Nghiên cứu vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô phân lập từ giếng khoan dầu khí vũng tàu

Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của hỗn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt Các mẫu vi khuẩn khử sunphat từ bộ sưu tập vi khuẩn khử sunphat lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu được

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Văn Duy, Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang và TS Nguyễn Thị Thu Huyền, Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lại Thúy Hiền cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới Phòng Kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch

tễ đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp vừa qua

Cuối cùng tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua

Nha Trang, tháng 6 năm 2010

Sinh viên

Nguyễn Hoài Thu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Thành phần, tính chất của dầu thô Việt Nam - Vũng Tàu 3

1.1.1 Thành phần nguyên tố của dầu thô 3

1.1.2 Tính chất vật lý của dầu thô 4

1.1.3 Thành phần hóa học của dầu thô 4

1.2 Khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí 6

1.3 Vi khuẩn khử sunphat 8

1.3 1 Môi trường sống 8

1.3.2 Phân loại vi khuẩn khử sunphat 9

1.3.3 Quá trình trao đổi chất và năng lượng 11

1.3.4 Khả năng sử dụng dầu thô là nguồn cơ chất 14

1.3.5 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của vi khuẩn khử sunphat 16

1.4 Vai trò của vi khuẩn khử sunphat trong thực tiễn cuộc sống 18

1.4.1 Ảnh hưởng đến sinh thái và môi trường 18

1.4.2 Ảnh hưởng đến kinh tế và con người 19

Chương 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1 2 Môi trường nuôi cấy 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 23

2.2.2 Đánh giá hàm lượng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ưa

nhiệt 24

2.2.3 Phân lập đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô 24

2.2.4 Nghiên cứu hình thái tế bào, nhuộm Gram và khả năng hình thành bào tử của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 25

2.2.5 Nghiên cứu khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 26

2.2.6 Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 26

2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 27

2.2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 27

2.2.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô 28

Chương 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu 29

3.2 Đánh giá hàm lượng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 31

3.3 Đặc điểm hình thái của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô 32

3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 33

3.3.2 Đặc điểm nhuộm Gram 34

3.3.3 Khả năng tạo bào tử 34

3.3.4 Đặc điểm hình thái tế bào 35

3.4 Khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 39

3.5 Khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 40

3.6 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng

vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 44

3.7 Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng của đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 48

3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 52

3.9 Đặc điểm phân loại 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Các cơ chất vi khuẩn khử sunphat sử dụng trong quá trình sinh trưởng 13

Bảng 3.1 Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt phân lập

từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu 29 Bảng 3.2 Hàm lượng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 32

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat

ưa nhiệt 33 Bảng 3.4 Kết quả nhuộm Gram của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 34

Bảng 3.5 Khả năng chuyển hóa cơ chất lactat và axetat của đơn chủng vi khuẩn

khử sunphat ưa nhiệt 40

Bảng 3.6 Hàm lượng H2S tạo thành các của đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa

nhiệt trên môi trường có hàm lượng dầu thô khác nhau 41

Bảng 3.7 Hàm lượng H2S tạo thành của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa

nhiệt trên môi trường có nồng độ muối khác nhau 45

Bảng 3.8 Hàm lượng H2S tạo thành của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa

nhiệt trên môi trường tại các pH khác nhau 49

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn

khử sunphat ưa nhiệt 52

Bảng 3.10 Đặc điểm phân loại của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt

có khả năng sử dụng dầu thô 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Ảnh đơn chủng 110G6_KL2 sinh trưởng trở lại trong môi trường dầu

thô sau khi sốc nhiệt 35

Hình 3.2 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 70G3_KL1 được

quan sát dưới kính hiển vi điện tử 36 Hình 3.3 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 110G6_KL2 được

quan sát dưới kính hiển vi điện tử 36

Hình 3.4 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt ĐHG7 được quan

sát dưới kính hiển vi điện tử 37 Hình 3.5 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt 802G8_KL1 được

quan sát dưới kính hiển vi điện tử 37

Hình 3.6 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt Đ914_KL2 được

quan sát dưới kính hiển vi điện tử 38

Hình 3.7 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt Đ1008G10_KL1

được quan sát dưới kính hiển vi điện tử 38

Hình 3.8 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng 70G3_KL1 trên môi trường có

hàm lượng dầu thô khác nhau 42

Hình 3.9 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng 110G6_KL2 trên môi trường có

hàm lượng dầu thô khác nhau 42

Hình 3.10 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng ĐHG7 trên môi trường có hàm

lượng dầu thô khác nhau 43

Hình 3.11 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng Đ914_KL2 trên môi trường có

hàm lượng dầu thô khác nhau 43

Hình 3.12 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng 70G3_KL1 ở 55oC trên môi

trường dầu thô 5% với các nồng độ NaCl khác nhau 46

Hình 3.13 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng 110G6_KL2 ở 55o

C trên môi

trường dầu thô 0,5% với các nồng độ NaCl khác nhau 46

Hình 3.14 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng ĐHG7 ở 55oC trên môi trường

dầu thô 0,5% với các nồng độ NaCl khác nhau 47

trường dầu thô 5%, NaCl 1% với các pH môi trường khác nhau 50

Hình 3.17 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng 110G6_KL2 ở 55 oC trên môi

trường dầu thô 0,5%, NaCl 3% với các pH môi trường khác nhau 50

Hình 3.18 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng ĐHG7 ở 55oC trên môi trường

dầu thô 0,5%, NaCl 1% với các pH môi trường khác nhau 51

Hình 3.19 Hàm lượng H2S tạo thành của chủng Đ914_KL2 ở 55o

C trên môi

trường dầu thô 0,5%, NaCl 1% với các pH môi trường khác nhau 51

MỞ ĐẦU

Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn rất đa dạng có khả năng sử dụng sunphat làm chất nhận điện tử cuối cùng Chúng là những vi khuẩn kị khí bắt buộc phân bố khá rộng trên Trái đất Chúng có trong đất, trong các vùng trầm tích, bùn lắng

ở các đáy ao tù, cống rãnh, sông hồ, biển, trong các vùng có điều kiện sống khắc nghiệt như áp suất cao, nhiệt độ cao, độ mặn cao, hay môi trường quá kiềm, quá axit…

và đặc biệt tồn tại với một số lượng lớn trong các mỏ dầu Sự đa dạng cao của vi khuẩn khử sunphat được tìm thấy ở các trầm tích biển, nơi có nồng độ sunphat cao

(28mM) [Cord-Ruwisch và cs, 1987]

Người ta biết đến loại vi khuẩn này sau khi Bejierink phân lập đầu tiên năm

1895 Từ đó đến nay vi khuẩn khử sunphat được các nhà khoa học thế giới đặc biệt quan tâm vì vai trò quan trọng của chúng trong chu trình địa hóa của carbon, lưu huỳnh và quá trình hình thành dầu mỏ, cũng như những ứng dụng của nó trong việc loại bỏ kim loại nặng Tuy nhiên, vi khuẩn khử sunphat cũng gây ra những rắc rối không nhỏ cho ngành công nghiệp và nông nghiệp, đặc biêt là ngành công nghiệp dầu khí Kể từ khi bắt đầu sản xuất thương mại dầu khí khoảng 140 năm trước, các kỹ sư dầu khí và các nhà khoa học đã nhanh chóng nhận ra vi khuẩn khử sunphat là tác nhân sản sinh khí H2S trong các giếng khoan, là nguyên nhân hàng đầu làm giảm giá trị thương mại của dầu thô Sự có mặt của H2S không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe công nhân tại các giàn khoan, gây ăn mòn kim loại trong điều kiện kị khí mà còn làm giảm hiệu quả tách nước khỏi dầu, đồng thời gây nên mùi hôi khó chịu làm giảm chất lượng các sản phầm dầu mỏ Hơn nữa, cặn FeS sinh ra khi khí H2S kết hợp với ion sắt có trong các thiết bị khai thác, vận chuyển và lưu trữ các sản phẩm dầu mỏ sẽ gây tắc các thiết bị khoan và bơm ép nước [Gibson, 1990; Lại Thúy Hiền và Lê Phi Nga, 1992;

Rabus và cs, 1996; Lại Thúy Hiền và cs, 2003] Với những thiệt hại to lớn mà chúng

gây ra cho ngành công nghiệp dầu khí, vi khuẩn khử sunphat luôn là đối tượng nghiên cứu hàng đầu của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật dầu mỏ

Ở nước ta, những nghiên cứu về vi sinh vật dầu mỏ, đặc biệt là vi khuẩn khử sunphat luôn được quan tâm nghiên cứu song song với những bước phát triển của

ngành công nghiệp dầu khí nước nhà Các nghiên cứu khu hệ vi sinh vật nói chung và

vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt nói riêng ở các giếng khoan dầu khí đã đạt được những

thành tựu nhất định [Lại Thúy Hiền và Đặng Phương Nga, 1998; Lại Thúy Hiền và cs,

1991; 2003] Tuy nhiên, khoảng 15 năm trở lại đây, các nhà khoa học trên thế giới lần lượt chứng minh khả năng sử dụng dầu thô trong điều kiện kị khí của vi khuẩn khử sunphat, hơn thế nữa, điều này lại rất phổ biến trong giếng khoan trên thế giới

[Aeckersberg và cs, 1991; Rueter và cs, 1994; So và Young, 1999; Harms và cs, 1999; Ehrenreich và cs, 2000; Kniemeyer và cs, 2003; Rios-Hernandez và cs, 2003; Cravo- Laureau và cs, 2004; Nakagawa và cs, 2008] Như vậy, một lần nữa cho thấy tiềm ẩn

mối nguy mà nhóm vi khuẩn này gây ra cho ngành công nghiệp dầu khí Tại Việt Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật sử dụng hydrocarbon dầu mỏ mới chỉ tiến hành

trên các đối tượng vi sinh vật hiếu khí [Lại Thúy Hiền và cs, 1996; 1997; 1999] Do

đó, một câu hỏi đặt ra là các vi khuẩn khử sunphat trong các giếng khoan dầu khí Việt Nam cũng có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất cho sự phát triển hay

không? Vì vậy, chúng tôi đã đề xuất và tiến hành đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu” Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô

của vi khuẩn khử sunphat Hi vọng đề tài sẽ góp phần giải quyết khó khăn do vi khuẩn khử sunsphat gây ra cho nền công nghiệp dầu khí nước nhà

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thành phần, tính chất của dầu thô Việt Nam - Vũng Tàu

Dầu thô là một hỗn hợp phức tạp, trong đó có hàng trăm các cấu tử khác nhau Mỗi loại dầu được đặc trưng bởi thành phần riêng, song về bản chất, chúng đều có các hydrocarbon là thành phần chính (chiếm 60 - 90% trọng lượng dầu), còn lại là các hợp chất không hydrocarbon như: hợp chất chứa oxy (axit, keton, rượu), hợp chất chứa nitơ (furol, indol, carbazol), hợp chất chứa lưu huỳnh, hợp chất cao phân tử (hắc ín, bitum) và các nguyên tố vi lượng Dầu thô lấy từ những vùng dầu khác nhau có thành phần hóa học khác nhau Khi khảo sát thành phần của nhiều loại dầu mỏ, người ta thấy không có loại dầu nào giống loại dầu nào, có bao nhiêu mỏ dầu thì có bấy nhiêu loại dầu mỏ Ngay trong một giếng khoan, dầu lấy từ những tầng chứa khác nhau cũng khác nhau [Đinh Thị Ngọ, 2001]

1.1.1 Thành phần nguyên tố của dầu thô

Các nguyên tố chính tạo nên dầu mỏ là carbon và hydro Hàm lượng carbon và hydro trong dầu mỏ rất khác nhau, hàm lượng carbon có từ 83,5 - 87%, hàm lượng hydro có từ 11,5 - 14 Hàm lượng nitơ trong dầu mỏ thấp, từ 0,001 - 0,3% hàm lượng oxy từ 0,1 - 0,3% Hàm lượng lưu huỳnh thay đổi trong khoảng rộng Ngoài ra trong dầu mỏ còn chứa một số kim loại nặng, hàm lượng rất nhỏ như: vanadi, niken, sắt, magie, crom…[Đinh Thị Ngọ, 2001]

Dầu thô Việt Nam thuộc loại dầu Parafinic có đặc điểm: nhẹ, sạch, chứa rất ít các độc tố, rất ít lưu huỳnh, nitơ, kim loại nặng và là loại dầu chứa nhiều hydrocarbon

parafin, đặc biệt chứa nhiều hydrocarbon n- parafin C10 - C40 Theo tiêu chuẩn phân

loại của Liên Xô cũ thì dầu thô mỏ Bạch Hổ và mỏ Đại Hùng xếp loại 1/3, còn theo tiêu chuẩn xếp loại của Viện khoáng sản Mỹ thì dầu thô mỏ Bạch Hổ xếp loại 2/9 và dầu thô mỏ Đại Hùng xếp loại 5/9 [ Đinh Thị Ngọ, 2001]

1.1.2 Tính chất vật lý của dầu thô

Dầu mỏ là chất lỏng sánh, thường có mùi đặc trưng, nhẹ hơn nước và không hòa tan trong nước Dầu thô Việt Nam sánh đặc, có màu nâu đen là do có chứa nhiều parafin, tỷ trọng khoảng từ 0,8 - 1% Dầu mỏ chứa nhiều parafin có nhiệt độ nóng chảy cao, có thể đông đặc ở nhiệt độ thường (dầu thô mỏ Bạch Hổ đông đặc ở 33oC, dầu thô mỏ Đại Hùng đông đặc ở 27oC) [ Đinh Thị Ngọ, 2001]

1.1.3 Thành phần hóa học của dầu thô

• Các hợp chất hydrocarbon của dầu thô

Hydrocarbon là thành phần chính và quan trọng nhất của dầu thô Theo tài liệu của Viện hóa dầu Liên bang Nga (1986) thành phần cơ bản của hydrocarbon trong dầu thô gồm có:

- Hydrocarbon mạch thẳng (30 - 35%) gồm n-parafin và iso-parafin, là những alkane mạch thẳng Công thức tổng quát CnH2n+2

- Hydrocarbon mạch vòng (25 - 75%) Công thức tổng quát CnH2(n-m+1).

- Hydrocarbon thơm (10 - 20%), còn gọi là aren hay aromatic

- Ngoài ra còn có một số loại hỗn hợp naphten – thơm

Số nguyên tử carbon trong các loại hydrocarbon trong dầu thô thường từ C5 -

C60, tương ứng với phân tử lượng từ 850 - 880 Bằng các phương pháp hóa lý người ta

đã xác định được hơn 400 loại hydrocarbon khác nhau

Các hydrocarbon có khối lượng phân tử thấp đến trung bình là các chất dễ bị phân hủy sinh học, các hợp chất phân nhánh và nhiều vòng khó bị phân hủy hơn so với các phân tử chuỗi thẳng và phân tử chỉ có một nhân thơm đơn giản Khi độ dài tăng và khối lượng phân tử đạt đến 500 thì chúng không còn là nguồn carbon cho vi sinh vật được nữa Khả năng sử dụng hydrocarbon dầu mỏ có thể sắp xếp theo thứ tự giảm dần sau: n-alkane > alkane mạch thẳng phân nhánh > alkene phân nhánh > n- alkyl chứa vòng thơm trọng lượng phân tử thấp > hợp chất một vòng thơm > alkane vòng > hợp chất đa nhân > asphanten [Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007]

Các alkane mạch ngắn là chất độc đối với nhiều loại vi sinh vật, các alkane có

độ dài trung bình (C10 - C24) dễ được vi sinh vật sử dụng nhất Các alkane có mạch càng dài thì khả năng vi sinh vật sử dụng càng khó Các hydrocarbon n-parafin C10 -

C40 được gọi chung là parafin, có rất nhiều trong dầu thô Việt Nam Về phương diện kinh tế, dầu thô nhiều parafin là nhược điểm chính ảnh hưởng đến giá cả do độ linh động thấp, gây khó khăn khi vận chuyển, chế biến Tuy nhiên, về mặt phân hủy sinh học, parafin lại là cơ chất thích hợp cho vi sinh vật sử dụng [Đinh Thị Ngọ, 2001] Vì vậy, ta có cơ sở để nghĩ rằng, vi khuẩn khử sunphat phân lập từ các giếng khoan dầu khí Vũng Tàu cũng có khả năng sử dụng và chuyển hóa được hydrocarbon dầu mỏ

• Các hợp chất không hydrocarbon của dầu thô

Đây là những hợp chất mà trong thành phần của chúng có chứa oxy, nitơ, lưu huỳnh, tức là hợp chất hữu cơ của oxy, nitơ, lưu huỳnh Tuy nhiên thành phần nguyên

tố của oxy, nitơ, lưu huỳnh trong dầu rất thấp, nhưng vì những nguyên tố này nằm trong một kết hợp phân tử của hydrocarbon nên trọng lượng phân tử của chúng cũng tương đương với trọng lượng phân tử của hydrocarbon mà chúng đi theo [Đinh Thị Ngọ, 2001]

• Các chất nhựa, asphanten của dầu thô

Các chất nhựa, asphanten của dầu thô là những chất mà trong cấu trúc phân tử của nó ngoài carbon và hydro còn chứa đồng thời cả oxy, nitơ, lưu huỳnh Về cơ bản chúng bao gồm nhiều vòng thơm ngưng tụ lại, nối với nhau bằng các cầu nối là các mạch parafin chứa các nguyên tố kim loại Đây là những hợp chất có phân tử lượng rất lớn, từ 500 - 600 trở lên Chính vì vậy, các chất nhựa và asphanten chỉ thấy ở các phân đoạn nặng và cặn của dầu thô

Hàm lượng nhựa, asphanten có thể lên tới hàng chục phần trăm trong dầu mỏ Đối với dầu thô Bạch Hổ, hàm lượng các chất nhựa và asphanten rất thấp, chỉ có 1,97% nhựa, 0,77% asphanten; dầu thô Đại Hùng chỉ số cao hơn, hàm lượng chất nhựa

là 7,55% và hàm lượng asphanten là 2,5% Tuy nhiên cả hai loại dầu thô này đều thuộc loại dầu thô chứa ít chất nhựa và asphanten [Trần Mạnh Trí, 1996]

1.2 Khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí

Khi nghiên cứu vi sinh vật dầu mỏ, các nhà khoa học trên thế giới đã dành mối quan tâm rất lớn cho việc nghiên cứu khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí

Hai nhà khoa học Nga (Kuznhexov và Ivanov) đã tổng kết những nhóm vi sinh vật có mặt ở các mỏ dầu Liên Xô cũ thành 2 nhóm: nhóm vi khuẩn hiếu khí gồm vi

khuẩn oxy hóa hydrocarbon, vi khuẩn Thiobacillus, vi khuẩn hoại sinh; nhóm vi khuẩn

kị khí gồm vi khuẩn khử sunphat, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn phân hủy xenluloza, vi khuẩn sinh metan và vi khuẩn tía Ở vùng dầu Tersko-Dagestan, số lượng vi khuẩn ở nước vỉa có dầu (115.103 - 495.103 tế bào/ml) cao hơn hẳn vỉa không có dầu (8.103 - 5.104 tế bào/ml) Ở vùng có nước, có sự tương tác với dầu, số lượng vi khuẩn nhiều và

đa dạng hơn vùng không có nước và nước không có dầu [Kuznhexov và Ivanov, 1963]

Ở Đức, Heyer và Schwartz đã phân lập hàng loạt vi khuẩn từ các kho chứa dầu

tự nhiên dưới lòng đất Khu hệ vi sinh vật dầu mỏ ở Đức gồm Pseudomonas, vi khuẩn khử sunphat, Mycobacterium và Nocardia Theo Cord-Ruwisch, Kleinitz và Widdel (1987), số lượng vi khuẩn khử sunphat thuộc chi Desulfovibrio, Desulfobacter trong

các giếng khoan dầu khí Tây Đức lên đến 105 - 106 tế bào/ml [Cord-Ruwisch và cs,

1987]

Khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí được nghiên cứu nhiều ở Trung Quốc từ 60 năm nay Năm 1894, Wang công bố khu hệ vi sinh vật ở mỏ dầu Laojunmiao (20 - 36oC) gồm có vi khuẩn hoại sinh, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn sử dụng hydrocarbon và vi khuẩn khử sunphat (số lượng vi khuẩn khử sunphat lên tới 105

- 106 tế bào/ml) Các nhóm vi khuẩn hoạt động mạnh nhất ở vùng có sự kết hợp giữa

vi khuẩn khử sunphat và vi khuẩn oxy hóa hydrocarbon [Wang, 1984]

Tại Việt Nam, Lại Thúy Hiền và cộng sự (2005) đã có một số công trình nghiên cứu về khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí Vũng Tàu và Thái Bình Khu

hệ vi sinh vật ở đây rất phong phú bao gồm các chi: Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Chromohalobacter, Nocardia, Diplococus, Micrococcus, Rhodococcus,

Lactobacillus, Thiobacillus, Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter và Desulfococcus Ngoài ra còn có các vi khuẩn tạo khí metan, khử

nitrat, nấm mốc và một số vi khuẩn chưa được định tên Trong số các chi đã được phân loại có một số loài chưa từng được công bố ở các giếng khoan trên thế giới như

Desulfovibrio vietnamesis, Pseudonocardia alni và Chromohalobacter marismortui

Khi phân tích thành phần vi sinh vật trong các mẫu nước có nguồn gốc khác nhau từ mỏ Bạch Hổ đã cho thấy ở các giếng khoan bơm ép nước thường có số lượng

vi sinh vật cao hơn hẳn các giếng khoan khai thác [Lại Thúy Hiền và cs, 2005] Điều

này được giải thích rằng khi chưa bơm ép nước vào vỉa, bản thân ở các vỉa dầu đã tồn tại một số loại vi khuẩn như vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt, không ưa mặn, vi khuẩn

sử dụng hydrocarbon Trong quá trình khoan khai thác, việc đưa dung dịch khoan đã kéo theo nhiều loại hóa chất, tinh bột, polysacarit, axit xitric… xuống giếng khoan Cùng với việc bơm ép nước để duy trì áp suất vỉa đã tăng thêm nguồn dinh dưỡng và muối khoáng cho vi sinh vật phát triển, dẫn đến việc xuất hiện thêm nhiều loại vi

khuẩn khác như vi khuẩn tạo nhớt, Clostridium, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn lên men

kị khí, vi khuẩn vi hiếu khí… [Lại Thúy Hiền, 1997]

Trong quá trình khai thác dầu mỏ, các kỹ sư dầu khí đã phải đối mặt với các vấn đề do vi sinh vật gây ra Đặc biệt vi khuẩn khử sunphat là tác nhân chính gây ảnh hưởng xấu đến ngành công nghiệp này Do đó, vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi sinh vật được nghiên cứu phổ biến nhất trong khu hệ vi sinh vật giếng khoan Việc bơm ép nước biển vào giếng để tăng cường hiệu suất thu hồi dầu không chỉ làm phong phú thêm khu hệ vi sinh vật trong giếng khoan dầu khí mà còn làm biến đổi thành phần vi khuẩn khử sunphat có trong giếng khoan, làm tăng thêm tính đa dạng của loài này Lysnes và cộng sự trong một nghiên cứu gần đây đã chứng minh được sự thay đổi thành phần vi khuẩn khử sunphat thay trước và sau khi bơm ép tại một giếng dầu ở biển Bắc Lysnes đã giải thích rằng nước vỉa có chứa hàm lượng cao axit béo dễ bay hơi, dẫn đến làm tăng số lượng vi khuẩn oxy hóa acid béo Nếu sunphat có trong nước bơm ép thì cùng với việc tăng nhiệt độ trong giếng khoan, các axit béo này sẽ làm tăng

số lượng vi khuẩn ưa nhiệt trong giếng khoan [Lysnes và cs, 2009]

1.3 Vi khuẩn khử sunphat

1.3 1 Môi trường sống

Từ khi được Bejierinck phân lập đầu tiên vào năm 1895 từ ống dẫn nước cho đến những nghiên cứu sau này về vi khuẩn khử sunphat đã cho thấy vi khuẩn này có môi trường sống rất đa dạng Chúng là những vi khuẩn kị khí bắt buộc phân bố khá rộng trên Trái đất Mỗi môi trường sống khác nhau được đặc trưng bởi mỗi chi vi khuẩn khử sunphat khác nhau Nhóm vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt thường được tìm thấy ở các hệ sinh thái nóng như suối nước nóng, mạch nước ngầm sâu dưới lòng đất,

các giếng dầu… Sự đa dạng cao của vi khuẩn khử sunphat được tìm thấy ở các trầm tích biển, nơi có nồng độ sunphat cao (28mM) [Cord-Ruwisch và cs, 1987]

Trong những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn khử sunphat, người ta

đã nghĩ rằng vi khuẩn này là vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt Tuy nhiên, khoảng 20 năm trở lại đây quan điểm này đã thay đổi Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng vi khuẩn khử sunphat có khả năng chống chọi được với oxy Theo báo cáo của Cypionka (2000), vi khuẩn khử sunphat không chỉ sống được trong môi trường có oxy nhiều giờ mà thậm chí nhiều ngày và nhiều loài thậm chí có thể khử được oxy thành nước Quá trình này

có thể thực sự là quá trình hô hấp khi kết hợp với quá trình chuyển hóa năng lượng Người ta đã phát hiện thấy một số lượng lớn vi khuẩn khử sunphat trong các vùng hiếu khí và vùng ranh giới giữa hiếu khí và kị khí của các trầm tích Hầu hết các loài vi khuẩn khử sunphat phân lập được từ những vị trí hiếu khí đều thuộc về hai chi

Desulfovibrio và Desulfomicrobium Theo Cord-Ruwisch và cộng sự, khả năng sống

trong môi trường có oxy của vi khuẩn khử sunphat có thể được giải thích như sau: Trước hết hô hấp của các vi khuẩn hiếu khí sẽ tiêu thụ oxy để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn khử sunphat Đồng thời, H2S do vi khuẩn khử sunphat tạo ra là một chất khử, nó sẽ tác dụng với oxy ở điều kiện thường làm giảm

nồng độ oxy ở khu vực đó [Cord-Ruwisch và cs, 1987] Mặc dù để có thể thích nghi

với môi trường, chúng có thể chống chọi với oxy Tuy nhiên, do vi khuẩn này thường

sử dụng các sản phẩm lên men được tạo thành trong điều kiện kị khí nên chúng không thể có những thuận lợi trong quá trình cạnh tranh với vi sinh vật khác phát triển trong

môi trường hiếu khí, do vậy, vi khuẩn khử sunphat vẫn là vi khuẩn kị khí [Cypionka, 2000]

Trong môi trường hiếu khí, vi sinh vật dị dưỡng có thể thực hiện quá trình chuyển hóa hoàn toàn hợp chất hữu cơ thành CO2 Tuy nhiên, trong hệ sinh thái kị khí thì sự chuyển hóa lại phức tạp hơn và đòi hỏi sự tương tác của một lượng lớn các nhóm vi khuẩn khác nhau [Vosjan, 1982] Mỗi nhóm vi khuẩn thực hiện một quá trình oxy hóa một phần hợp chất hữu cơ và sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của chúng lại được đồng hóa bởi các thành tiếp theo của chuỗi thức ăn cho đến khi kết thúc quá trình oxy hóa [Gibson, 1990] Vi khuẩn khử sunphat trong điều kiện kị khí thường được nghiên cứu đặt trong mối quan hệ với hai nhóm vi khuẩn kị khí khác là vi khuẩn sinh metan và vi khuẩn khử nitrat Các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã cho thấy có mối quan hệ hội sinh của vi khuẩn khử sunphat và vi khuẩn sinh metan, nhất

là trong điều kiện nước biển và nước vỉa dầu mỏ [Gibson, 1990; Lại Thúy Hiền, 1997]

Rõ ràng là vi khuẩn khử sunphat sống hội sinh với vi khuẩn sinh metan, khử không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành axetat và chính nguồn axetat này lại là cơ chất cho các vi khuẩn sinh metan và các vi khuẩn sử dụng axetat sinh trưởng phát triển [Gibson, 1990] Còn mối quan hệ của vi khuẩn khử sunphat và vi khuẩn khử nitrat

đang được các nhà nghiên cứu rất quan tâm vì có tính ứng dụng cao của nó [Voordouw và

cs, 1996; Lysnes và cs, 2009] Lysnes gần đây đã phát hiện ra chủng khử nitrat ưa nhiệt

phân lập từ giếng dầu vùng biển Bắc sử dụng cơ chất axit béo lại có khả năng sinh trưởng trên những nguồn cơ chất ưa thích của vi khuẩn khử sunphat Điều này đã tạo cơ sở mở ra hướng ứng dụng mới: sử dụng nhóm vi khuẩn khử nitrat cho việc ức chế sự phát triển của

vi khuẩn khử sunphat trong các giếng khoan bằng phương pháp sinh học thay cho hóa học

như hiện nay [Lysnes và cs, 2009]

1.3.2 Phân loại vi khuẩn khử sunphat

Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn có sinh lý phức tạp nhưng có đặc điểm chung là sử dụng sunphat (SO42-) làm chất nhận điện tử cuối cùng Các loại vi khuẩn khử sunphat khác nhau thể hiện ở nhiều đặc điểm như hình thái tế bào, khả năng di động, khả năng hình thành bào tử, hàm lượng GC chứa trong ADN, desulfovibrin, hệ

thống cytochrome, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và khả năng trao đổi chất (oxy hóa hoàn toàn hay không hoàn toàn cơ chất) [Castrovà cs, 2000]

Nhóm vi khuẩn khử sunphat có hình dạng tế bào rất đa dạng tùy theo từng chi (với kích thước tế bào khoảng 0,3 - 1,5 µm x 0,8 - 10 µm): hình que như

Desulfobulbus, Desulfotomaculum, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfohabdus, Thermodesulfatator, hình dấu phẩy như Desulfovibiro, Thermodesulfovibrio, hình ovan như Desulfobacter, Desulfobacterium, hình cầu như Desulfococcus, hình túi Desulfosarcina, hình sợi như Desulfonema [Cord-Ruwisch và cs, 1987; Devereux và

cs, 1989; Castro và cs, 2000]

Trong tự nhiên, vi khuẩn khử sunphat bơi tự nhiên hoặc bám vào giá thể nào

đó, nhất là các mẩu sắt, ống sắt Tùy loài mà chúng có thể đứng đơn độc hay kết đôi,

hoặc xếp chuỗi ngắn, cũng có khi chúng tập hợp lại thành một đám lộn xộn [Irene và

cs, 2006] Một số loài vi khuẩn khử sunphat chuyển động nhờ tiên mao hoặc một

chùm tiên mao, trong khi một số khác chỉ di động trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển, sau đó khả năng giảm dần và mất hẳn Một số khác lại không có khả năng

di chuyển [Mandigan và cs, 2009]

Cho đến thời điểm này, đã có rất nhiều loại vi khuẩn khử sunphat được phát hiện và phân loại Với sự phát triển của kỹ thuật phân tích trình tự gen 16S rARN kết hợp với các đặc điểm sinh lý trên đã xây dựng được cây phát sinh loài của vi khuẩn này Cây phát sinh loài cho thấy sự đa dạng rất cao số lượng loài của nhóm vi khuẩn khử sunphat Dựa trên trình tự phân tích rARN, vi khuẩn khử sunphat được chia thành bốn nhóm chính: vi khuẩn khử sunphat Gram âm ưa ấm; vi khuẩn khử sunphat Gram dương sinh bào tử; vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt và vi khuẩn khử sunphat cổ ưa nhiệt [Castrovà cs, 2000]

Nhóm vi khuẩn khử sunphat Gram âm ưa ấm gồm hai họ lớn là

Desulfovibrioaceae (gồm hai chi Desulfovibrio và Desulfomicrobium) và

Desulfobacteriaceae Họ Desulfobacteriaceae phong phú về số chi hơn với khoảng gần

10 chi như Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobotulus, Desulfobacterium, Desulfonema…Điều thú vị của họ Desulfobacteriaceae chính là khả năng hình thành

cụm vi khuẩn giúp chống lại những điều kiện bất lợi của môi trường như quan sát thấy

ở Desulfosarcina hay khả năng di động cho phép chúng di chuyển đến những vùng có

nhiều chất dinh dưỡng hơn[Castro và cs, 2000]

Ngược lại với nhóm vi khuẩn khử sunphat Gram âm ưa ấm, nhóm vi khuẩn khử sunphat Gram dương sinh bào tử có một số loài thích nghi được với môi trường sống

có sự thay đổi của nhiệt độ từ ấm lên cao do chúng có cơ chế hình thành bào Tuy vậy, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của nhóm vi khuẩn này là từ 25 - 40oC, một vài loài có thể là từ 40 - 65oC Đến nay chúng ta mới chỉ khám phá ra một chi Gram dương có khả

năng sinh bào tử duy nhất là chi Desulfotomaculum Với khả năng hình thành bào tử khi gặp điều kiện sống khắc nghiệt nên chi Desulfotomaculum thường được tìm thấy

trong các môi trường sống mà ở đó khó bắt gặp các chi vi khuẩn khử sunphat ưa ấm khác (như các cánh đồng lúa nước nơi có sự xen kẽ của điều kiện có oxy và thiếu oxy

do sự thay đổi mùa nước lên) [Castrovà cs, 2000]

Hai nhóm vi khuẩn khử sunphat còn lại là nhóm vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt

và nhóm vi khuẩn cổ ưa nhiệt (Archaea) đều được phân lập tại các môi trường có nhiệt

độ cao như các giếng khoan sâu dưới mặt đất có nhiệt độ lên tới 80o

C Các vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt chủ yếu là vi khuẩn Gram âm, thuộc các chi

Thermodesulfohabdus, Desulfacinium, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfatator

và Thermodesulfovibrio [Castro và cs, 2000; Muyzer và Stams, 2008] Mặc dù, nhóm

này có nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng ở 55 - 75oC nhưng chúng vẫn có thể sống ở

nhiệt độ thấp [Nilsen và cs, 1996] Các loài thuộc chi Archaeoglobus, Caldivirga và Thermocladium (đều được phân lập tại các hệ thống biển nóng) là những đại diện duy

nhất của vi khuẩn khử sunphat trong nhóm vi khuẩn cổ Archaea [Castro và cs, 2000;

Muyzer và Stams, 2008]

1.3.3 Quá trình trao đổi chất và năng lượng

Vi khuẩn khử sunphat thực hiện quá trình trao đổi chất và năng lượng của chúng trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt và có thế oxy hóa khử Eh < -150 mV Sự có mặt của oxy ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của chúng Nếu trong môi trường có oxy thì chỉ một số ít loài có thể tiếp tục sinh trưởng Trong điều kiện kị khí, dựa vào

quá trình trao đổi chất, vi khuẩn khử sunphat được chia thành hai nhóm chính Các loài thuộc nhóm thứ nhất tiến hành oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ với

axetat là sản phẩm cuối cùng Đại diện của nhóm này có thể kể đến chi Desulfovibrio, Desulfobulbus, Archaeoglobus… Các loài thuộc nhóm thứ hai oxy hóa hoàn toàn chất

hữu cơ kể cả axetat thành CO2 như Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfonema, Thermodesulfobacterium… [Castro và cs, 2000; Magot và cs, 2000] Hầu hết các loài

thuộc nhóm thứ nhất sinh trưởng nhanh hơn nhóm hai, trong khi các loài thuộc nhóm hai còn có thể hợp tác với các loài thuộc nhóm 1 bằng cách sử dụng axetat do các loài

thuộc nhóm một thải ra trong quá trình trao đổi chất [Cord-Ruwisch và cs, 1987]

Vi khuẩn khử sunphat có thể sử dụng được nhiều loại cơ chất khác nhau (bảng

1.1) [Cord-Ruwisch và cs, 1987; Devereux và cs, 1989; Aeckersberg và cs, 1991; Rabus và cs, 1993; Hansen, 1994; Rueter và cs, 1994; Uberio và Bhattacharya, 1997; Muller và cs, 1999; Reichenbecher và cs, 2000; Labes và Schonheit, 2001; Pas và cs, 2001; Rios-Hernandez và cs, 2003; Aitken và cs, 2004; Cravo-Laureau và cs, 2004; Ommedal và Torsvik, 2007; Ahn và cs, 2009] Một số chất này được nhiều chủng sử

dụng trong khi một số chất khác lại chỉ có thể là nguồn năng lượng cho duy nhất một

chủng Chi Desulfovibrio và các chi khác thuộc nhóm vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt

Gram âm như đã nói ở mục (1.3.2) là những loài hẹp về cơ chất (chỉ gồm hydro, lactat,

pyruvat), trái lại, chi Desulfotomaculum lại được biết đến là chi có khả năng sử dụng

nguồn cơ chất rất linh động Nó sử dụng rất nhiều chất làm chất cho điện tử cho quá

trình sinh trưởng và phát triển của mình [Castro và cs, 2000]

Bảng 1.1 Các cơ chất vi khuẩn khử sunphat sử dụng trong quá trình sinh trưởng

Axit monocarboxylic Focmat; axetat; propionat; butyrat; isobutyrat;

2-metylbutyrat; 3-2-metylbutyrat; 3-metylvalerat;

pyruvat; lactat Axit dicacboxylic Succinat; fumarat; malat; oxalat; malenat; glutarat Rượu Metanol; etanol; propanol; butanol; pentanol;

isobutanol; etylen glycol (mono-, di-, và tetra); propandiol; 1,3-propandiol; glyxerol

1,2-Axit amin Glyxin; serin; alanin; cystein; cystin; treonin, valin;

leuxin; isoleuxin; aspartat; glutamat; phenyl alanin Cacbonhydrat Fructoz; glucoz; mannoz; xyloza; rhamnoz; tinh bột Hydrocacbon Hexadecan, hexadecanoat, benzoat; 2-, 3-, và 4-

hydroxybenzoat; phenol; p-cresol; catechol;

resorcinol; hydroquinon; phlorglucinol; pyrogallol; axit nicotinic; indol; quiolin; phenylacet;

naphthalen, 2-methylnaphthalen; tetralin; xylen;

toluene; ethylbenzen; ethylcyclopentan Các hợp chất khác Cholin; betain; oxamat; axeton; cyclohexanol; và

một số các hợp chất vòng no khác

Như vậy ta có thể thấy vi khuẩn khử sunphat sử dụng các loại cơ chất khác nhau từ những hợp chất hữu cơ đơn giản như hydro, lactat… cho đến những hợp chất phức tạp hơn như các hydratcarbon, hydrocarbon Đặc biệt là trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu ngày càng phát hiện ra nhiều hợp chất hydrocarbon dầu mỏ

mà vi khuẩn khử sunphat có thể làm nguồn cơ chất [Aeckersberg và cs, 1991; Rabus

và cs, 1993; Rueter và cs, 1994; Reichenbecher và cs, 2000; Rios-Hernandez và cs, 2003; Aitken và cs, 2004; Cravo-Laureau và cs, 2004; Ommedal và Torsvik, 2007]

1.3.4 Khả năng sử dụng dầu thô là nguồn cơ chất

Như đã nói ở phần (1.1), hydrocarbon là thành phần chính của dầu mỏ và được

sử dụng rộng rãi như là một nguồn nhiên liệu và hóa chất Tuy nhiên, trước khi dầu mỏ được con người khai thác từ lòng đất hay từ sâu dưới đại dương để đưa vào sử dụng trong công nghiệp thì đã có sự tích lũy các hydrocarbon này trong môi trường sống do quá trình rò rỉ tự nhiên Do đó, có khả năng các hydrocarbon đã được phân bố mọi nơi trên Trái đất trong suốt quá trình lịch sử Điều này có thể giải thích được tại sao có rất nhiều loài vi sinh vật đã tiến hóa khả năng chuyển hóa để sử dụng các hợp chất này là nguồn carbon trong quá trình sinh tổng hợp tế bào hay là chất cho điện tử trong các quá trình oxy hóa khử [Spormann và Widdel, 2000]

Nếu như các nghiên cứu về vi sinh vật hiếu khí có khả năng sử dụng hydrocarbon là nguồn cơ chất được bắt đầu từ hơn một thế kỉ qua thì vi sinh vật kị khí (đặc biệt là vi khuẩn khử sunphat) có khả năng sử dụng hydrocarcon lại mới chỉ thật

sự được quan tâm nghiên cứu khoảng 20 năm trở lại đây Các loại hydrocarbon khác nhau lại có khả năng là nguồn cơ chất cho một hoặc nhiều loài vi khuẩn khử sunphat khác nhau Công trình then chốt của Aeckersberg và cộng sự (1991) đã chứng minh có

sự phân hủy alkane trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt của một chủng vi khuẩn khử sunphat Sau đó, Rueter và cộng sự (1994) cũng đã phân lập được một loại vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt từ trầm tích giếng dầu vịnh Mexico cũng có khả năng sử dụng

alkane Cùng với một loạt các nghiên cứu sau này [So và Young, 1999; Ehrenreich và

cs, 2000; Cravo-Laureau và cs, 2004] đều đã chứng minh vi khuẩn khử sunphat sử

dụng alkane là nguồn cơ chất và chuyển hóa hoàn toàn thành CO2 và nước Những nghiên cứu này cũng chỉ ra vi khuẩn khử sunphat sử dụng alkane đều thuộc nhóm

Deltaproteobacteria có tế bào hình que hay hình ovan [Irea và cs, 2006]

Không chỉ có alkane của dầu thô mới được nhóm vi khuẩn khử sunphat sử dụng, mà một thành phần quan trọng trong dầu thô là các hydrocarbon vòng thơm

cũng là một nguồn chất cho điện tử của nhóm vi khuẩn này Các ankylhydrocarbon

một vòng thơm như benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (o- , m- , p- xylen) gọi chung là

hợp chất BTEX là những chất độc đối với vi sinh vật cũng có khả năng được phân hủy

bởi vi khuẩn khử sunphat [Beller và cs, 1992; Rabus và cs, 1993; Harms và cs, 1999; Kniemeyer và cs, 2003; Nakagawa và cs, 2008] Những nghiên cứu này đã kết luận

rằng: (1) Tất cả các chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng các hợp chất thơm đều thuộc về họ Desulfobacteriaceae; (2) Hầu hết chúng oxy hoàn toàn các hợp chất này thành CO2 và nước; (3) Chi Desulfovibiro không có khả năng sử dụng

hydrocarbon thơm của dầu thô, chỉ có các alkane mạch thẳng (parafin) mới là nguồn

cơ chất cho nhóm này Gần đây, các nhà khoa học tiếp tục khám phá thêm khả năng phân hủy hợp chất hydrocarbon thơm vòng đôi naphthalen và 2-methylnaphthalen trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt ở chủng vi khuẩn khử sunphat NapHS2 biển phân

lập từ trầm tích vùng biển Địa Trung Hải [Musat và cs, 2009]

Các hydrocarbon mạch vòng (alicyclic hydrocarbon) chiếm 12% trong thành phần dầu thô cũng được nghiên cứu khả năng sử dụng làm nguồn chất cho điện tử trong điều kiện khử sunphat Cơ chất được lựa chọn cho mô hình nghiên cứu là ethylcyclopectane (ECP) cho thấy sự phân hủy ECP có liên quan đến chi

1.3.5 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của vi khuẩn khử sunphat

Hoạt động của vi sinh vật trong tự nhiên chịu ảnh hưởng nhiều của các yếu tố vật lý, hóa học Những yếu tố này ảnh hưởng không những đến độ lớn và thành phần loài của các quần thể vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đến hình thái và sinh lý của chúng

Ở một số loài, nếu các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ muối và pH ở cao hơn hoặc thấp hơn mức tối ưu thì có thể dẫn tới sự thay đổi đáng kể về trao đổi chất, hình dạng tế bào

và quá trình sinh sản [Rheiheimer, 1985] Tuy rằng, trong các môi trường sống tự nhiên có rất nhiều các yếu tố khác nhau tác động lên các cơ thể sống, song một số yếu

tố trong chúng bao giờ cũng có ý nghĩa đặc biệt Đó là những yếu tố giới hạn khả năng sống của các vi sinh vật ở một mức độ nhất định Trong đó, ba yếu tố chính được coi

là đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh trưởng của vi khuẩn khử sunphat

là nhiệt độ, độ mặn và pH

1.3.5.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn khử sunphat Nhiệt độ ảnh hưởng đến phản ứng khử sunphat, sự tạo thành H2S

và sự oxy hóa cơ chất cũng như hình thái tế bào Theo báo cáo của Mueller và Nielsen,

ở một số chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt, phản ứng khử sunphat quan sát được ở nhiệt độ 35 - 75oC và trong khoảng nhiệt độ 50 - 60oC sự khử sunphat xảy ra với tốc

độ cao nhất Ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn, phản ứng khử sunphat xảy ra với tốc

độ thấp hơn và pha lag kéo dài hơn [Muller và Nielsen, 1996] Hình thái tế bào rất khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau Thể tích tế bào càng tăng khi nhiệt độ tăng

[Canganella và cs, 2000] Đối với các mẫu lấy từ vùng Alaska và biển Bắc ở nhiệt độ

35oC các tế bào hình que có kích thước trong khoảng 0,3 - 0,6 m 1,5 - 3 m chiếm

ưu thế trong khi đó ở 50oC các tế bào có dạng sợi dài từ 5 - 50 m lại chiếm ưu thế Ở

60oC, các tế bào chiếm ưu thế dài từ 2 - 4 m và có đường kính từ 0,3 - 0,7 m còn tế bào chiếm ưu thế ở 75oC lại là tế bào hình cầu nhỏ với đường kính trong khoảng 0,2 - 0,5 m [Muller và Nielsen, 1996]

Trong tự nhiên, vi khuẩn khử sunphat sống được ở nhiều điều kiện nhiệt độ khác nhau từ 0oC đến 100oC Một số chủng thuộc chi Desulfovibrio có khả năng phát

triển ở nhiệt độ 0oC thậm chí dưới 0oC Do việc lấy mẫu cũng như nuôi cấy vi khuẩn khử sunphat ưa lạnh gặp nhiều khó khăn nên nhóm vi khuẩn này chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều Các vi khuẩn khử sunphat ưa ấm có thể sống được trong khoảng nhiệt độ 4 - 65oC trong đó nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng trong khoảng 29 - 42oC

[Cord-Ruwisch và cs, 1987; Lại Thúy Hiền và Đặng Phương Nga, 1998; Castro và cs,

2000] Vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt lại có thể sống trong khoảng nhiệt độ 40 - 89oC

và nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của chúng là 55 - 76oC [Castro và cs, 2000; Lại Thúy Hiền và cs, 2003; Madigan và cs, 2009] Còn đối với vi khuẩn khử sunphat siêu

ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của chúng là 80 - 92oC Đồng thời, nếu nhiệt

độ nhỏ hơn 46oC hoặc lớn hơn 110oC thì chúng không thể sống được [Fadeau và cs, 1997; Takahata và cs, 2000]

1.3.5.2 NaCl

Vi khuẩn khử sunphat được tìm thấy trong môi trường nước tự nhiên có nồng

độ muối NaCl từ 0% đến bão hòa Tùy từng loài mà nhu cầu NaCl khác nhau Có những loài không cần cung cấp NaCl trong môi trường nuôi cấy như các loài vi khuẩn khử sunphat nước ngọt Chúng có thể bị ức chế nế nồng độ NaCl > 2 - 3% Ngược lại, nhiều loài phân lập được từ nước biển lại rất cần NaCl trong môi trường sống Chúng không thể sinh trưởng được trong môi trường nước ngọt mà đòi hỏi 10 - 30 g NaCl/l

và thỉnh thoảng cần cả muối magie cho quá trình sinh trưởng Trong môi trường mặn

tự nhiên như hồ muối NaCl, người ta thấy vi khuẩn khử sunphat vẫn hoạt động ở nồng

độ muối NaCl gần bão hòa [Dang và cs, 1996] Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào khẳng

định vi khuẩn khử sunphat ưa mặn lại đòi hỏi nồng độ muối NaCl cao cho sinh trưởng tối ưu Một vài vi khuẩn khử sunphat có thể chịu được nồng độ muối NaCl cao hơn mặc dù hoạt động của chúng bị giảm bớt khi nồng độ NaCl tăng lên đến 5 - 10%

[Cord-Ruwisch và cs, 1987]

Vi khuẩn ưa ấm có khả năng chịu mặn cao, chẳng hạn Desulfovibrio vietnamensis có khả năng chịu mặn đến nồng độ 30% NaCl Tuy nhiên, loài này cũng

có thể sống ở nồng độ 0% NaCl và thích hợp nhất cho sự sinh trưởng ở 5% NaCl

[Dang và cs, 1996] Đối với vi khuẩn ưa nhiệt thì khoảng nồng độ NaCl mà chúng có

thể sinh trưởng được là 0 - 6% và thích hợp nhất là 1 - 2% [Rosnes và Torsvik, 1991;

Nilsen và cs, 1996] trong khi đó nồng độ NaCl đối với vi khuẩn siêu ưa nhiệt là 1 - 2% NaCl [Fadeau và cs,1997; Takahata và cs, 2000]

1.3.5.3 pH

Sự sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn khử sunphat bị ảnh hưởng mạnh bởi

pH môi trường Khoảng pH thích hợp của vi khuẩn khử sunphat nằm trong khoảng từ

6 - 9 Tuy nhiên, đối với từng loại vi khuẩn khử sunphat lại có pH thích hợp riêng Chẳng hạn: vi khuẩn khử sunphat ưa ấm có pH thích hợp nằm khoảng 6,8 - 7,5 Tuy vậy, chúng vẫn có thể sống được nếu pH giảm xuống đến 5 hay tăng lên đến 10 [Dang

và cs, 1996] Còn đối với vi khuẩn ưa nhiệt, chúng có thể sống trong khoảng pH từ 5,5

- 9,1 và thích hợp nhất trong khoảng 6,8 - 7,5 [Rosnes và cs, 1991] Trong khi đó, pH

thích hợp với vi khuẩn rất ưa nhiệt là 6 - 7 và khoảng pH mà chúng có thể sống được

là 5,2 - 9 [Fadeau và cs, 1997; Takahata và cs, 2000]

Trong môi trường có pH không thích hợp, vi khuẩn khử sunphat vẫn sống được

do chúng vẫn có thể sinh trưởng trong các ổ sinh thái hẹp có pH trung tính được tạo nên bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng Hệ HS/H2S và HCO3-/CO2 đóng vai trò như một hệ đệm đã giúp chúng chống lại những điều kiện không phù hợp [Cord-Ruwisch

và cs, 1987]

1.4 Vai trò của vi khuẩn khử sunphat trong thực tiễn cuộc sống

1.4.1 Ảnh hưởng đến sinh thái và môi trường

Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn phân bố khá rộng trong tự nhiên, đặc biệt ở những nơi có hàm lượng sunphat cao (28 mM) như trong nước biển hay trong các trầm tích đáy ao, sông, biển Đặc trưng quan trọng nhất của vi khuẩn khử sunphat

là tạo ra khí H2S trong quá trình sinh trưởng, cũng chính điều này đã gây ảnh hưởng không tốt cho hệ sinh thái có sự xuất hiện nhóm vi khuẩn này H2S là chất khí có mùi

thối đặc trưng, không những gây ra ô nhiễm về mùi mà nó còn ảnh hưởng đến các sinh vật khác sống cùng hệ sinh thái đó Thứ nhất, H2S tác động trực tiếp với oxy hòa tan trong nước, làm giảm hàm lượng oxy hòa tan trong nước Thứ hai, H2S gây độc đối với các động vật thủy sinh vì nó dễ dàng kết hợp với ion Fe trong hemoglobin (H2S + FeO FeS + H2O), dẫn đến giảm khả năng vận chuyển ôxy của hemoglobin làm

chúng bị ngạt [Nguyễn Thanh Phương và cs, 2009]

Tuy nhiên, khi đặt vi khuẩn khử sunphat trong khía cạnh sinh thái, ta cũng không thể không nói đến tầm quan trọng của chúng Vi khuẩn khử sunphat đóng vai trò không thể thiếu trong các chu trình địa chất của lưu huỳnh và carbon hay trong quá

trình hình thành các mỏ dầu [Sievert và cs, 2007] Trong các hệ sinh thái kị khí, vi

khuẩn khử sunphat cũng là một nhân tố trong chuỗi thức ăn, cùng với các nhóm vi khuẩn khác góp phần chuyển hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ thành CO2 và nước [Gibson, 1990]

Bên cạnh đó, với khả năng khử các ion kim loại nặng trong môi trường, vi khuẩn khử sunphat đang được coi như là một tác nhân xử lý ô nhiễm môi trường Trên thế giới, bắt đầu từ năm 1998, phương pháp loại bỏ kim loại nặng trong nước thải bằng

vi khuẩn khử sunphat đã được nghiên cứu, ứng dụng để làm sạch các ion và thu hồi các kim loại nặng Ở Việt Nam, những nghiên cứu như thế mới chỉ bắt đầu Nhóm nghiên cứu của Đặng Phương Nga (2007) đã có những nghiên cứu và mô tả chi tiết về khả năng chống chịu một số kim loại nặng (Cr6+

, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+) của một số chủng vi khuẩn khử sunphat phân lập tại các làng nghề, cơ sở sản xuất cơ khí (Vân Chàng - Nam Định) Kết quả cho thấy các vi khuẩn này chủ yếu thuộc về chi

Desulfovibiro Cùng với những những nghiên cứu trong hơn 15 năm qua về khả năng

sử dụng hydrocarbon dầu thô như đã đề cập ở mục (1.3.4) thì vi khuẩn khử sunphat còn đang mở ra một hướng đi mới cho việc xử lý ô nhiễm dầu bằng phương pháp thu gom và xử lý trong điều kiện kị khí

1.4.2 Ảnh hưởng đến kinh tế và con người

Vi khuẩn khử sunphat trong quá trình sống cũng gây nên những rắc rối và thiệt hại không nhỏ đến đời sống, ngành nông nghiệp và công nghiệp của con người Trong

nông nghiệp, vi khuẩn khử sunphat gây thối rễ bèo, rễ lúa, làm cho thủy sản chết hàng loạt, gây thiệt hại lớn cho nông dân và Nhà nước Trong công nghiệp, nhóm vi khuẩn này cũng gây ảnh hưởng xấu đến các ngành công nghiệp giấy, gây nhiễm bẩn khí gas,

là một trong những tác nhân gây hư hỏng thực phẩm (chi sinh bào tử

Desulfotomaculum)… [Gibson, 1990]

Đặc biệt, nhóm vi khuẩn này gây thiệt hại đáng kể đối với ngành công nghiệp dầu khí Việc sinh ra khí H2S trong quá trình sinh trưởng phát triển đã gây những tác hại khá to lớn đến ngành công nghiệp này Theo các nhà khoa học, trong các giếng khoan có nhiệt độ lớn hơn 100oC thì khí H2S có nguồn gốc hóa học thuần túy, tuy nhiên, ở nhiệt độ dưới 100o

C thì khí H2S rõ ràng có nguồn gốc từ vi khuẩn khử sunphat [Orr, 1974] Khí H2S gây ra 4 tác động tiêu cực sau [Rabus và cs, 1996]:

(1) Gây ngộ độc cho công nhân làm việc tại các giếng khoan do tính chất gây độc khí này Khí hydro sunphua với tỷ trọng 1,1895 nặng hơn không khí, do đó khí này luôn tập trung quanh khu vực xuất hiện khí với mật độ dày H2S là chất khí cực độc (độc tính ngang với HCN và cao hơn CO từ 5 đến 6 lần) Người lao động khi làm việc trong môi trường có khí H2S, có thể quen với mùi và không nhận ra sự tồn tại của nó dẫn đến những nguy hại về sau Với hàm lượng thấp, khí H2S gây ảnh hưởng đến đường hô hấp, niêm mạc và giác mạc Với hàm lượng cao, H2S làm tê liệt thần kinh khứu giác và có thể dẫn đến tử vong

(2) Làm ô nhiễm dầu và khí đốt, làm tăng hàm lượng lưu huỳnh chứa trong dầu thành phẩm và đồng thời gây mùi thối cho dầu

(3) Chuyển đổi các khoáng sắt có trong dầu thành FeS, gây khó khăn cho việc tách dầu sau này

(4) Gây ăn mòn đường ống dẫn và các thiết bị chứa dầu do kết hợp với ion sắt trong các thiết bị Đây chính là mối quan tâm hàng đầu của các kỹ sư dầu khí và nhà nghiên cứu Hàng năm, Mỹ đã phải tổn thất từ 1 đến 2 tỷ USD do ăn mòn kim loại gây nên bởi vi khuẩn khử sunphat Tại Việt Nam, vấn đề này cũng đang được ngành dầu khí Việt Nam rất quan tâm Trong một nghiên cứu của Lại Thúy Hiền và Lê Phi

Nga (1992) với loài Desulfovibiro vulgaris phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ đã chỉ ra rằng

tốc độ ăn mòn đường ống của vi khuẩn này lên đến 0,062 - 0,085 mg/cm2

/ngày

Do thiệt hại của vi khuẩn khử sunphat gây ra đối với ngành công nghiệp dầu khí nên việc kiểm soát số lượng và kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn này trong các giếng khoan, hệ thống bể chứa và đường ống là cần thiết Đây cũng là mục tiêu của một trong những hợp đồng giữa Phòng Vi sinh vật dầu mỏ - Viện Công nghệ sinh học

và xí nghiệp liên doanh Vietsopetro từ năm 1993 đến nay Các nghiên cứu của Lại Thúy Hiền và cộng sự đã cho thấy nguồn gốc của vi khuẩn khử sunphat trong các giếng khoan dầu khí Việt Nam có nguồn gốc nội tại và cả ngoại lai xâm nhập vào giếng theo quá trình bơm ép nước vào vỉa để duy trì áp suất khai thác dầu Số lượng vi khuẩn khử sunphat ở các giếng bơm ép nước lên tới 104 - 106 tế bào/ml và 0 - 102 tế

bào ở các giếng khai thác [Lại Thúy Hiền và cs, 2000] Kết quả thí nghiệm với một số

chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt cho thấy chúng có thể tồn tại trong điều kiện vỉa

có nhiệt độ cao, áp suất cao và là nguồn gốc chính tạo H2S trong các giếng khoan mỏ

Bạch Hổ, Vũng Tàu [Lại Thúy Hiền và cs, 2001]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat (hỗn chủng) thuộc bộ sưu tập vi khuẩn khử sunphat được lấy từ các giàn khoan dầu khí Vũng Tàu của Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Dầu thô dùng cho quá trình nghiên cứu được lấy từ nguồn mỏ Bạch Hổ, nhận từ

Xí nghiệp khai thác dầu khí Vietsopetro

2.1 2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường khoáng Postgate B cải tiến (/l)

Bổ sung tùy theo mục đích thí nghiệm

Bổ sung tùy theo mục đích thí nghiệm

Môi trường được phân phối vào các bình tam giác vô trùng và khử trùng ở 0,8

at trong 45 phút Trước khi nuôi cấy, môi trường được đun sôi và làm lạnh nhanh để hạn chế tối đa lượng oxy hòa tan Cơ chất được thêm vào có thể là lactat (3,5 g/l), axetat (3 g/l) hoặc dầu thô tùy theo mục đích thí nghiệm Để tách khuẩn lạc, môi trường được bổ sung thêm vào môi trường 12 g/l thạch Chất thêm được thêm vào môi trường trước khi cấy tuỳ theo mục đích thí nghiệm pH môi trường được điều chỉnh bằng dung dịch NaHCO3 tới pH thích hợp với mục đích thí nghiệm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Trong các nghiên cứu về vi khuẩn khử sunphat, ta có thể dễ dàng quan sát sự sinh trưởng và phát triển của nhóm vi khuẩn này trong môi trường nuôi cấy dựa vào sự xuất hiện của cặn đen (FeS) trong môi trường dịch hay của các khuẩn lạc màu đen trong môi trường thạch Đây là kết quả phản ứng giữa FeSO4 (chất thêm được cho vào môi trường) với khí H2S (sinh ra bởi vi khuẩn khuẩn khử sunphat)

2.2.1 Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của hỗn chủng vi khuẩn khử

sunphat ưa nhiệt

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat từ bộ sưu tập vi khuẩn khử sunphat lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu được nuôi cấy hoạt hóa nhiều lần trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất cho đến khi

vi khuẩn khử sunphat sinh trưởng tốt Sau đó, các mẫu này sẽ được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và được bổ sung dầu thô (0,5%; 1%

và 3% môi trường) làm nguồn cơ chất duy nhất Sự sinh trưởng của các vi khuẩn khử

sunphat này trên dầu thô được theo dõi hàng ngày trong 1 tháng Mẫu nào thấy có sự sinh trưởng của vi khuẩn khử sunphat trên môi trường dầu thô thì chứng tỏ vi khuẩn khử sunphat của mẫu đó có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất

2.2.2 Đánh giá hàm lượng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ưa

nhiệt

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sinh trưởng tốt trên cơ chất dầu thô (từ thí nghiệm 2.2.1) được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các mẫu này được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl và cơ chất dầu thô 1% Sau 4 tuần nuôi cấy, hàm lượng dầu tổng số và thành phần dầu thô bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat sẽ được xác định bằng phương pháp tách dầu trong nước:

Lọc mẫu nuôi cấy vi khuẩn khử sunphat trong môi trường chứa 1% dầu thô bằng giấy lọc Dầu và các sản phẩm lơ lửng không tan trong nước được giữ trên giấy lọc Giấy lọc sau đó được được rửa vài lần bằng cách nhúng trong cốc đựng chloroform và được thu hồi vào một cốc cân Sau khi thực hiện xong bước này, phần lớn mẫu dầu sau thí nghiệm còn bám trên thành chai đựng mẫu Vì vậy, tiến hành tráng rửa chai vài lần bằng chroroform và thu hồi vào cùng cốc cân nói trên Để dung môi trong cốc cân bay hơi qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 20oC Sau khi bay hơi hết dung môi Cân cốc cân để xác định khối lượng dầu

2.2.3 Phân lập đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng

dầu thô

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô cao (từ thí nghiệm 2.2.2) được cấy hoạt hóa trên môi trường môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các mẫu này được pha loãng đến các nồng độ thích hợp và nuôi cấy trên môi trường thạch khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với dầu thô (1%) là nguồn cơ chất duy nhất Sự sinh trưởng của các mẫu vi khuẩn khử sunphat này trên môi trường thạch được theo dõi hàng ngày trong 1 tháng Các khuẩn lạc chiếm ưu thế và các khuẩn lạc có hình thái khác nhau được tách riêng và cấy truyền trên môi trường dầu thô 1% để giữ giống và dùng trong

các nghiên cứu tiếp theo Khi đó ta thu được các chủng thuần khiết (sau khi cấy lại trên môi trường thạch để kiểm tra độ sạch của chủng đã phân lập)

2.2.4 Nghiên cứu hình thái tế bào, nhuộm Gram và khả năng hình thành bào tử của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt

2.2.4.1 Nhuộm Gram

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1% Khi các chủng này sinh trưởng tốt, tiến hành nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi quang học Chủng nào bắt màu xanh tím thì chủng đó thuộc nhóm Gram dương còn chủng

nào bắt màu hồng tía thì chủng đó thuộc nhóm Gram âm

2.2.4.2 Nghiên cứu khả năng hình thành bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô thuộc nhóm Gram dương được cấy hoạt hóa trên môi trường môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với cơ chất dầu thô 1% Khi các chủng này sinh trưởng tốt, tiến hành sốc nhiệt ở 85oC trong vòng 20 phút, rồi nuôi cấy trở lại trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với

cơ chất dầu thô 1% Nếu chủng nào sinh trưởng trở lại được thì chủng đó có khả năng tạo bào tử

2.2.4.3 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trên môi trường dầu thô 1% Khi các chủng này sinh trưởng tốt, lọc bỏ cặn FeS rồi ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC để thu tế bào, rửa lại bằng PBS (Phosphate buffer saline) pH 7,2 Tế bào được cố định trong dung dịch glutaraldehyde 2,5% trong 15 phút Sau đó, tế bào được đưa lên bề mặt lamen Lamen chứa tế bào được rửa 2 lần trong dung dịch PBS rồi được cố định

bằng dung dịch OsO4 trong 15 phút Lamen lại được rửa bằng dung dịch PBS 2 lần rồi lần lượt đưa qua các dung dịch cồn 50%, 70%, 80%, 90% và 100% để hút nước tế bào Sau khi lamen khô, được phủ bằng Pt trong chân không rồi đưa vào kính hiển vi điện

tử HITACHI S4800 để quan sát tế bào

2.2.5 Nghiên cứu khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử

sunphat ưa nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate

B cải tiến chứa 1% NaCl có bổ sung lactat (1%) hoặc axetat (1%) để kiểm tra khả năng oxy hóa cơ chất hoàn toàn hay không hoàn toàn Nếu trên cả hai môi trường lactat và axetat vi khuẩn đều sinh trưởng tốt, chứng tỏ chủng đó có khả năng oxy hóa hoàn toàn lactat thành CO2 và nước Nếu chỉ quan sát thấy sự sinh trưởng trên môi trường lactat là nguồn cơ chất duy nhất, chứng tỏ chủng đó oxy hóa không hoàn toàn cơ chất

2.2.6 Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử

sunphat ưa nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trên các môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl có bổ sung hàm lượng dầu thô khác nhau (0,5%; 1%; 3%; 5%; 10%; 20%; 30%) Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này trên dầu thô được theo dõi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phân tích định kỳ sau 1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy Các mẫu này được tiến hành xác định hàm lượng

H2S tạo thành (phương pháp chuẩn độ iot) Ở hàm lượng dầu thô mà có hàm lượng H2S lớn nhất thì đó là hàm lượng dầu thô tối ưu cho sinh trưởng của chủng đó

Xác định hàm lượng H 2 S bằng phương pháp chuẩn độ iot:

Lượng H2S do vi khuẩn khử sunphat sinh ra được xác định theo phương pháp chuẩn độ iot của Rezinhicop

- Hút 25 ml dung dịch I2 0,1N vào bình để chuẩn (bình tam giác 250 ml)

- Hút 10 ml mẫu (dịch nuôi cấy) đã lắc đều cho vào bình để chuẩn

- Cho vào bình chuẩn 1ml HCl 10% Lắc đều trong bình chuẩn

- Dùng dung dịch Na2S2O3 0,1N chuẩn cho đến khi dung dịch trong bình chuẩn

có màu vàng nhạt thì cho 1ml dung dịch tinh bột 1% vào, chuẩn tiếp cho đến khi nào mất màu tím xanh thì thôi

m

V1, V2: thể tích dung dịch iot, thể tích Na2S2O3

N1, N2: nồng độ iot, nồng độ Na2S2O3

2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến quá trình sinh trưởng

của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy ở hàm lượng dầu tối ưu trên các môi trường với các nồng độ muối khác nhau (0%, 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%)

Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các nồng độ muối khác nhau được theo dõi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phân tích định kỳ sau

1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy Các mẫu này được tiến hành xác định hàm lượng H2S tạo thành (phương pháp chuẩn độ iot) (xem 2.2.6) Ở nồng độ muối mà có hàm lượng

H2S lớn nhất thì đó là nồng độ muối tối ưu cho sinh trưởng của chủng đó

2.2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng của các đơn

chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng dầu thô, nồng độ muối tối ưu cho quá trình sinh trưởng với các pH khác nhau (3,

5, 6, 7, 8, 10) Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các pH khác nhau được theo dõi hàng ngày trong 3 tuần và tiến hành lấy mẫu phân tích định kỳ sau

1, 4, 7, 10, 14, 21 ngày nuôi cấy Các mẫu này được tiến hành xác định hàm lượng H2S

tạo thành (phương pháp chuẩn độ iot) (xem 2.2.6) Ở pH mà có hàm lượng H2S lớn nhất thì đó là pH tối ưu cho sinh trưởng của chủng đó

2.2.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô

Các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô được cấy hoạt hóa trên môi trường khoáng Postgate B cải tiến chứa 1% NaCl với lactat và axetat làm nguồn cơ chất Sau đó, các chủng này được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng dầu thô, nồng độ muối tối và pH tối ưu cho quá trình sinh trưởng ở các nhiệt độ khác nhau (30oC, 45oC, 55oC, 70oC) Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử sunphat này ở các nhiệt độ khác nhau được theo dõi hàng sau 5 ngày nuôi cấy Quan sát định tính bằng mắt để xác định khoảng nhiệt độ sinh trưởng của đơn chủng khử sunphat (bằng cách quan sát có hay không có cặn kết tủa FeS)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu

Các mẫu vi khuẩn khử sunphat (hỗn chủng) lấy từ bộ sưu tập của phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học được nuôi cấy trên môi trường khoáng Postgate

B cải tiến bổ sung dầu thô với hàm lượng khác nhau (1, 3, 5%) là nguồn cơ chất duy nhất để thử nghiệm khả năng sử dụng dầu của chúng Mẫu được nuôi ở nhiệt độ 55oC, quan sát sự sinh trưởng hàng ngày trong vòng 1 tháng Kết quả được ghi nhận tại các thời điểm 7, 14 và 30 ngày được trình bày trong bảng 3.1 và phụ lục

Bảng 3.1 Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt phân lập từ

giếng khoan dầu khí Vũng Tàu

Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô

STT Tên mẫu

Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô Nồng độ dầu thô

(+: sinh trưởng tốt; -+: sinh trưởng yếu; -: không sinh trưởng)

Từ bảng 3.1 cho thấy 39 mẫu vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt lấy từ vị trí khác nhau của các giàn đều có khả năng sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy với dầu thô là nguồn cơ chất duy nhất, trong đó có 25 chủng thể hiện khả năng sinh trưởng tốt Kết quả trên đã cho thấy vi khuẩn khử sunphat sử dụng cơ dầu thô làm nguồn cơ chất là hiện tượng phổ biến Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn

khử sunphat có khả năng sử dụng dầu thô [Aeckersberg và cs, 1991; Rueter và cs, 1994; Kniemeyer và cs, 2003; Cravo-Laureau và cs, 2004; Irea và cs, 2006] Tuy nhiên

ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat Do đó, với kết quả này, ta có thể thấy các chủng vi khuẩn