Tạo chủng và kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng salmonella choleraesuissmith mang gen crp đột biến

Các vắc-xin này là sinh vật không gây bệnh được cải biến để mang và biểu hiện quyết định kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh đích hoặc chủng cải biến của sinh vật gây bệnh trong đó gen độc

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TẠO CHỦNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA CHỦNG

Salmonella choleraesuis Smith NHƯỢC

GVHD : TS VŨ KHẮC HÙNG

Th.S LÊ ĐÌNH ĐỨC

SVTH : NGUYỄN HOÀNG OANH Lớp : 50 CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khoá : 50

Nha Trang, tháng 6 năm 2012

trường Đại học Nha Trang, một trong những trường có bề dày truyền thống trên 50 năm

Xin được gửi lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới Tiến sĩ Vũ Khắc Hùng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Phân viện Thú Y miền Trung, và Thạc sĩ Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường,

đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện

và hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Phân viện Thú Y miền Trung, đặc biệt là anh Đỗ Văn Tấn và chị Đào Hoài Thu đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, giúp tôi hoàn thành khóa học và đồ án tốt nghiệp này

Nha Trang, tháng 7 năm 2011

Sinh viên

NGUYỄN HOÀNG OANH

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU viii

Chương 1 Tổng quan 1

1.1 Bệnh phó thương hàn lợn 1

1.1.1 Cơ chế sinh bệnh 3

1.1.2 Phương thức lây truyền 3

1.1.3 Triệu chứng 4

1.1.4 Bệnh tích 4

1.1.5 Chẩn đoán bệnh 4

1.1.6 Phòng và trị bệnh 6

1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith 7

1.2.1 Đặc điểm hình thái 8

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 8

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 9

1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 10

1.2.5 Sức đề kháng 13

1.2.6 Tính gây bệnh 14

1.3 Gen CRP 15

1.4 Phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 19

1.4.1 Nguyên tắc chung 19

1.4.2 Quy trình tạo DNA tái tổ hợp 20

1.5 Tình hình nghiên cứu gây đột biến trên một số gen gây bệnh của Salmonella 21

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2.1 Vật liệu và môi trường 24

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Tách chiết plasmid 27

2.3.2 Tách chiết genome 28

2.3.3 Chiết tách, tinh sạch DNA 27

2.3.4 Phản ứng PCR nhân đoạn gen crp 30

2.3.5 Phản ứng cắt với enzyme giới hạn 31

2.3.6 Phản ứng lai ghép 32

2.3.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli JM109 và E.coli χ7213 32

2.3.8 Tạo chủng E.coli χ7213 khả biến 33

2.3.9 Tiếp hợp E.coli χ7213 và Salmonella choleraesuis 34

2.3.10 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa 35

Chương 3 Kết quả và thảo luận 37

3.1 Tạo chủng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 38

3.1.1 Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo - polymerase 38

3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 39

3.2 Tạo dòng plasmid tái tổ hợpẠO pRE112/Δcrp 40

3.3 Tạo chủng S choleraesuis Smith mang gen crp đột biến 41

3.3.1 Tiếp hợp E.coli χ7213/pRE112/Δcrp với S choleraesuis 41

3.3.2 Sàng lọc dòng tế bào S choleraesuis mang gen crp đột biến 42

3.4 Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis nhược độc mang gen crp đã bị đột biến 44

3.4.1 Tốc độ sinh trưởng 44

3.4.2 Đặc tính sinh hóa 45

3.4.3 Tính ổn định của chủng đột biến 47

3.4.4 Giám định kháng nguyên H, O 48

3.4.5 So sánh trình tự gen của S choleraesuis Smith và S choleraesuis/Δcrp 48

Kết luận và kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella 9

Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo Kauffman (1972) ) 12

Bảng 1.3 Các gen bị mất và chức năng của chúng trong phát triển các chủng Salmonella spp đã giảm độc lực 22

Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26

Bảng 2.2 Thành phần của bộ kit QIApre spin Miniprep Kit của QIAgen 28

Bảng 2.3 Thành phần của bộ kit Blood&Tissue Extraction của QIAgen 27

Bảng 2.4 Thành phần của bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen 30

Bảng 2.5 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 30

Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE) 31

Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt plasmid bằng enzyme RE 32

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng lai ghép sử dụng T4 ligase 32

Bảng 3.1: Các đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis Smith và S.choleraesuis/Δcrp 47

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ

Hình 1.1 Lợn con 3 tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis 2

Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn S choleraesuis [31] 8

Hình 1.3 Khuẩn lạc S choleraesuis trên thạch máu 24 giờ 9

Hình 1.4 Cấu trúc cAMP 15

Hình 1.5 Class I CAP-dependent promoter activation 16

Hình 1.6 Class II CAP-dependent promoter activation 16

Hình 1.7 Class III CAP-dependent promoter activation 16

Hình 1.8 Mối liên hệ giữa lượng đường và nồng độ cAMP.(Nguồn Scitable by nature education) 18

Hình 1.9 Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp với vector là plasmid, tế bào nhận là E.coli 20

Hình 1.10 Sàng lọc dòng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp thành công dựa vào gen kháng Ampicilin 21

Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là DNA tổng số của vi khuẩn S choleraesuis với cặp mồi Pr1F-Pr2R, và Pr3F-Pr4R trên gel agarose 1,2%. 38

Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết vector pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN plasmid của 4 dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với BamHI/XbaI (B) và 3 dòng pBSIIK(+)/Δcrp (C) với XhoI/KpnI 40

Hình 3.3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân lên từ khuôn là plasmid tái tổ hợp pBSIISK+/Pr12-1/Pr34-1 bằng cặp mồi Pr1F-Pr4R trên gel agarose 1,2% 40

Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 5 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pRE112/Δcrp bằng cặp enzyme XbaI và KpnI trên gel agarose 1,2% 41

Hình 3.5 Các khuẩn lạc S choleraesuis sau khi tiếp hợp với E.coli χ7213/pRE112/Δcrp-4 mọc trên môi trường chọn lọc LB + Cm 42

Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S choleraesuis 539/Δcrp (1), S choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với cặp mồi

Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2% 43

Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của S.chorelasuis Smith và S chorelasuis 539/Δcrp

sau 24h nuôi cấy 44

Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của các chủng S choleraesuis Δcrp và S

choleraesuis Smith trong 10 giờ nuôi cấy 45

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis Smith và

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 CIP Calf alkaline phosphatase

2 Cm Chloramphenicol

3 Cmr Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol

4 Crp cAMP receptor protein

5 Δcrp gen crp bị đột biến

6 CAP catabolite activator protein - Protein hoạt hóa dị hóa

7 Asd aspartate β–semialdehyde dehydrogenase

8 LB Luria – Bertani

9 ST Stable toxin –Độc tố chịu nhiệt

10 PBS Phosphate buffer saline – Đệm Phosphate

MỞ ĐẦU

Salmonella choleraesuis là nguyên nhân gây ra hàng loạt dịch bệnh gây chết ở

lợn, đồng thời cũng là nguyên nhân dẫn đến nhiễm trùng máu và tử vong ở người

(Jean và cộng sự, 2006) Phòng bệnh do S choleraesuis gây ra là ưu tiên hàng đầu của nhà chăn nuôi Việc sử dụng chủng Salmonella nhược độc làm vắc-xin đang

được quan tâm, chú ý trong những năm gần đây vì vắc-xin nhược độc hiệu quả hơn nhiều so với vắc-xin chết hay vắc-xin tiểu phần trong việc kích thích hệ thống miễn dịch ở lợn

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin, trong đó hai loại vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất Vắc-xin vô hoạt ít hiệu quả hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [15] Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin sống nhược độc Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra bằng cách sử dụng các tác nhân lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn [18, 28] Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắc-xin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp

Kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để tạo ra các sinh vật cải biến dùng làm vắc-xin tái tổ hợp sống Các vắc-xin này là sinh vật không gây bệnh được cải biến

để mang và biểu hiện quyết định kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh đích hoặc chủng cải biến của sinh vật gây bệnh trong đó gen độc đã được cải biến hoặc loại

bỏ Trong trường hợp này, như là thành phần của vi khuẩn, các quyết định kháng nguyên quan trọng có mặt trong hệ miễn dịch có thành phần rất giống với dạng kháng nguyên ở sinh vật gây bệnh [1]

Gen crp mã hóa CAP-protein hoạt hóa trao đổi chất kết hợp với cAMP tạo

phức cAMP-CAP, phức này liên kết với promoter gây hoạt hóa sao mã các gen cấu

trúc Thể đột biến gen crp không sao mã được mRNA của operon lac, dẫn đến

không tham gia chuyển hóa năng lượng, gây kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của

S choleraesuis

Như vậy, việc tạo chủng S choleraesuis mang gen crp bị đột biến phục vụ cho

việc sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn là việc cấp thiết Do đó tôi tham gia thực hiện đề tài “Tạo chủng và kiểm tra đặc tính

sinh hóa chủng Salmonella choleraesuis Smith mang gen crp đột biến”

Mục tiêu của đề tài

- Tạo chủng plasmid pRE112/Δcrp Chuyển nạp plasmid pRE112/Δcrp vào

chủng S cholerasuis Smith nhược độc gây đột biến gen crp

- Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis Smith mang gen crp

đột biến

Nội dung nghiên cứu

- Tạo dòng plasmid pER112/Δcrp

- Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pER112/Δcrp

-Chuyển nạp plasmid pER112/Δcrp vào chủng S chorelasuis nhược độc gây đột biến gen crp

- Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp

- Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis nhược độc mang gen

crp bị đột biến

Ý nghĩa của đề tài

Tạo chủng Salmonella cholerasuis Smith nhược độc mang gen crp đột biến

làm chủng biến nạp để từ đó có thể tiếp tục nghiên cứu sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn

Chương 1 Tổng quan

1.1 Bệnh phó thương hàn lợn

Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ Hiện nay, thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam

Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo quyết định của Thủ tướng chính phủ số 10/2008/QĐ-TTg, (2008), chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con năm

2015 và lên 34.7 triệu con năm 2020 Sản lượng thịt hơi từ 3.1 triệu tấn năm 2010, lên 3.9 triệu tấn năm 2015 và 4.8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191.3 ngàn tấn năm 2010; 2794.7 ngàn tấn năm 2015 và 3493.1 ngàn tấn năm 2020 Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5.8 triệu con (chiếm 19.3%) năm 2010, lên 8.9 triệu con (chiếm 27.0%) năm 2015 và lên 12.9 triệu con (chiếm 37.0%) năm

2020 Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135.2 ngàn tấn (chiếm 36.5%) năm 2010; 1851.5 ngàn tấn (chiếm 47.2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59.2%) năm 2020

Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác nghiên cứu, phát triển giống, thức ăn, xây dựng các chương trình quản lý; đặc biệt nhiệm vụ của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn Trong đó việc tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở lợn có hiệu quả là điều hết sức quan trọng

Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn

vệ sinh thực phẩm Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó

thương hàn do vi khuẩn Salmonella và phù đầu do vi khuẩn E.coli gây ra

Bệnh phó thương hàn là bệnh truyền nhiễm xảy ra chủ yếu ở lợn 2- 4 tháng

tuổi Bệnh do trực khuẩn Salmonella cholereasuis chủng Kunsendorf (thể cấp tính)

và Salmonella typhi suis chủng Vondagsen (thể mãn tính) Đây là vi khuẩn đường

ruột tác động chủ yếu trên đường tiêu hoá gây ra các triệu chứng và bệnh tích như

viêm ruột, dạ dày, lách sưng to Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây

thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người [22, 29]

Hình 1.1 Lợn con 3 tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis

Bệnh xảy ra ở khắp nơi, tạo thành những ổ dịch lẻ tẻ, thường gặp ở những vùng chăn nuôi có điều kiện vệ sinh kém đặc biệt là vùng sản xuất lợn giống Ở

nước ta chứng viêm ruột tiêu chảy do Salmonella rất dễ xảy ra trên lợn, bệnh được

phát hiện ở tất cả các tỉnh trong cả nước và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Khi điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột ở một số trại chăn nuôi cho thấy:

82-100% số lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella và trên lợn khoẻ cũng mang vi khuẩn

này với một tỷ lệ nhất định [6] Phân lập vi khuẩn từ phân lợn tiêu chảy cũng cho

thấy: tỷ lệ xuất hiện vi khuẩn Salmonella trung bình là 80%, biến động trong khoảng 73%-85% [9] Điều tra tình hình nhiễm Salmonella của lợn vùng Tây

Nguyên cho thấy: bình thường, lợn 2-4 tháng tuổi nhiễm 32,66%; lợn 4-8 tháng tuổi nhiễm 14,70% và lợn nái nhiễm 18,35% Ở lợn bị tiêu chảy mật độ vi khuẩn

Salmonella trong cơ thể tăng rõ rệt ở ruột 80%, lách 20% [8] Tình trạng nhiễm Salmonella thay đổi theo sự tiến triển của bệnh, cụ thể tiêu chảy 1-3 ngày nhiễm

60%, 8-12 ngày nhiễm 100% Trong trường hợp lợn con mắc bệnh phân trắng, tỷ lệ

nhiễm Salmonella có thể lên tới 25% Tác giả nhận xét : vi khuẩn Salmonella có thể

tìm thấy ở mọi lứa tuổi lợn, xong chủ yếu là lợn 2-4 tháng tuổi Trong cơ thể lợn, vi khuẩn có nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa và đường bài xuất chính ra bên ngoài là

đường tiêu hóa Cũng chính từ đó, Salmonella lại nhiễm vào thức ăn, nước uống để

nhiễm trở lại đường tiêu hóa

1.1.1 Cơ chế sinh bệnh

Bệnh phó thương hàn do tác nhân là vi khuẩn Salmonella Thời kì ủ bệnh từ

3-6 ngày, có khi kéo dài đến tuần lễ hay một tháng tuỳ thuộc vào số lượng vi khuẩn

xâm nhập vào, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể S choleraesuis vào

cơ thể theo đường tiêu hoá vào hầu, ruột Vi khuẩn sinh sản và chui qua niêm mạc

dạ dày, ruột, gây thuỷ thủng hoại tử cục bộ xuất huyết gây viêm ruột, viêm dạ dày sau đó vi khuẩn xâm nhập vào các tổ chức lâm ba gây phản ứng hạch viêm, sưng hạch và từ đó vào máu gây bại huyết Ở những con vật qua khỏi bệnh vi khuẩn có khuynh hướng khu trú ở một số phủ tạng như gan đặc biệt ở hạch lâm ba Nội độc

tố của Salmonella đóng vai trò rất lớn trong quá trình gây bệnh Nội độc tố ảnh

hưởng đến plasma, khả năng đông máu Phản ứng viêm xảy ra đầu tiên, kích thích tiểu cầu và tấn công bạch cầu Sốt và trúng độc máu cũng là hai triệu chứng gây ra trực tiếp do nội độc tố

1.1.2 Phương thức lây truyền

Bệnh phó thương hàn lợn là bệnh ở đường tiêu hóa nên đường lây truyền chủ yếu của bệnh là qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn Khi lợn ăn phải thức ăn, nước uống có vi khuẩn thì sẽ nhiễm khuẩn và có khả năng phát bệnh

Bệnh này chủ yếu gặp ở lợn con từ 2-4 tháng tuổi Đặc biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người và các động vật nuôi khác như gia cầm, cừu,…

1.1.3 Triệu chứng

 Thể cấp tính

Khi lợn mắc bệnh thể cấp tính thì có triệu chứng như sốt cao từ 40–410C, chót tai lạnh, kém ăn, táo bón Phân lợn có màu đen, màng nhày bao quanh phân Lợn con có thể có triệu chứng tiêu chảy phân có màu vàng, sệt lẫn máu và rất hôi thối Lợn nhiễm bệnh thường nằm co trên 4 chân, bụng nổi gai ốc, lông dựng Ngoài ra lợn cũng có các triệu chứng khác như thở khó và nhanh, tim đập yếu Trên da xuất huyết thành từng nốt đỏ ửng rồi chuyển sang tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi Tốc độ lây lan trong chuồng chậm, tốc độ gây chết chậm, nhưng bệnh làm lợn mất sức suy kiệt, còi cọc Sau 1-2 tuần nhiễm bệnh, lợn bị suy kiệt dần, tiêu chảy nặng và có thể chết Lợn nái trong thời kỳ mang thai mắc bệnh có thể dẫn đến sẩy thai

 Thể mãn tính

Lúc đầu lợn nhiễm bệnh không có triệu chứng điển hình, sau đó biếng ăn, gầy yếu, xanh xao; tới bữa chỉ liếm láp chứ không ăn, uống nước nhiều và trên da có những mảng đỏ hoặc tím bầm Lợn bị táo bón, đi phân thường phải rặn nhiều Thể mãn tính thường xảy ra ở lợn lớn Lợn nái trong thời kỳ mang thai bị bệnh có thể dẫn đến sẩy thai, hoặc nếu sinh ra lợn con cũng gầy yếu

1.1.4 Bệnh tích

Khi mổ khám kiểm tra bệnh tích của lợn mắc bệnh phó thương hàn, chúng ta thường thấy các biểu hiện bệnh tích đặc trưng ở đường tiêu hóa như: niêm mạc ruột già hoại tử, bong từng mảng; van hồi manh tràng có các vết loét, có bờ và có hình cúc áo

1.1.5 Chẩn đoán bệnh

 Chẩn đoán lâm sàng

Ở thể cấp tính: lợn sốt cao, chết nhanh; viêm dạ dày ruột; lách sưng to, đàn hồi, dai như cao su, có màu xanh sẫm; gan sưng, có ổ hoại tử; xuất huyết ở thận, tương mạc

Ở thể mãn tính: lợn bị tiêu chảy dai dẳng, gầy còm, suy nhược; chết do kiệt sức, viêm ruột, gan, phổi

 Chẩn đoán phân biệt

Phân biệt với bệnh bệnh dịch tả: bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, lây lan mạnh, tỷ

lệ chết cao (>90%), tiêu chảy nặng, có máu tươi mùi thối khắm, chảy nước mũi đặc, viêm kết mạc và giác mạc, nằm chùm nhum, bại liệt; bệnh tích: xuất huyết da, phổi viêm tụ máu, gan hóa từng vùng, viêm loét hình cúc áo sâu có vòng fibrin đồng tâm

ở ruột già (ở bệnh phó thương hàn: mụn loét bằng phẳng nông, thành ruột già dày

và cứng lại, màu xám hoặc đen), lách nhồi huyết, vỏ thận xuất huyết đinh ghim

 Chẩn đoán vi khuẩn học

- Soi kính bệnh phẩm: thấy trực khuẩn ngắn, gram âm

- Nuôi cấy bệnh phẩm trong các môi trường phân lập vi khuẩn đường ruột

- Nếu số lượng vi khuẩn trong phân ít thì cấy vào môi trường tăng sinh, Mule kofman, để tủ ấm 370C trong 18 - 24 giờ, rồi mới cấy ria trên môi trường phân lập

- Nếu trong máu có ít vi khuẩn thì cấy nhiều máu vào bình nước thịt 50ml có 1% glucose và nước mật bò, để tủ ấm 370C trong 1 - 2 tuần lễ rồi mới cấy vào môi trường phân lập

- Giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn đã phân lập

- Tiêm động vật thí nghiệm (thỏ, chuột bạch, chuột lang) Bệnh phẩm sẽ làm chết con vật sau 6 - 10 ngày

 Chẩn đoán huyết thanh học

Dùng kháng nguyên vi khuẩn đã phân lập được làm phản ứng ngưng kết trên

phiến kính với kháng huyết thanh Salmonella đa giá A - E, kháng huyết thanh O và

H của nhóm C1 và cuối cùng với kháng huyết thanh S choleraesuis, hiệu giá phải

trên 1/100 mới dương tính (hiệu giá ngưng kết tối thiểu)

Có thể phát hiện ngưng kết tố trong lợn bệnh, nhưng những kháng thể này chỉ xuất hiện từ ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh

 Ngoài ra cũng có thể làm các phản ứng khác như PCR, ELISA,…để tìm ra vi khuẩn gây bệnh

- Thực hiện chặt chẽ quy trình vệ sinh chuồng trại, định kì tiêu độc khử trùng…

- Loại trừ các yếu tố làm giảm sức đề kháng của lợn như thời tiết khí hậu, vận chuyển

- Đảm bảo đúng mật độ nuôi ở từng lứa tuổi và giai đoạn sinh lí của vật nuôi

- Tránh thay đổi thức ăn đột ngột, phải lựa chọn thức ăn đảm bảo dinh dưỡng

Do nhiều yếu tố tác động nên những con bệnh tiềm ẩn phát bệnh và trở thành nguồn lây lan cho đàn như nhốt qúa trật trội, stress do vận chuyển, loại thức ăn có nhiều Salmonella (bột thịt) cho nên thường xuyên quan tâm vấn đề này

 Tiêm phòng vắc-xin:

Tuân thủ quy trình tiêm vắc-xin phòng bệnh Phó thương hàn cho đàn lợn Hiện nay trên thị trường có các loại vắc-xin phòng bệnh Phó thương hàn như: vắc-xin phó thương hàn nhược độc đông khô, vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt keo phèn

 Ngoài ra cũng cần tăng cường khâu chăm sóc nuôi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho đàn lợn

1.1.6.2 Trị bệnh

Chưa có biện pháp đìều trị có hiệu quả cao Thông thường chỉ nên điều trị những trường hợp nhẹ, tiến triển chậm

Có thể dùng huyết thanh phó thương hàn lợn, tiêm liều 30 - 50ml/lợn >1.5 tháng

Chloramphenicol 10%, chlotetrasone, oxycaf, biocortyl O.P.C, T.P.C, tylo P.C, tylo D.C liều: 1 – 1.5ml/10 kg thể trọng (20 mg/ kg)

Kết hợp đìều trị triệu chứng tiêu chảy như: Atropin, Kaolin

Ngoài ra phải dùng các loại thuốc bù các chất điện giải và mất nước như dung dịch Sodium Bicarbonate 5%, nước muối sinh lý (0,9%)

1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith

S choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn lợn

Lợn bị nhiễm S choleraesuis không chỉ bị viêm dạ dày, ruột mà gây chết biểu hiện

bao gồm viêm phổi, viêm gan, viêm màng não [22]

Vi khuẩn được phân lập lần đầu tiên trên lợn vào năm 1885 do Salmon và Smith [20]

Phân loại khoa học của S.choleraesuis :

Giới (regnum) : Bacteria

Ngành (phynum : Proteobacteria

Lớp (class) : Gamaproteobacteria

Bộ (ordo) : Enterobacteriales

Họ (familia) : Enterobacteriaceae Chi (genus) : Salmonella

Loài (species) : S.choleraesuis

1.2.1 Đặc điểm hình thái

S choleraesuis là một loại vi khuẩn hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước

0,4–0,6µm x 1–3µm, không có khả năng hình thành giáp mô và nha bào Có khả năng di động mạnh do có từ 8 -12 tiêm mao xung quanh thân Vi khuẩn dễ bắt màu thuốc nhuộm, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu [7]

Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn S choleraesuis [31]

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Trên thạch: sau khi nuôi cấy 24 giờ, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25–

30oC) từ 1 đến 2 ngày sau, hình thành một bờ chất dính lầy nhầy ở xung quanh Trên mặt thạch thỉnh thoảng xuất hiện khuẩn lạc R nhám, mặt không bóng, không đều, mờ [7]

Hình 1.3 Khuẩn lạc S choleraesuis trên thạch máu 24 giờ [32]

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa

S choleraesuis có khả năng chuyển hoá các loại đường như : glucose,

levulose, galactose, mannitol, xyclose, rhamnose, lactose, maltose, arabinose, dextrin; sinh hơi [7] Một số đặc tính sinh hóa thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella

Loài vi khuẩn Xylose Arabinose Trehalose Inositol Mantose Sinh

S choleraesuis thuộc nhóm C trong bảng phân loại Salmonella của Kauffman

có công thức kháng nguyên như sau:S VI, VII : c–1,5 [7]

 Kháng nguyên O

 Cấu tạo :

Kháng nguyên thân O nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn Tính chất đặc thù của kháng nguyên này được xác định bởi thành phần cấu trúc Lypopolysaccharide (LPS) bao gồm hai nhóm:

- Nhóm LPS nằm bên trong không mang tính đặc trưng của kháng nguyên mà

có vai trò tạo ra sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough)

- Nhóm LPS nằm ngoài quyết định tính kháng nguyên và đặc trưng cho từng chủng vi khuẩn

Khi thủy phân phân tử Lypopolysaccharide người ta thu được 5 loại đường là: heptose, 2-keto-3 dexyoctonate (KDO), glucose, galactose và glucosamine Qua nghiên cứu người ta xác định kháng nguyên O có bản chất là các chuỗi đường nằm

trên phân tử Lypopolysaccharide mà đơn vị cơ bản của nó là Oligosaccharide, đây

là những đường đa (một phân tử Oligosaccharide được cấu tạo từ 2-10 phân tử đường đơn mongosaccharide)

Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy kháng nguyên O

của Salmonella có 65 thành phần khác nhau Một loài Salmonella có thể có một

hoặc nhiều yếu tố đó Mỗi thành phần được đánh dấu bằng chữ số La mã hay số Ả Rập

Dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên O của các Salmonella mà người

Kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella là kháng nguyên chịu nhiệt Ở nhiệt

độ 1000C, kháng nguyên bị hủy sau 24 giờ Kháng nguyên O có thể chịu được cồn

500 và axit HCL 1N trong 24 giờ, nhưng bị phá hủy bởi focmon nồng độ 5% [5] Kháng nguyên có tính độc Chuỗi polysaccarit khi mất dần phân tử đường hay

có sự thay đổi vị trí làm cho độc lực của vi khuẩn bị thay đổi Kháng nguyên O liên

hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch của cơ thể

Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là hiện tượng ngưng kết O Thân vi khuẩn ngưng kết với nhau thành những hạt nhỏ, lắc khó tan

 Kháng nguyên H

 Cấu tạo :

Có ở trên lông vi khuẩn, bản chất protein cấu trúc gần giống miozin của cơ

Kháng nguyên H chia làm 2 pha [4]:

- Pha 1 có tính chất đặc hiệu, gồm 28 kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữ mẫu Latin thường: a, b, c, d…z

- Pha 2 không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với loại khác Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập 1, 2, 3, 4,

5, 6 hay chữ Latin thường e, n, x…

 Đặc tính :

Là kháng nguyên kém chịu nhiệt (60oC/1h), dễ bị tác động bởi cồn 500(bị phá

huỷ) Đề kháng với focmon 5%o vẫn tồn tại Khi kháng nguyên H gặp kháng thể H

làm cho vi khuẩn ngưng kết lại: lông- kháng thể- lông biểu hiện như cụm bông nhỏ Ngưng kết không bền, dễ tan khi lắc ở vi khuẩn đường ruột Kháng nguyên H không liên quan đến yếu tố độc lực, không có ý nghĩa tạo miễn dịch, chỉ có ý nghĩa trong quá trình phân loại

Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo

Kauffman (1972) )

Kháng nguyên H Nhóm huyết

Kháng nguyên O Pha 1 Pha 2

Vi khuẩn Salmonella rất mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng, các chất

sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, HgCl 1/500, Focmon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15–20 phút Nhưng đối với một số hóa chất như Cristal Violet, xanh Malachit, NatriHhyposulfit,Ddixitrat, muối mật với

những nồng độ vừa đủ gây độc cho E.coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của

Salmonella Dựa vào tính chất này người ta chế tạo những môi trường chọn lọc để

kìm hãm sự phát triển của E.coli và giúp cho Salmonella có thể phát triển dễ dàng

Vi khuẩn có sức đề kháng yếu với nhiệt độ, bị tiêu diệt sau 600C trong 1giờ hay 750C trong 5 phút Nếu chiếu ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn sau

5 giờ [9]

Salmonella có thể tồn tại vài năm trong môi trường thích hợp Vi khuẩn có thể

tồn tại trong chất độn chuồng 30 tuần, trong phân vịt 28 tuần, trong máy ấp ở nhiệt

độ phòng tới 5 năm Vi khuẩn có thể sống trong đất ở độ sâu 5m trong vòng 2 tháng

và có thể tồn tại trong máng gỗ 108 ngày[2] Salmonella có thể sống trong thịt ướp

muối (nồng độ khoảng 29%) được 4-8 tháng ở nhiệt độ từ 6–12oC [2]

1.2.6 Tính gây bệnh

Độc tố đường ruột của Salmonella sản sinh ra có hai thành phần: độc tố thẩm

xuất nhanh và độc tố thẩm xuất chậm

Độc tố thẩm xuất nhanh của Salmonella có cấu trúc và hoạt tính giống với độc

tố chịu nhiệt ST (Stabletoixin) của E coli Độc tố này có trọng lượng phân tử hơn

90000 dal, chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ nhưng bị phá hủy nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp, thậm chí có thể bảo quản ở nhiệt độ -200C Cấu trúc phân tử bao gồm polysaccarit và một số polypeptit Cơ chế gây bệnh của độc tố

này là giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột Độc tố chịu nhiệt

thực hiện khả năng thẩm xuất nhanh sau 1–2 giờ và có thể kéo dài 48 giờ

Độc tố thẩm xuất chậm có cấu trúc thành phần giống độc tố không chịu nhiệt

của E.coli cho nên thường gọi nó là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella LT

(Labiletoxin), nó bị phá hủy ở 700C /30 phút và 560C /4 giờ, điểm đẳng diện bằng 4 Cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptit và một số hợp chất khác Trọng lượng phân tử

44.000- 50.000 thậm chí đến 70.000 dal LT của Salmonella làm thay đổi quá trình

trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến rút nước từ cơ thể vào ruột non, gây tiêu chảy LT thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18-24 giờ, có thể kéo dài tới 36–

48 giờ

Ăn phải vật chứa Salmonella là con đường nhiễm chủ yếu Động vật bị nhiễm, động vật mang bệnh làm rơi vãi Salmonella theo phân là nguồn lây nhiễm

Salmonella trong đàn và giữa các đàn S cholerasuis rất hiếm khi được phân lập từ

thức ăn Vì thế, lợn bị nhiễm bệnh hoặc các vật ô nhiễm vi khuẩn (trừ thức ăn) chắc chắn là nguồn lây nhiễm chủ yếu nhất Những lợn khỏe mang trùng là phương tiện thông thường để vi khuẩn xâm nhập vào đàn.Ở đàn lợn bị tiêu chảy cấp tính do

Salmonella cholerasuis, có thể thải ra hàng triệu vi khuẩn trong 1 gram phân

Các ổ dịch Salmonella choleraesuis thường liên quan đến các nhân tố gây

stress như: nhốt lẫn, quá chật, vận chuyển, khí hậu khắc nghiệt, thay đổi thức ăn, ký sinh trùng và các bệnh xảy ra cùng một lúc

 Khả năng xâm nhập và nhân lên

Nhờ yếu tố này vi khuẩn mới xuyên qua được lớp màng nhày của ruột xâm nhập vào tế bào biểu mô Khả năng xâm nhập vào tế bào Eukaryota và vào lớp

mucosa đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella cường độc Vi khuẩn

Salmonella có 13 protein giúp vi khuẩn xâm nhập Các biến chủng của Salmonella

không có khả năng xâm nhập vào tế bào, thường là các chủng không có độc lực

Vi khuẩn xâm nhập vào trong tế bào Eukaryota là bước cần thiết tạo khả năng độc lực Đây là quá trình tổng hợp gồm nhiều quá trình tham gia

Trên bề mặt tế bào thấy xuất hiện nhiều loại protein do vi khuẩn sản sinh ra cần cho quá trình xâm nhập và vai trò độc lực.Sau khi xâm nhập được vào vào

trong tế bào, vi khuẩn Salmonella tiếp tục xuyên bào (transcytose) qua mặt đối diện

của tế bào, thời gian đòi hỏi cho quá trình xuyên bào tối thiểu là 4 giờ Khả năng

sống sót và nhân lên của vi khuẩn Salmonella trong tế bào Eukaryota phụ thuộc vào

các chất dinh dưỡng khác nhau chứa trong tế bào vật chủ Quá trình sinh tổng hợp purine của vi khuẩn biến dị, có thể xuất hiện các chủng nhược độc Các chủng

Salmonella biến dị thì có độc lực thấp, thường được dùng để chế tạo vắc-xin

1.3 Gen CRP

cAMP receptor protein (CRP) (còn được gọi là catabolite activator

protein_CAP) là một gen điều hòa ở vi khuẩn [14]

Hình 1.4 Cấu trúc cAMP [33]

Các gen được quy định bởi CRP chủ yếu tham gia chuyển hóa năng lượng từ

những cơ chất như galactose, citrate Ngoài ra gen này còn mã hoá sinh tổng hợp cAMP receptor, protein hoạt hóa dị hóa CAP (catabolite activatorprotein), kiểm soát

sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình trao đổi năng lượng [26]

Ở lớp 1, CRP liên kết với promoter kích hoạt phiên mã thông qua sự liên kết giữa “vị trí kích hoạt thứ 1” của gen CRP và RNA polymerase alpha

Hình 1.5 Class I CAP-dependent promoter activation (nguồn Interpro)

Ở lớp 2, CRP liên kết với promoter gắn ở 1 vị trí DNA trùng với điểm -35 của

promoter, kích hoạt phiên mã thông qua tương tác giữa protein-protein: (1)sự tương

tác giữa” khu vực kích hoạt phiên mã 1” của CRP với đuôi C của RNA polymerase,

và (2)sự tương tác giữa “khu vực kích hoạt phiên mã 2” của CRP với đuôi N của

RNA polymerase

Hình 1.6 Class II CAP-dependent promoter activation (nguồn Interpro)

Ở lớp 3, CRP cùng với 1 hay nhiều protein đồng kích hoạt phiên mã

Hình 1.7 Class III CAP-dependent promoter activation (nguồn Interpro)

CAP liên kết với promoter của operon lac kích thích phiên mã CAP phải tạo

phức hợp với cAMP trước khi liên kết với promoter nhằm tạo điều kiện thuận lợi để RNA polymerase liên kết với DNA Nồng độ cAMP tỷ lệ nghich với nồng độ đường: lượng đường thấp thì nồng độ cAMP cao, lượng đường cao thì nồng độ cAMP thấp

CRP có chức năng tiết T3SS SPI-1, là một trong những yếu tố quyết định độc

lực của vi khuẩn Salmonella, giúp Salmonella xâm nhập vào các tế bào biểu mô

đường ruột Bằng cách tiết hơn 10 loại protein khác nhau tác động vào tế bào vật chủ thông qua SPI-1 T3SS, tác dụng trên các thành phần hoặc cấu trúc của thành tế

bào làm giảm tính thấm của muối mật hoặc gentamicin Salmonella tích cực xâm

nhập niêm mạc ruột và gây ra viêm ruột trong các vật chủ Hơn nữa, các SPI-1 T3SS protein phản ứng với SipB trong các đại thực bào và đóng một vai trò thiết

yếu trong sinh bệnh Salmonella [10]

Hình 1.8 Mối liên hệ giữa lượng đường và nồng độ cAMP.(Nguồn Scitable by

nature education)

Đột biến trong crp và cya đã được báo cáo ảnh hưởng đến sản xuất của các

protein tạo bởi Ysc (Yersinia secretion), Ysa (Yersinia secretion apparatus), và T3SS roi trong Yersinia enterocolitica [62] Tuy nhiên, ít được biết đến về vai trò

của crp trong độc lực vi khuẩn Salmonella cho đến khi một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng crp / cya là cần thiết cho biểu hiện của gen sirA quyết định khả năng gây bệnh Salmonella 1 (SPI-1) cụm gen

Nhiều loại vắc-xin dã được tao ra bằng cách gây đột biến một số gen của

S.choleraesuis Smith, ví dụ như: purine synthesis (pur), thymidine synthesis (thy),

cAMP-receptor protein (crp), adenylate cyclase (cya), type III secretion system

(T3SS) apparatus (ssaC, ssaJ and ssaV), Gifsy-1 prophage protein (gifsy-1), và

D-galactonate transport protein (dgoT) Tuy nhiên, chủng S choleraesuis Smith chỉ gây đột biến gen crp hoặc kết hợp gây đột biến các gen khác có tác dụng làm giảm

độc lực và được sử dụng làm vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn

1.4 Phương pháp tạo DNA tái tổ hợp

(2) tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp in vitro;

(3) đưa phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào nhận, thường là E coli hoặc

nấm men;

(4) phát hiện và phân lập các dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu

Trong tế bào chủ, phân tử DNA tái tổ hợp có thể biểu hiện gene mong muốn (cho sản phẩm protein) hoặc tái bản độc lập nhiều lần để tạo ra hàng loạt bản sao

của nó, và khi tế bào chủ phân chia sẽ kéo theo sự tạo dòng phân tử (molecular

cloning) Mặt khác, do tốc độ phân chia rất nhanh của các vi khuẩn nên có thể tạo hàng triệu bản sao mong muốn trong một thời gian ngắn Vì thế nhà khoa học có thể tách dòng bất kỳ một gen nào để dùng cho nghiên cứu hoặc cho sản xuất trên quy

mô công nghiệp một số lượng lớn các protein vốn là những chế phẩm y-sinh học nào đó

Hình 1.9 Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp với vector là plasmid, tế bào

nhận là E.coli [3]

1.4.2 Quy trình tạo DNA tái tổ hợp

- Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa DNA quan tâm

- Chuẩn bị DNA ngoại lai có đầu 3’, 5’ thích hợp

- Chọn lọc vector (thể truyền) phù hợp

- Cải biến đầu 3’, 5’của vector và phân tử DNA ngoại lai

- Nối phân tử DNA vector và DNA ngoại lai

- Dưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên

- Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang vector tai tổ hợp

Hình

Hình 1.10 Sàng lọc dòng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp thành công dựa

vào gen kháng Ampicilin.[3]

1.5 Tình hình nghiên cứu gây đột biến trên một số gen gây bệnh của

Salmonella

S choleraesuis là nguyên nhân gây ra hàng loạt dịch bệnh gây chết ở lợn,

đồng thời cũng là nguyên nhân dẫn đến nhiễm trùng huyết và tử vong ở người (Jean

và cộng sự, 2006) Vắc-xin sống từ chủng Salmonella Choleraesuis giảm độc lực có

hiệu quả trong việc ngăn chặn, giảm sự lây lan và tỷ lệ tử vong (Maes và cộng sự, 2001) Do đó, một vắc-xin hiệu quả chống các vi sinh vật này là cần thiết Đột biến mất đoạn ở một số gen khác nhau đã được sử dụng để giảm độc một số chủng

Salmonella khác nhau Các đột biến này có thể được chia thành các nhóm theo 3

loại cơ bản: đột biến ở gen sinh tổng hợp, gen điều hòa và gen liên quan đến tính độc[1]

Chủng vắc-xin S choleraesuis Argus nhược độc được tạo ra bằng cách gây đột biến mất đoạn gen cyaA và gen crp Các đột biến này ảnh hưởng đến quá trình