Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel và phương pháp hoạt hóa tới hiệu suất lên men rượu từ rỉ đường bằng phương pháp cố định tế bào

Do đó, em được sự phân công của Nhà trường và Khoa Công nghệ thực phẩm cho thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel và phương pháp hoạt hóa tới hiệu suất lên men rư

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Nha Trang em đã được các Thầy Cô cung cấp, truyền đạt và chỉ bảo nhiệt tình tất cả kiến thức nền tảng và chuyên môn quý giá Ngoài ra em còn được rèn luyện một tinh thần học tập và làm việc rất cao Đây là những yếu tố cơ bản giúp em nhanh chóng hoà nhập với môi trường làm việc sau khi ra trường Đó cũng là nền tảng vững chắc giúp em thành công trong sự nghiệp sau này

Đồ án tốt nghiệp là cơ hội để em có thể áp dụng, tổng kết những kiến thức mà mình đã học, đồng thời rút ra những kinh nghiệm thực tế quý giá trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Trước hết cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu trường ĐH Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm, phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm, phòng thí nghiệm Hóa sinh, phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Thu Hương - GVHD trực tiếp của em đã giúp em hoàn thành đồ án một cách thuận lợi Cô đã luôn bên cạnh

để đóng góp sửa chữa những thiếu sót, khuyết điểm em mắc phải và đề ra hướng giải quyết tốt nhất từ khi em nhận đề tài đến khi hoàn thành

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các Thầy Cô Em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đã ủng hộ, động viên tinh thần giúp em hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Nha Trang, tháng 06 năm 2012

Sinh viên

Tăng Thị Thủy

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về rỉ đường mía 2

1.1.1 Thành phần hoá học của rỉ đường mía 2

1.1.2 Ứng dụng của rỉ đường mía 3

1.2 Tổng quan về quá trình lên men rượu etylic 5

1.2.1 Bản chất của quá trình lên men rượu etylic 5

1.2.2 Diễn biến và các thời kỳ lên men rượu etylic 7

1.2.3 Nguyên liệu và các phương pháp lên men rượu etylic 9

1.2.4 Tác nhân lên men rượu etylic 10

1.3 Tổng quan về kỹ thuật cố định tế bào 11

1.3.1 Giới thiệu về cố định tế bào 11

1.3.2 Ưu điểm của việc cố định tế bào 12

1.3.3 Các phương pháp cố định tế bào 14

1.3.4 Kỹ thuật cố định tế bào bằng phương pháp bẫy 15

1.3.5 Giới thiệu chung về chất mang Alginate 16

1.3.6 Các nghiên cứu về ứng dụng của alginate trong lĩnh vực cố định tế bào 20

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Nguyên liệu chính - rỉ đường 24

2.1.2 Nguyên liệu phụ 24

2.1.3 Các dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Sơ đồ quy trình 25

2.3.2 Nội dung nghiên cứu 27

2.3.3 Bố trí thí nghiệm 27

2.3.4 Phương pháp xử lý nguyên liệu và nuôi cấy tế bào nấm men 30

2.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 31

2.3.5.1 Phương pháp phân tích 31

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu suất lên men rượu32 3.1.1.Ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến thời gian lên men 32

3.1.2 Ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men 34

3.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men rượu 35

3.2.1 Kết quả thí nghiệm xác định số lần tái sử dụng hạt gel 36

3.2.2 Kết quả xác định nồng độ oxy hòa tan bổ sung 37

3.3 Đề xuất quy trình lên men từ rỉ đường bằng tế bào cố định 39

3.4 Đánh giá hiệu suất lên men 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41

Kết luận 41

Đề xuất ý kiến 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ lên men rượu etylic 8

Hình 1.2 Nấm men vừa mới chớm nở được quan sát bằng kính hiển vi điện tử 11

Hình 1.3 Hình ảnh tế bào cố định trong alginate 12

Hình 1.4 Cấu tạo của hai monomer α-L-guluronic acid và β-D-manuronic acid 16

Hình 1.5 Các dạng alginate 17

Hình 1.6 Mô hình tạo gel dạng vỉ trứng của alginate canxi 18

Hình 1.7 Quá trình tạo gel alginate canxi theo phương pháp khuếch tán 22

Hình 2.1 Rỉ đường sau khi thu mua 24

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 25

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men 28

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men 30

Hình 3.1: Lượng đường sót trong dịch lên men theo thời gian ở các kích thước hạt gel 1, 2, 5, 10, 25ml 32

Hình 3.2: Hiệu suất lên men theo thời gian ở các kích thước hạt gel 1, 2, 5, 10, 25ml 34 Hình 3.3 Hiệu suất lên men ở các kích thước hạt gel sau 48h lên men 35

Hình 3.4: Hiệu suất lên men sau 48h ở các lần tái sử dụng với kích thước hạt gel 25ml 36

Hình 3.5 Quy trình lên men rỉ đường 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rỉ đường mía 2

Bảng 1.2: Thành phần chất hữu cơ của rỉ đường 3

Bảng 1.3 Tóm tắt các đặc điểm chính của các phương pháp cố định 14

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của alginate trong kỹ thuật cố định tế bào 20

Bảng 3.1 Thời gian lên men để đường sót 5mg/ml 33

Bảng 3.2: Kết quả xác định hiệu suất lên men sau khi bổ sung oxy 38

LỜI MỞ ĐẦU

Rượu etylic hay ethanol là một hợp chất hữu cơ trong dãy đồng đẳng của rượu metylic có công thức hóa học là C2H5OH hay CH3-CH2-OH Rượu etylic là một chất lỏng, không màu, mùi thơm dễ chịu, vị cay, nhẹ hơn nước, sôi ở nhiệt độ 78,390C, hóa rắn ở -114,150C, tan trong nước vô hạn

Nguyên liệu để sản xuất rượu etylic là các nguyên liệu giàu tinh bột (gạo, sắn, ngô…) hay đường (rỉ đường…)

Tác nhân để thực hiện quá trình lên men rượu etylic thường là nấm men Người ta có thể cho trực tiếp hoặc nhốt chúng trong các „bẫy‟ và khi đó nó trở thành

tế bào cố định Tế bào cố định được hiểu là ngăn không cho chúng chuyển động tự

do với các tế bào lân cận nó trong pha lỏng Có nhiều phương pháp cố định đã được các nhà khoa học nghiên cứu, ở đây chỉ xét phương pháp “bẫy” gel

Cố định tế bào là một hướng phát triển mới trong công nghệ sinh học Những tế bào cố định được nghiên cứu và ứng dụng vào trong hóa học, thực phẩm, nhiên liệu, y học và xử lý nước thải…

Hiện nay, nguồn rỉ đường chủ yếu dùng làm thức ăn gia súc Vấn đề xử lý rỉ đường đang là vấn đề được các nhà máy đường quan tâm, trong đó có một hướng là cho lên men rượu Kỹ thuật lên men rượu bằng phương pháp cố định tế bào đã được

áp dụng, nhưng việc nghiên cứu về kích thước hạt gel, phương pháp hoạt hóa tế bào chưa được quan tâm Do đó, em được sự phân công của Nhà trường và Khoa Công

nghệ thực phẩm cho thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel và phương pháp hoạt hóa tới hiệu suất lên men rượu từ rỉ đường bằng phương pháp cố định tế bào”

Qua hơn 3 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm thuộc trung tâm thí nghiệm thực hành của trường em đã hoàn thành được những yêu cầu của đề tài Mặc dù em

đã hết sức cố gắng nhưng do thời gian có hạn nên báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô và các bạn để báo cáo được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rỉ đường mía

Rỉ đường mía là một sản phẩm phụ tạo ra trong quá trình sản xuất đường từ cây mía, nó chính là đường không kết tinh được, do đó tồn tại ở trạng thái mật và lẫn một số hợp chất khác

Màu sắc của rỉ đường mía thường là màu nâu đen, do quá trình caramen hóa, được tạo thành do phản ứng giữa đường với NH2CH2COOH [8]

Rỉ đường mía là hỗn hợp gồm nhiều loại đường: Saccharoza, glucoza, fructoza, maltoza…

1.1.1 Thành phần hoá học của rỉ đường mía [12]

Thành phần hóa học chính xác của rỉ đường mía rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà máy Do vậy thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và độ nhớt của rỉ đường không ổn định Bảng 1.1 cho thấy biến động của các thành phần của rỉ đường

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rỉ đường mía

Sáp, sterol và phôtpholipid 0,4 0,1-1

Nguồn: Wolfrom và Binkley (1953)

Các loại glucid hoà tan (đường đôi và đường đơn) là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó sucroza là chủ yếu (bảng 1.1) Rỉ đường mía có đặc điểm là có tỷ lệ đường khử tương đối cao Trong chu trình kết tinh các loại đường khử tăng lên tới mức mà sucroza không thể kết tinh được nữa bởi vì đường khử làm giảm khả năng hoà tan của sucroza Các chất khoáng có xu hướng giữ sucroza trong dung dịch, cho nên cân bằng giữa đường khử và chất khoáng sẽ quyết định sản lượng sucroza lý thuyết có từ cây mía Phần sirô còn lại thường được coi là rỉ đường Tổng lượng đường trong rỉ đường củ cải đường thường thấp hơn trong rỉ đường mía, nhưng lại chứa hầu như toàn bộ là sucroza

Bảng 1.2: Thành phần chất hữu cơ của rỉ đường

Nguồn: Sreg và Van de Meer (1985)

1.1.2 Ứng dụng của rỉ đường mía

Rỉ đường được ứng dụng trong sản xuất nhiều sản phẩm như: bột ngọt, rượu rum, sản xuất nấm men, acid lactic, cồn, tăng sinh khối protein Ngoài còn rất nhiều các quy trình công nghệ tiên tiến khác cũng dùng rỉ đường làm nguyên liệu như: Micromix-3 kết hợp bổ sung rỉ đường NPK để xử lý rác, xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và enzym dùng làm thứ ăn cho gia súc, gia cầm,…

Dùng rỉ đường làm nguyên liệu để lên men vì trong rỉ đường có những đặc tính phù hợp với quá trình lên men như sau:

Rỉ đường chứa hàm lượng đường cao Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất điều hoà sinh trưởng Trong

đó có vitamin H (biotin) là chất kích thích sinh trưởng đối với phần lớn nấm men Trong 2 loại rỉ đường thì rỉ đường từ mía có hàm lượng biotin cao hơn rỉ đường từ

củ cải đường Chính vì thế, ở nhiều nước không có mía, người ta phải nhập rỉ đường

từ mía về trộn chung với rỉ đường từ củ cải đường để đảm bảo hàm lượng biotin cho nấm men phát triển Tuy nhiên rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men, ta phải tiến hành một số quá trình xử lý

Các đặc điểm ảnh hưởng quá trình lên men là: Rỉ đường thường có màu nâu sẫm, được tạo ra trong quá trình chế biến đường Màu này rất khó bị phá hủy trong quá trình lên men Sau khi lên men, chúng sẽ bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có màu vàng sẫm Màu này không phải màu tự nhiên của nấm men và việc tách màu ra khỏi sinh khối rất tốn kém và khó khăn Các chất màu này bao gồm các hợp chất caramen, phức chất của phenol – Fe +2, Melanoidin, Melanin Hàm lượng đường khá cao, nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp cho sự phát triển của nấm men Hệ keo trong rỉ đường có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men Hệ keo trong rỉ đường hình thành bởi protein và pectin Hệ keo này tạo ra độ nhớt cao làm giảm khả năng hoà tan của oxy, làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men Nếu hệ keo không được phá sẽ gây thoái

hoá tế bào, dẫn đến hiệu suất thu nhận sinh khối nấm men thấp [1]

Bên cạnh đó sản phẩm phụ là CO2 thu được trong quá trình lên men rỉ đường

để cung cấp cho các cơ sở sản xuất nước giải khát có gas cũng thu được khối lượng đáng kể

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Theo công thức trên lượng CO2 thu được chiếm (44:46)% = 95,65% khối lượng cồn tinh khiết, qua khảo sát tại cơ sở sản xuất cồn với giá hiện tại 1.800

đồng/kg CO2 sản phẩm phụ thu được đủ trả chi phí nhân công lao động trong toàn

cơ sở

 Bảo quản rỉ đường

Hiện nay các công ty sản xuất đường thải ra một lượng rỉ đường từ 32%÷35%

so với đường thành phẩm Với lượng lớn rỉ đường như vậy không thể tiêu thụ, sử dụng hết ngay trong vụ ép vì vậy phải có kho chứa

Kho chứa rỉ đường thường là hệ bồn hình tròn có thể đổ bê tông cốt thép hoặc bằng thép có sức chứa từ 100 - 200 tấn rỉ, mỗi bồn nhất thiết phải có mái che mưa nắng Trước van xả bố trí hệ thống gia nhiệt để làm loãng trước khi lấy rỉ đường

vì rỉ đường để lâu bùn cát và một số đường saccharose kết tinh chặt dưới đáy, mùa lạnh sẽ không thể lấy ra được

1.2 Tổng quan về quá trình lên men rƣợu etylic

1.2.1 Bản chất của quá trình lên men rƣợu etylic [15]

Lý thuyết về lên men rượu đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu từ lâu Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy, khi lên men đường không chỉ biến thành rượu mà còn tạo ra acid axetic Năm 1810, Gaylussac nghiên cứu và thấy rằng, cứ 45 phần khối lượng đường glucoza khi lên men sẽ tạo

ra 23 phần alcol etylic và 22 phần khí cacbonic Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình tổng quát về lên rượu như sau:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q

Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thấy rằng, cứ 100 phần đường saccaroza khi lên men sẽ tạo ra 51,1 phần alcol etylic; 48,4 phần CO2; 32 phần glyxerin; 0,7 phần acid succinic và 2 phần các sản phẩm khác Từ đó ông suy ra, cứ

45 phần khối lượng glucoza khi lên men sẽ cho 21,8 phần rượu chứ không phải 23 phần như Gaylussac đã tính Tuy nhiên, phương trình lên men do Gaylussac đưa ra vẫn đúng và được dùng làm cơ sở để tính hiệu suất lên men và hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết

Passteur cho rằng, sự lên men chỉ xảy ra khi có mặt của vi sinh vật Nếu ngăn ngừa không cho vi sinh vật tiếp xúc với dịch đường thì hiện tượng lên men sẽ không

xảy ra Ông kết luân, “sự lên men rượu là một quá trình sinh học có liên hệ mật thiết tới hoạt động của tế bào men”

Vào khoảng 1871 - 1872, Manaxeni đem nghiền tế bào men với cát thạch anh rồi mới cho vào dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra Đến 1897, Bucher đem nghiền nát tế bào men rồi cho vào dịch đường ông thấy dịch chiết này vẫn có khả năng biến đường thành rượu và khí cacbonic Từ đó người ta gọi các chất chứa trong dịch các tế bào men là zymaza Đây chính là tập hợp của nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hóa đường thành rượu và CO2

Dịch men gồm rất nhiều tế bào men riêng biệt, 1 gam men ướt có độ ẩm khoảng 70†75% chứa tới 14 tỉ tế bào Bề mặt của mỗi tế bào chiếm 5.10-5 mm2 Như vậy 1 gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7.000 cm2 Nhờ có bề mặt lớn này nên nấm men hấp thụ đường và các chất dinh dưỡng rất nhanh Cơ chế lên men rượu xảy ra như sau:

Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào bên trong Ở đó các emzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và khí cacbonic Hai chất này đều khuếch tán và tan vào môi trường xung quanh Rượu rất linh động nên hòa tan nhanh trong dịch lên men, còn khí cacbonic hòa tan kém và khuếch tán chậm Lúc đầu hòa tan hoàn toàn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào men và lớn dần tới mức lực đẩy Archimedes lớn hơn khối lượng tế bào men cộng bọt khí, lúc đó tế bào cùng bọt khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ tan vỡ và hợp thành tiếng rào rào Bọt khí tan, tế bào men lại chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp thụ và lên men rồi lại sản xuất ra rượu và khí cacbonic Như vậy tế bào nấm men từ chỗ là vi sinh vật không chuyển động đã biến thành tế bào luôn chuyển động trong quá trình lên men Nhờ đó mà tăng nhanh tốc độ hấp thụ và chuyển hóa đường thành rượu Khi đường

và các chất dinh dưỡng trong canh trường còn ít, một lượng lớn tế bào men sẽ lắng xuống đáy thùng, dịch lên men sẽ trong dần

Nấm mem có thể lên men trong dịch đường có nồng độ 25†30%, nhưng chậm Nồng độ thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15†18% Nồng

độ cao thì áp suất thẩm thấu sẽ lớn, do đó ảnh hưởng xấu tới hiệu quả lên men, lên men sẽ kéo dài, đường sót lại trong dịch giấm chín sẽ tăng Nếu lên men ở nồng độ đường thấp cũng không có lợi vì tổn thất do tạo men sẽ tăng Ví dụ khi lên men dịch đường có nồng 16,9%, tổn thất đường do tạo men chiếm 6% so với lượng đường có trong dung dịch; nếu nồng độ đường là 8,6% thì tổn thất do tạo men chiếm tới 9,84% Mặt khác, lên men ở nồng độ thấp sẽ làm giảm năng suất của thiết bị, tốn nhiều hơi khi chưng cất và làm tăng tỉ lệ tổn thất rượu trong bã hèm và nước thải Khi lên men có khoảng 95% đường biến thành rượu và CO2, 5% còn lại là tạo các sản phẩm khác và đường sót

Lên men được tiến hành ở nhiệt độ 28 † 320C và pH = 4,5 - 5,2 Nhiệt độ cao thì tổn thất sẽ lớn do tạp khuẩn dễ phát triển, tạo nhiều estse aldehyt Khi lên men ở 29,5oC, tổn thất do tạo men là 7,37%, ở 17,5oC tổn thất do tạo men là 5,32% và nếu lên men dịch đường ở 100C thì tổn thất do tạo men chỉ chiếm 4,42% lượng đường

có trong dung dịch Xét về ảnh hưởng của pH thì tổn thất sẽ tăng nhanh và nhiều

hơn so với giảm pH Giảm pH từ 5,6 xuống 4,42 hiệu suất lên men tăng 2,3% [4] 1.2.2 Diễn biến và các thời kỳ lên men rƣợu etylic

o Diễn biến của quá trình lên men rượu etylic

Trong quá trình lên men rượu etylic đầu tiên tế bào nấm men hấp thụ đường và chất dinh dưỡng khác lên bề mặt của nó Sau đó các chất khuếch tán qua màng bán thấm của tế bào vào trong tế bào Sự khuếch tán này tuân theo định luật chung của

sự thẩm thấu Nước có thể ra vào tự do nhưng đường và các chất hòa tan khác ra vào tế bào rồi thì không quay ra được Trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men, đường được chuyển hóa thành rượu etylic và CO2 Rượu etylic và CO2 được tạo thành thoát ra khỏi tế bào và khuếch tán vào môi trường, rượu etylic hòa tan vào trong nước Lúc này môi trường lên men nhanh chóng được bão hòa bởi khí CO2, khí CO2 hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men tạo thành như một cái phao, thắng được trọng lực của tế bào cả bọt khí và nấm men nổi lên Bọt khí vỡ, tế bào nấm men lại chìm xuống Như vậy nếu quan sát vào môi trường lên men ta thấy nấm

men vốn không di động trở thành di động Hiện tượng này góp phần tăng nhanh quá trình trao đổi chất và tốc độ lên men được tăng nhanh một cách tương ứng [4]

Hình 1.1: Sơ đồ lên men rượu etylic [4]

o Các thời kì lên men rượu etylic

Xét về mặt hóa học, lên men rượu etylic bình thường chia làm hai thời kỳ:

- Thời kỳ cảm ứng: Là thời kỳ hướng phản ứng xảy ra theo chiều hướng (a)

Lúc này sản phẩm hình thành glycerin Bởi lẽ lúc này hàm lượng acetaldehyde (CH3CHO) chưa có nhiều để nhận hydro của coldehydrogensae mà hydro lại chuyển đến cho phosphoglyceraldehyde tạo thành phosphoglyceryl bị thủy phân giải phóng acid phosphoric và glycerin

Thời kỳ tĩnh: Là thời kỳ hướng phản ứng xảy ra theo chiều hướng (b) Lúc

này lượng acetaldehyde đã hình thành nhiều, nên hydro từ alcoldehydrogenase lại

CH3-CH2OH Ethanol

CH2OH CHOH

CH2OH

CH2-O-PO3H2CHOH COOH

chuyển sang acetaldehyde theo chiều hướng phản ứng (b) Sản phẩm chủ yếu là

rượu etylic [4]

1.2.3 Nguyên liệu và các phương pháp lên men rượu etylic

Nguyên liệu để lên men rượu etylic

Về nguyên tắc để sản xuất rượu etylic có thể dùng bất kỳ nguyên liệu nào chứa

đường hoặc polysaccaride vì sau thủy phân sẽ biến thành đường lên men được Tuy nhiên hiện nay có hai nguồn nguyên liệu chính để sản xuất rượu etylic là

rỉ đường và tinh bột

Các phương pháp lên men rượu etylic từ rỉ dường

Ở nước ta hiện nay, khi lên men rượu etylic từ rỉ đường vẫn sử dụng một trong 3

phương pháp sau đây:

+ Phương pháp lên men gián đoạn

Rỉ đường sau khi xử lý tách cặn, được pha loãng xuống 170Bx – 180Bx cho thêm các chất vi lượng như (NH4)2SO4, B1…rồi chuyển vào thùng lên men, trong

thùng lên men đã có sẵn tế bào cố định, sau 64 giờ bình thường đạt:

+ Phương pháp lên men bán liên tục (lên men chuyển tiếp): tức là nồng độ

Bx trong dịch lên men không được thay đổi lớn (cao quá 120Bx và thấp dưới 90Bx)

Do đó khi đến thời điểm lên men phát triển tốt (thường nồng độ từ 100Bx – 110Bx ) người ta cho dịch rỉ đường đã được pha loãng ở các nồng độ Bx khác nhau (thường

có nồng độ 19,5- 20oBx) vào thùng lên men để tốc độ lên men cân đối Quá trình chuyển tiếp liên tục, dung tích lên men trong thùng cũng tăng liên tục vì vậy rỉ đường chuyển tiếp nồng độ là 19,50Bx – 200Bx sẽ có nồng độ rượu bình quân khi

kết thúc lên men 8,5%V – 11%V Kết quả năng suất sử dụng thiết bị tăng, giảm

được hơi chưng cất nên chi phí sản xuất giảm nhưng việc quản lý thao tác, theo dõi tốc độ lên men khó khăn do quá trình chuyển tiếp rỉ đường có nồng độ, tốc độ thay đổi gây nên Vì vậy một số cơ sở áp dụng phương pháp lên men liên tục

+ Phương pháp lên men liên tục

Rỉ đường được cung cấp liên tục cho quá trình lên men chính Rỉ đường được chuyển tiếp ở nồng độ thường 20,50Bx – 210Bx, sau 64 giờ lên men độ rượu thu được từ 8%V - 11%V Phương pháp lên men liên tục sử dụng thiết bị lên men ít nhất, chủ động được nồng độ rượu trong dịch lên men, theo dõi điều tiết quá trình

lên men đơn giản, đạt hiệu quả cao do đó chi phí sản xuất giảm [10]

1.2.4 Tác nhân lên men rƣợu etylic [15]

Tác nhân lên men rượu etylic là nấm men Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu

Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào, nên nhiều loại nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein Ngoài ra nấm men còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì Tuy nhiên, cũng có nhiều loại nấm men có hại, gây bệnh cho người

và gia súc, làm hư hỏng lương thực, thực phẩm

Nấm men dùng trong sản xuất rượu etylic thường là các chủng thuộc giống

Saccharomyces, chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường

nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin, peptid), vitamin và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển và lên men của nấm men được tiến hành

Đặc tính hình thái: có 2 loại nấm men là nấm men chìm và nấm men nổi

Nấm men chìm: Khi quan sát bằng kính hiển vi các tế bào nấm men khi nảy

chồi thường đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi Hình dạng chủ yếu là hình cầu

Nấm men nổi: Tế bào nấm men mẹ và con sau nảy chồi thường dính lại với

nhau tạo thành như chuỗi các tế bào nấm men còn hình dạng chủ yếu hình cầu hoặc ovan với kích thước 7 – 10 m

Cấu tạo

- Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành Ascomycota

và thuộc giới nấm

- Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích

thước nhỏ, từ 5-14 mircomet, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử

Hình 1.2 Nấm men vừa mới chớm nở được quan sát bằng kính hiển vi điện tử

- Cấu tạo của nấm men Saccharomyces gồm những thành phần chủ yếu sau:

nhau như bộ máy Golgi, lysozom, không bào, chứa các sản phẩm bị phân cắt, hay

chất độc lạ có thể có hại cho tế bào Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin di truyền cho tế bào và các thành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bào Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy ra trong ty thể cũng nằm trong tế bào chất Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào

1.3 Tổng quan về kỹ thuật cố định tế bào

1.3.1 Giới thiệu về cố định tế bào

Trong những năm 1970 các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm đến một phương pháp mới cho công nghệ lên men dùng trong công nghệ sản xuất công nghiệp, đó là phương pháp cố định tế bào Từ đó đến nay, phương pháp này ngày càng được nghiên cứu và phát triển rộng rãi Từ các ứng dụng ban đầu trong công nghiệp thực phẩm như: sản xuất các loại rượu, bia, acid hữu cơ,… phương pháp này được mở rộng sang các lĩnh vực khác như: nghiên cứu sinh hóa cơ bản trong phân tích hóa học, trong xử lý nước, trong sản xuất kháng sinh, kháng nguyên…

Sự phát triển của kỹ thuật cố định tế bào là kế thừa kỹ thuật cố định enzyme nhưng nó đơn giản và rẻ tiền hơn, đó là do tránh được việc tách và tinh chế enzym

Do đó hoạt tính của enzym gần như được bảo toàn so với trạng thái tự nhiên của nó

Kỹ thuật cố định tế là một trong những kỹ thuật mạnh nhất hiện nay dùng trong

công nghệ sinh học [7]

Hình 1.3 Hình ảnh tế bào cố định trong alginate

1.3.2 Ƣu điểm của việc cố định tế bào

Trong những năm cuối thế kỷ 20, khi mà kỹ thuật cố định enzyme và tế bào ra đời nó đã được quan tâm, chú ý đặt biệt để thay thế một phần cho các quá trình lên men truyền thống Các chất dinh dưỡng hay cơ chất khi đi qua tế bào cố định này sẽ tạo ra các sản phẩm mong muốn Có hai đặc điểm có giá trị kinh tế trong việc cố định tế bào

Một là: Hoạt tính xúc tác sinh học tương đối kéo dài và mạnh Sau khi cố định

sự giảm hoạt tính là không thể tránh khỏi được vì các protein là thành phần của chất xúc tác sinh học không ổn định hoàn toàn Việc xác định thời gian cho đến khi mất

hoạt tính hoàn toàn là không thuận lợi do đường cong suy giảm hoạt tính là không tuyến tính Tương tự như quá trình phân ra phóng xạ, người ta thường xác định thời gian bán rã của chế phẩm cố định Thời gian này có thể kéo dài từ vài giờ đến vài năm

Hai là: Tính bền của chế phẩm tạo thành Nếu bình phản ứng cao với chất bên

trong đứng yên, các phần bên dưới sẽ bị ép bởi trọng lượng chất bên trên và ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy và hiệu suất phản ứng Với các bình phản ứng có cánh khuấy hay thổi khí, các phần tử sẽ chuyển động và bị vách bình làm mài mòn Khi

đó tế bào sẽ bị tách ra khỏi chất mang và chất mang bị phá hủy Cả hai việc đó làm bẩn dòng sản phẩm Các bọt khí tạo ra do tế bào cố định cũng ảnh hưởng đến quá trình, nó ngăn cản không cho cơ chất tiếp xúc với chất xúc tác

Một khía cạnh khác của tính bền là sự ngăn cản quá trình phân hủy do vi sinh vật Điều này có thể thực hiện dưới điều kiện mà vi sinh vật tạp không thể phát triển như: nhiệt độ cao, nồng độ cơ chất cao, dung dịch có tính kiềm hay acid cao Trong một số trường hợp đặc biệt, tính chất kháng sinh của chất mang như lòng trắng trứng có thể xem như một ưu điểm đặc biệt Có thể dùng biện pháp thanh trùng ban đầu cơ chất Khi đã có hoạt tính và độ bền cao thì vấn đề cần phải quan tâm là sự khuếch tán ra của sản phẩm phản ứng

Không thể đạt được một hệ thống thỏa mãn tất cả các điều kiện trên Tuy nhiên, tiêu chuẩn về độ bền có giá trị kinh tế hơn tiêu chuẩn về sự khuếch tán Các đặc điểm của chế phẩm tế bào cố định được nêu ra dưới đây:

Hoạt tính sinh học cao

Tính ổn định lâu dài của chất xúc tác sinh học

Khả năng tái sinh chất xúc tác sinh học

Ít giảm hoạt tính sinh học trong khi cố định

Bảng 1.3 Tóm tắt các đặc điểm chính của các phương pháp cố định

+ polyme nhân tạo

Nhẹ nhàng, đơn giản Khuếch tán giới hạn, độc,

1.3.4 Kỹ thuật cố định tế bào bằng phương pháp bẫy

Kỹ thuật bẫy gel do tính nhẹ nhàng dễ thao tác và khả năng ứng dụng rộng rãi,

là một trong những kỹ thuật được nghiên cứu nhiều nhất Như tên gọi nó là sự bẫy

tế bào bên trong một mạng lưới gel nhỏ hơn kích thước tế bào Do đó mạng lưới gel

sẽ bao bọc xung quanh các tế bào hơn là tế bào hấp phụ lên trên bề mặt nó Có một dải rộng các vật liệu dùng để bẫy gel: từ các polysaccharit, protein đến các polymer tổng hợp tinh khiết như polyacrylamit Một cách tổng quát, có thể nói rằng tế bào được bẫy trong mạng lưới gel, mà gel đó có thể vĩnh cửu hay thuận nghịch Các gel mềm và thuận nghịch có chức năng kém trong khi gel vĩnh cửu có thể liên quan đến các giai đoạn chuẩn bị có tính độc cao Khi tế bào được bẫy trong gel, để duy trì sự sống cần phải cung cấp chất dinh dưỡng và các điều kiện cần thiết cho sự phát triển Tuy nhiên, sự phát triển quá mức trong một mạng lưới gel yếu có thể làm phá vỡ mạng lưới và làm thất thoát tế bào

Một vấn đề cần phải tính đến trong kỹ thuật bẫy gel là trở lực khuếch tán của gel đối với cơ chất và đối với sản phẩm Cách tốt nhất để làm giảm trở lực là tạo một lớp mỏng vật liệu bao xung quanh các nhóm tế bào Các tế bào được tự do chuyển động bên trong các vỏ này

Khi tế bào được bẫy trong mạng lưới gel nó giống như một cái thanh cản trở

sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm Người ta nhận thấy rằng các phân tử có kích thước nhỏ bao gồm các cơ chất và sản phẩm có thể khuếch tán với vận tốc có thể chấp nhận được cho bất kì vật liệu gel nào Kích thước và dạng vật liệu tạo gel

có thể gây nên những vấn đề khuếch tán nghiêm trọng

Có hai loại chế phẩm bẫy tế bào: thứ nhất là chế phẩm trong đó toàn bộ tế bào

có khả năng sống được, một số tế bào được bẫy lỏng lẻo trong mạng lưới có thể được kích thích phát triển bằng cách thêm vào chất dinh dưỡng thích hợp Như vậy trên một đơn vị thể tích có thể đạt được mật độ tế bào cao hơn khi nuôi cấy tự do trong bình lên men Loại thứ hai là loại cố định liên quan đến sự bẫy các tế bào không có khả năng sống Sự mất khả năng sống có thể do chủ ý hay kỹ thuật cố

định, chất mang [11]

1.3.5 Giới thiệu chung về chất mang Alginate [13]

Alginate là muối của acid alginic, một thành phần cấu tạo của vách tế bào rong nâu Acid alginic là một co-polyme mạch thẳng được cấu thành từ hai monomer là α-L-guluronic acid và β-D-manuronic acid Hai monomer này liên kết với nhau để tạo thành acid alginic thông qua liên kết 1-4 glucoside

Tỉ lệ hai loại acid này phụ thuộc vào vị trí địa lý, mùa vụ, giống loài và vị trí trên thân rong dùng để tách chiết acid alginic Sự khác biệt về thành phần này ảnh hưởng đến các tính chất của alginate, đặc biệt là tính chất tạo gel Hai monomer này kết hợp với nhau để tạo ba block:

- Block homopolyguluronic: gồm các gốc aicd guluronic nối tiếp nhau, GGGG

- Block homopolymanuronic: gồm các gốc manuronic nối tiếp nhau,

MMMM

- Block luân hợp (alternating): hai gốc luân phiên nối tiếp nhau,

MGMGMG

Hình 1.4 Cấu tạo của hai monomer α-L-guluronic acid và β-D-manuronic acid

Khối lượng phân tử của alginate thương mại nằm trong khoảng 32000 - 200000 tương ứng với múc độ polymer hóa từ 180 ÷ 930 Alginate là một keo ưa nước do

đó nó dễ hút ẩm từ không khí Hàm lượng ẩm cân bằng của alginate phụ thuộc vào

độ ẩm tương đối của không khí Acid alginic và các muối của nó sẽ giảm chất lượng

ở nhiệt độ trên 32oC, do đó chúng cần được bảo quản ở nơi thoáng mát

Hình 1.5 Các dạng alginate

Các muối kim loại kiềm Na, K của acid alginic và propylene glycol alginate rất dễ tan trong nước và tạo thành dung dịch có độ nhớt rất cao Người ta ứng dụng tính chất này của alginate để tách chiết chúng ra khỏi rong nguyên liệu cũng như trong các ứng dụng khác của alginate Trong khi đó, muối alginate của các kim loại

đa hóa trị thì không tan trong nước

Dung dịch 1% của alginate thương mại có độ nhớt nằm trong khoảng 20 - 2000 mPa.s Độ nhớt của dung dịch alginate phụ thuộc vào 4 yếu tố chính:

(1) Mức độ polymer hóa tăng làm độ nhớt

(2) Nồng độ tăng thì độ nhớt tăng

(3) Nhiệt độ tăng thì độ nhớt giảm

(4) Dung dịch trong nước cứng hoặc có mặt của các chất điện ly sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của alginate

Ngoài ra, độ nhớt của alginate còn phụ thuộc vào phân tử lượng, hàm lượng canxi trong phân tử alginate và nguồn gốc của rong

Độ nhớt của alginate khá ổn định trong khoảng pH = 5-10 Khi pH thấp hơn 4,5 thì độ nhớt của alginate tăng lên và thấp hơn 3,0 thì acid alginic không tan sẽ hình thành và kết tủa Trong các hệ có pH thấp trên 6,5 propylene glycol alginate tan tốt hơn

so với alginate Na, nhưng ở pH trên 6,5 propylene glycol alginate giảm chất lượng nhanh chóng Do đó propylene glycol alginate thường được ứng dụng ở vùng có pH thấp

Đặc tính chảy của alginate phụ thuộc vào nồng độ Dung dịch 2,5% alginate của loại có độ nhớt trung bình là một chất dẻo khi tốc độ trượt lớn Trong khi đó

dung dịch 0,5% của alginate cùng loại là một dịch Newton và chỉ là chất giả dẻo khi tốc độ trượt rất cao Tính chất giả dẻo của dung dịch alginate được ứng dụng trong sản xuất sơn

Một trong những tính chất quan trọng và hữu ích của alginate là khả năng phản ứng với các ion đa hóa trị để tạo gel Một ion hai hóa trị thường được sử dụng nhiều cho mục đích này là ion Ca++ Gel tạo thành chứa chủ yếu là nước 99 - 99,5% và 0,5

- 1% là alginate Đã có nhiều công trình nghiên cứu để làm rõ tính chất của các liên kết ngang và xác định cấu trúc của hạt gel

Trước kia người ta cho rằng việc tạo gel đơn giản chỉ là liên kết ion giữa hai nhóm carboxyl của hai chuỗi polymer gần nhau thông qua ion tạo gel như Ca++ Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy sự liên kết phức tạp hơn, cả với các nhóm hydroxyl Hiện nay mô hình tạo gel được chấp nhận rộng rãi nhất là mô hình

vỉ trứng

Hình 1.6 Mô hình tạo gel dạng vỉ trứng của alginate canxi

Do cấu trúc đặc biệt của phân đoạn poly guluronic, nó tạo thành dạng gấp nếp như vỉ trứng Khoảng không gian tạo thành giữa các vỉ khi xếp chồng lên nhau tương tự như chỗ đặt quả trứng, điểm đặc sắc ở đây là kích thước của khoảng trống này khá phù hợp với kích thước của ion Ca++

Việc tạo gel chủ yếu thực hiện ở các phân đoạn poly guluronic Do đó những alginate có tỷ lệ poly guluronic cao sẽ tạo gel tốt hơn, hạt gel cứng chắc hơn

Alginate được sử dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp Việc sử dụng alginate trong công nghiệp thực phẩm bắt đầu từ năm 1934 khi công ty Kelco giới thiệu alginate như là một chất ổn định cho kem Từ thời điểm đó việc sử dụng alginate trong công nghiệp thục phẩm tăng lên rất nhanh Cùng với sự phát triển của propylene glycol alginate vào năm 1944, alginate và propylene glycol alginate trở thành hai loại keo quan trọng nhất được sử dụng trong công nhiệp thực phẩm Trong công nghiệp thực phẩm alginate được sử dụng làm chất tạo đông, chất ổn định, nhũ tương hóa, tạo màng và tạo gel Những ứng dụng này đều dựa trên tính chất keo nhớt đặc biệt của hợp chất này Một số tổ chức như Hiệp hội dược phẩm và thực phẩm (FDA) của Mỹ đã xác định là alginate không độc hại khi sử dụng trong công nghiệp thực phẩm Alginate còn được ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác như: công nghiệp dược, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, xây dựng, khoan dầu,….Khó có thể liệt kê hết được những ứng dụng của alginate, nhưng hiện nay một vấn đề mới trong việc sử dụng alginate là ứng dụng của nó trong công nghệ sinh học

Một trong những ứng dụng quan trọng của alginate trong công nghệ sinh học

là dùng làm chất mang để cố định tế bào Kỹ thuật cố định tế bào là xu thế mới của công nghệ sinh học và tiềm năng của nó hiện đang được khai thác Phương pháp này bao gồm các ứng dụng từ việc cố định tế bào sống hoặc đã chết trong bình phản ứng sinh học, cố định các tế bào thực vật, cố định các tế bào thể lai để tạo các kháng nguyên đơn dòng, đến việc cố định các tế bào thực vật

Một số ứng dụng của alginate để cố định tế bào được thể hiện bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số ứng dụng của alginate trong kỹ thuật cố định tế bào

Tảo xanh - lục (blue - green algane)

Botryococcus braunii Hydrocarbons

Tế bào thực vật (Plant cells)

Chatharanthus roseus

Daucus carota

Các loài thực vật khác

Alkaloids Alkaloids Các hạt giống nhân tạo

Tế bào động vật có vú (mammalian cells)

Hybridoma

Fibroblasts

Lymphoma cells

Các kháng thể đơn dòng Interferon-β

Interferon-α

1.3.6 Các nghiên cứu về ứng dụng của alginate trong lĩnh vực cố định tế bào [13]

Khi nghiên cứu cố định tế bào có hai vấn đề quan trọng để có thể khai thác hiệu quả các tế bào cố định Thứ nhất là sản phẩm sau khi cố định phải có hoạt tính xúc tác sinh học mạnh và kéo dài Độ bền của sản phẩm cố định là điều quan trọng thứ hai

Đối với việc cố định các tế bào để lên men rượu thì các tác giả cũng tập trung vào hai vấn đề này Có nhiều phương pháp cố định tế bào và các chất mang khác

nhau dùng vào mục đích cố định Nhưng có lẽ phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất là bẫy các tế bào trong mạng lưới gel của alginate với ion đa hóa trị Việc tạo gel của alginate là do việc hình thành các liên kết ngang có chọn lọc với các ion đa hóa trị Tính chất chọn lọc là đặc trưng đối với các phân đoạn polyguluronat, còn đối với phân đoạn polymanuronat và luân hợp hầu như không có tính chất lựa chọn này Tính lựa chọn cao đối với các ion tương tự nhau như các kim loại kiềm thổ (Mg<< Ca << Sr << Ba) cho thấy sự tương tác giữa alginate và các ion này không hoàn toàn là tĩnh điện mà còn do một số tính chất phức tạp khác của phân đoạn polyguluronat do cấu trúc đặc biệt của phân đoạn này mang lại

Sự tạo gel của alginate có thể được tiến hành theo 2 phương pháp: phương pháp khuếch tán và phương pháp tạo gel bên trong

Phương pháp khuếch tán được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật cố định Theo phương pháp này các ion tạo gel ở bên ngoài giọt dung dịch alginate natri và khuếch tán vào bên trong giọt Như vậy quá trình tạo gel sẽ xảy ra bên trong giọt dung dịch alginate và sau đó phát triển vào bên trong Phương pháp này có đặc điểm là động học tạo gel nhanh và đặc điểm tạo gel nhanh đó được ứng dụng cho mục đích cố định các tác nhân hoạt tính như enzyme hay tế bào

Khi nhỏ một giọt dung dịch alginate natri vào dung dịch CaCl2, các ion Ca++ sẽ tác dụng rất nhanh với các phân tử alginate ở bề mặt giọt dung dịch vào quá trình tạo gel bắt đầu Vùng gel ở bề mặt sẽ tiến dần vào bên trong làm cho hạt gel bị co rút, nước thoát ra và thể tích giảm đi Hoạt tính của alginate và của ion tạo gel tại vùng này sẽ bằng không Cùng với sự liên kết giữa các phân tử trên bề mặt, sự tạo gel sẽ kéo các phân tử từ vùng trung tâm chưa tạo gel ra vùng có hoạt tính bằng không và làm cho nồng độ alginate tại trung tâm giảm đi Các ion Ca++ sau đó tiếp tục khuếch tán sâu vào bên trong lòng hạt gel nhưng vì nồng độ alginate ở trung tâm giảm đi nên mạng lưới gel ở trong thưa hơn Mặt khác do mạng lưới gel mặt ngoài dày hơn, sự khuếch tán của ion Ca++ vào sâu bên trong sẽ chậm hơn Quá trình tạo gel như vậy tạo nên sự không đồng thể của hạt gel Người ta thấy rằng sự phân bố alginate trên bề mặt có thể tăng lên 5 lần trong khi nồng độ alginate ở trung tâm

xem như bằng không Như vậy trong quá trình tạo gel có hai chuyển động ngược chiều nhau Thứ nhất là lớp gel bề mặt chuyển động dần về phía trung tâm Thứ hai

là alginate chuyển động từ trung tâm ra vùng hoạt tính bằng không và tạo nên vùng

có hàm lượng nước cao ở trung tâm hạt gel Quá trình tạo gel có thể được minh họa trên hình 1.7 :

Hình 1.7 Quá trình tạo gel alginate canxi theo phương pháp khuếch tán

Tính đồng thể của hạt gel có thể được điều chỉnh bằng các thông số chi phối quá trình tạo gel Tính không đồng thể lớn nhất có thể đạt được bằng cách dùng alginate có phân tử lượng thấp, nồng độ ion tạo gel nhỏ và không có mặt các ion không tạo gel Tính đồng thể lớn nhất có thể đạt khi alginate có phân tử lượng lớn

và nồng độ cao của cả hai loại ion tạo gel và không tạo gel Độ bền của hạt gel phụ thuộc vào nồng độ alginate, nồng độ ion tạo gel Khi nồng độ alginate và nồng độ ion tạo gel tăng lên thì độ bền hạt gel tăng lên, người ta cho thấy độ bền hạt gel không phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng của alginate Với alginate có phân tử lượng lớn hơn 100 kDa thì hầu như độ bền của hạt gel không phụ thuộc vào khối lượng phân tử alginate

Đối với phương pháp tạo gel bên trong, quá trình tạo gel dựa trên việc cho các ion tạo liên kết ngang ở dạng vô hoạt vào trong dung dịch alginate natri Ví dụ như ion canxi thì ở dạng CaCO3, CaSO4 hoặc ở dạng phức hợp với các tác nhân càng hóa như

Hướng dịch chuyển của alginate từ trung tâm ra ngoài

Ca++

EDTA, xitrat,…Khi thay đổi pH, các ion Ca++ sẽ được giải phóng ra dần dần Quá trình tạo gel chậm sẽ tạo ra gel có tính đồng thể cao

Hiện nay phương pháp phổ biến để cố định tế bào là phương pháp khuếch tán Phương pháp nhẹ nhàng này cho phép giữ được sự sống của các tế bào Nhưng các tác nhân gây càng hóa như photphat, đệm xitrat cũng dễ làm vỡ các hạt gel Khi nồng độ alginate tăng lên thì độ bền của hạt gel tăng lên nhưng khi nồng độ tế bào tăng lên thì

rõ ràng là có tác dụng ngược lại, khi nồng độ alginate tăng lên thì khả năng khuếch tán của các chất vào trong hạt gel giảm Nhiều thí nghiệm [18] đã cho thấy hạt gel chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ khuếch tán vào còn các chất có phân tử lượng lớn như protein, tinh bột thì không khuếch tán được vào trong hạt gel Hannoun & Stephanopoulous (1986) [18] cho thấy khả năng khuếch tán của glucoza và rượu etylic vào trong mạng lưới gel alginate 2% thì cũng tương tự như nước nhưng khả năng khuếch tán sẽ giảm đi khi nồng độ alginate tăng, nhưng Estape D và cộng sự cho thấy khi khuếch tán đồng thời glucoza và rượu etylic vào trong hạt gel thì hệ số khuếch tán đều giảm đi Đối với glucoza giảm 14% còn rượu etylic là 28% Rochefort Rehg & Chau (1986) [18] thấy rằng độ bền hạt gel tăng lên hai lần khi dùng Al(NO)3 0,1 M để

xử lý hạt gel alginate canxi Để tăng độ bền hạt gel Christian Vogelsang & Kjetill Ostgaard còn bổ sung các ion Ca++, Ba++ vào môi trường xung quanh hạt gel [16]

Để tạo hạt gel khá bền nhiều tác giả sử dụng dung dịch alginate 2% để tạo gel Nicolas M Veling & Michele M, Mestdagh [17] đã nghiên cứu các tính chất hóa lý của hạt gel và cho thấy độ bền của hạt gel phụ thuộc vào nồng độ cation tạo gel, sự co rút, pH,… Sự co rút hạt gel cũng được tác giả Ngô Đăng Nghĩa nghiên cứu [9]

Nồng độ đường trong môi trường lên men thì nằm trong khoảng 5-20% Một số tác giả sử dụng nồng độ 25% nhưng tốc độ phản ứng cũng không tăng hiệu suất Nguồn nguyên liệu để lên men cũng rất đa dạng từ nguyên liệu glucoza, rỉ đường, dịch sữa đến dịch chiết trái cây

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu chính - rỉ đường

Rỉ đường được thu mua từ nhà máy đường Khánh Hòa

Hình 2.1 Rỉ đường sau khi thu mua

Nấm men Saccharomyces cerevisiae, có đặc tính chịu được độ cồn cao khoảng

130-150, được phân lập và nuôi cấy tại phòng vi sinh trường ĐH Nha Trang

2.1.3 Các dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Khúc xạ kế: tên thiết bị: ATC- 3E, Bix: 0-0.32%, hiệu: ATAGO sản xuất tại Nhật Bản

- Khúc xạ kế: tên thiết bị: ATC- 1E, Bix: 0-0.32%, hiệu: ATAGO sản xuất tại Nhật Bản

- Giấy đo pH

- Cân phân tích

- Cân điện tử

- Máy ly tâm

- Bộ chưng cất rượu

- Máy đo DO Oxi200

- Các thiết bị khác dùng trong các phương pháp xác định

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Điều chỉnh thành phần

ở 20-22oBx

Thanh trùng dịch ở 121oC, 15phút