong quá trình hoạt hóa, sự cắt bỏ một số peptid, các peptid này là các “peptid kìm hãm”

hoạt động enzyme Nhờ sự cắt bỏ này mà có sự sắp xếp lại nội tại phân tử enzyme, kết quả dẫn tới sự hình thành trung tâm hoạt động của enzyme có khả năng hoạt động

Tính đặc hiệu xúc tác của enzyme

Enzyme chỉ tác dụng lên một loại cơ chất nhất định hoặc chỉ một cơ chất duy nhất, hoặc chỉ xúc tác một kiểu phản ứng hóa học nhất định Tính chất này gọi là tính đặc hiệu của enzyme, đây là một trong những tính chất đặc trưng của enzyme khác xa chất xúc tác thông thường Người ta thường phân biệt các dạng đặc hiệu sau:

quang học sau: dạng D, dạng L, dạng cis, dạng trans …

Ví dụ: Fumarat-hydratase chỉ tác dụng lên dạng L-acid malic mà không tác dụng lên dạng D-acid malic

Đặc hiệu tương đối

Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong

cơ chất mà không phụ thuộc vào bản chất hóa học của các cấu tử tham gia hình thành liên kết đó

Ví dụ: Lypase thủy phân liên kết ester trong các chất béo mà không phụ thuộc vào các gốc R1, R2, R3

Arginase chỉ thủy phân L-agrinin tạo L-ornitin + ure

Maltase chỉ thủy phân malto

vv

Sử dụng enzyme trong nghiên cứu polysacharide

Để thu nhận những thông tin về cấu trúc của polysacharid, đặc biệt là fucoidan sẽ rất hiêu quả nếu sử dụng enzyme

Ví dụ: Enzyme 1,6-L-fucoidanse sử dụng để xác định fucose trong liên kết 1,6

Enzyme L-fucoidanase được sử dụng để chuyển hóa fucoidan thành các oligo fucan sulphat hóa

1.3 Giới thiệu về Fucoidan

1.3.1 Fucoidan

Fucoidan là một polysaccharide sulphate được Kylin mô tả đầu tiên vào năm

1913 từ loài rong nâu Laminaria digitata và ông điều chế được chúng vào năm

1915 với tên gọi là Fucoidin [13] Sau gần 100 năm kể từ khi Kyllin phát hiện ra, fucoidan được mô tả là một polysaccharide sulphat hóa dị hợp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60% [30],[31], sulphat chiếm từ 17,7% đến 32,9% [30],[48], ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose và acid uronic Các liên kết glycosit là liên kết (1-3), (1-2) hoặc (1-4) và các liên kết này có thế là liên kết mạch thẳng hoặc mạch nhánh Vị trí nhóm sulphat có thể ở 3 vị trí đó là C2, C3 và C4 Những năm sau này fucoidan không chỉ được tìm thấy ở các loài rong nâu mà còn được tìm thấy ở một số loài động vật thân mềm biển như Dưa chuột biển, Cầu gai biển tuy nhiên đáng kể nhất vẫn là fucoidan chứa trong rong nâu với hàm lượng lên tới 6,5% trọng lượng khô

Một số loài rong chứa fucoidan được chỉ ra trên hình 1.1

Hình 1.1: Một số loài rong có chứa Fucoidan

1 Fucus vesiculosus, 2 Laminaria digitata, 3 Fucus evanescens, 4 Fucus serratuss, 5 Asscophyllum nodosum, 6 Pelvetia canaliculata, 7 Cladosiphon okamuranus, 8 Hizikia fusiforme, 9 Laminaria japonica,

10 Sargassum horneri, 11 Nemacystus decipiens, 12 Padina gymnospora, 13 Stichopus japonicas[35]

Đặc biệt fucoidan không được tìm thấy ở động thực vật trên cạn Fucoidan từ các nguồn chiết khác nhau thì có cấu trúc khác nhau Hơn thế nữa, cùng một nguồn fucoidan nhưng phương pháp tách chiết khác nhau sẽ thu được fucoidan có thành phần khác nhau Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu khác nhau để chiết được fucoidan có hiệu suất cao sẽ có phương pháp chiết đặc biệt để chiết chúng Do đó, cho đến nay mới chỉ có duy nhất một loại fucoidan được bán trên thị trường đó là

fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus

Hình 1.2: Cấu trúc fucoidan chiết từ rong Fucus vesiculosus

1.3.2 Hoạt tính sinh học của Fucoidan

 Hoạt tính chống đông tụ

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính chống đông tụ của fucoidan có thể

có mối quan hệ với vị trí của nhóm sulphat, trọng lượng phân tử và thành phần đường Fucodan có chứa nhóm sulphat cao hơn thường có hoạt tính chống đông tụ

cao hơn so với fucoidan không có nhóm sulphat (E kurome, H fusiforme, etc.)

[21], [36]

Năm 1937, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã chiết các hợp chất trong rong nâu theo 31 phân đoạn từ trung tính đến acid, đem thử hoạt tính kháng ung thư và họ cho rằng hai phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình khoảng

13500Da và 19000Da có hoạt tính kháng ung thư Các fucoidan này tương tác trực tiếp với tế bào ung thư và tiêu diệt những tế bào ung thư này [51].

Theo các nhà khoa học, fucoidan có tác dụng chữa ung thư theo các cơ chế sau:

1) Fucoidan thúc đẩy các tế bào ung thư tự phá hủy Điều này có nghĩa là DNA trong tế bào ung thư bị bẻ gãy bởi các enzym trong tế bào làm cho các tế bào ung thư không có khả năng sinh sản, không hình thành khối u [19]

2) Fucoidan tăng cường hệ miễn dịch nên fucoidan phục hồi lại các tế bào, tăng cường bảo vệ tế bào bình thường, cảnh giác tế bào lạ [32]

 Tăng cường tính miễn dịch

Fucoidan kích thích sự sản xuất tế bào miễn dịch giúp cho cơ thể có khả năng chống lại vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng và ngay cả tế bào ung thư Các tế bào diệt tự nhiên là các tế bào làm nhiệm vụ đầu tiên bảo vệ hệ miễn dịch cho cơ thể con người Fucoidan chứa các đường đặc biệt làm sản sinh các tế bào diệt tự nhiên chống tất cả các bệnh Khi những người sức khỏe yếu sử dụng fucoidan làm tăng số

tế bào diệt tự nhiên giúp cơ thể có khả năng tự bảo vệ [16]

 Hoạt tính kháng virus

Trong những năm gần đây người ta đã chứng minh được rằng polysaccharide sulphat (bao gồm fucoidan) biểu hiện hoạt tính kháng vi rút cả invivo và invitro

Fucoidan của Laminaria japonica có các chức năng kháng loại vi rút RNA và DNA

Vai trò của Sulphat thì cần thiết cho hoạt tính kháng virut Hơn nữa, fucoidan còn

có các hoạt tính ức chế chống lại sự sao chép vỏ ngoài một số vi rút quan trọng như HIV và HCMV [40]

 Hoạt tính kháng khuẩn

Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương

và vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não

một biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra Fucoidan cũng được xem là một hợp chất điều trị HIV Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng interferon kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để đề phòng nhiễm trùng và bệnh

tật [27]

 Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu

Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong biển tác động dương tính lên phản ứng insulin và đường huyết trong các động vật thí nghiệm Việc đưa thêm các polysacharide này dẫn đến giảm một cách đột ngột cân bằng hấp thụ đường Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống fucoidan làm chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức đường máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức [35]

 Bảo vệ dạ dày

Theo một số nghiên cứu của người Nhật ở Tokyo, việc bổ sung fucoidan thích hợp có tác dụng cải thiện hoạt động của đường dẫn dạ dày-ruột non Hơn nữa các nhà khoa học mới đây đã công bố rằng fucoidan ngăn chặn sự gắn của

Helicobacteria pylori (một loại vi khuẩn gây loét dạ dày) lên tế bào tạo thành lớp

lót dạ dày Họ đã phỏng đoán rằng hợp chất fucoidan này có thể bao phủ bề mặt vi khuẩn làm cho chúng khó bám vào các tế bào dạ dày [35]

sự có mặt của fucoidan đã góp phần cho việc sản xuất bình thường chất này, việc bổ sung fucoidan có thể có tác dụng hữu ích trong việc tái tạo sụn cho các khớp đau [47]

 Trị bệnh gan

Fucoidan làm tăng đáng kể việc sản xuất HGF là một cytokin rất đặc biệt, nó không chỉ kích thích việc tái tạo tế bào gan mà đồng thời còn tăng cường việc sản xuất các tế bào da, tế bào cơ tim, sụn [28]

Đến nay sản phẩm fucoidan đã có mặt trên thế giới và được dùng làm thuốc

hỗ trợ sức khoẻ và điều trị nhiều loại bệnh Ở nước ta chưa có sản phẩm fucoidan trên thị trường Do vậy việc nghiên cứu fucoidan trong rong nâu Việt Nam là việc làm rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn cao

1.3.3 Ứng dụng của fucoidan và oligosacharit của nó 1.3.3.1 Một số ứng dụng của Fucoidan tự nhiên [35]

Bảng 1.1: Một số ứng dụng của Fucoidan chiết từ rong nâu.

chuột

1.3.3.2 Một số ứng dụng của oligosaccharit từ một fucoidan

Bảng1.2: Ứng dụng của ologosacarit từ fucoidan

Ascophyllum nodosum (Quá trình

depolymer hóa các gốc tự do)

Ngăn cản sự phát triển quá mức của

tế bào thần kinh

Pelvetia canaliculata (được phân cắt bởi

enzym endo-fucanase được điều chế từ vi

khuẩn biển (Flavobacteriaceae)

Hệ thống kháng lại vi rút khảm

thuốc lá

1.3.3.3 Một số sản phẩm Fucoidan trên thế giới

Cùng với việc các nhà khoa học đồng loạt tập trung vào nghiên cứu Fucoidan trong khoảng mười năm gần đây, nhiều hoạt tính sinh học quí của chúng đã được phát hiện Từ đó, thực phẩm chức năng có bổ sung fucoidan xuất hiện ngày càng tăng Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại fucoidan nhãn hiệu khác nhau với các tác dụng giới thiệu trên bao bì sản phẩm bao gồm: Điều trị các bệnh ung thư: bọng đái xương, vú, cổ, ruột kết, buồng trứng, tuỵ, dạ dày, da…, các bệnh khác như: dị ứng, chống lão hoá, suyễn, đái đường, giảm cholesterol, cao huyết áp, loét dạ dày… như

LCR Fucoidan của LARSON CENTURY RANCH, INC, trị tim mạch, chống lão hoá, tăng cường miễn dịch, giảm cân…như Fucoidan Tongan Limu Moui của AHD INTERNATIONAL, LLC COMPANY, gây tự chết cho tế bào ung thư như Arabino Fucoidan của PHARMACEUTICAL GRADE NUTRITIONAL & DIETARY

ANTI-AGING SUPPLEMENTS Được sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung

thư, sản phẩm thuốc kháng virus, điều trị ung thư, tim mạch như Fucoidan của

QINGDAO YIJIA HUAYI IMPORT AND EXPORT CO.,LTD