Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen độc tố của vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh

Đề tài “Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh” được tiến hành với các... parahaemolyticus đang là tác nhân gâ

LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học,Trường Đại học Nha Trang Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi từng bước tiếp cận và hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến:

 Quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm qua

 Quý thầy cô giáo và cán bộ Phòng thí nghiệm đã quan tâm, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại Phòng thí nghiệm

 Bố mẹ, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ và dành cho tôi những tình cảm yêu thương nhất

Một lần nữa, tôi xin được cảm ơn tất cả mọi người đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Nha Trang, tháng 07 năm 2012

Sinh viên thực hiện NGUYỄN ANH THI

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio và Vibrio parahaemolyticus 6

1.2.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 10

1.2.4 Khả năng gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus 14

1.2.5 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus 18

2.1.3.1 Hóa chất 22

2.3.2 Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio 30

2.3.3 Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio 31

2.3.8 Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 41

3.1 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Vibrio từ hải sản 44

3.2 Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio 48

3.8 Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen độc tố 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

FDA Food and Drug Administration

CDC Centers of Disease Control

dNTPs Deoxynucleotide triphosphates DNA Deoxyribonucleotide Acid PCR Polymerase Chain Reaction TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

tdh (TDH) Thermostable direct hemolysin

trh (TRH) Tdh-related hemolysin tlh (TLH) Thermolabile hemolysin

Vp-toxRS V parahaemolyticus toxRS

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA LAMP Loop mediated isothermal amplification RT- PCR Reverse Transcription PCR

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

T3SS Type III Secretion System

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm thực phẩm Vibrio parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm 4

Bảng 1.2 Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus do tiêu thụ thực phẩm hải sản 1993 - 2000 ở Hồng Kông 5

Bảng 1.3 Đặc điểm của các loài Vibrio gây bệnh trên người liên quan đến việc tiêu thụ hải sản 9

Bảng 1.4 Các kháng nguyên của Vibrio parahaemolyticus 11

Bảng 1.5 Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus 18

Bảng 2.1 Các mẫu hải sản thu mua tại các chợ ở thành phố Nha Trang dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio 21

Bảng 2.2 Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR 37

Bảng 2.3 Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR toxR 38

Bảng 2.4 Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR tlh, tdh 39

Bảng 2.5 Khảo sát tỉ lệ mồi 43

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được 45

Bảng 3.2 Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio 49

Bảng 3.3 Khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn Vibrio 51

Bảng 3.4 Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo Vibrio dưới kính hiển vi điện tử 6

Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu 27

Hình 2.2 Quy trình phân lập Vibrio parahaemolyticus 29

Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường LB 3% NaCl ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37o C 45

Hình 3.2 Các khuẩn lạc chủng T5, T11, T16, T20 sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường TCBS ở điều kiện pH 7,2 và nhiệt độ 37o C 48

Hình 3.3 Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio T11 sau khi nhuộm Gram 49

Hình 3.4 Thí nghiệm lên men đường của chủng vi khuẩn T5 51

Hình 3.5 Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio 52

Hình 3.6 DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được điện di và soi dưới tia UV 53

Hình 3.7 Sản phẩm khuếch đại gen toxR được điện di và soi dưới tia UV 54

Hình 3.8 Sản phẩm khuếch đại gen tlh được điện di và soi dưới tia UV 55

Hình 3.9 Sản phẩm khuếch đại gen tdh được điện di và soi dưới tia UV 56

Hình 3.10 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai 57

Hình 3.11 Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi 58

LỜI NÓI ĐẦU

Hải sản là một trong những thực phẩm giàu chất dinh dưỡng và thường không thể thiếu được trong các khẩu phần ăn khoa học Tuy nhiên, việc tiêu thụ hải sản có thể dẫn đến những nguy cơ về sức khỏe, bị nhiễm các mầm bệnh sống tự nhiên trong môi trường nước biển và trong hải sản

Nguy cơ nhiễm bệnh càng tăng nếu hải sản được xử lý không đúng cách trong quá trình chế biến, dẫn đến các mầm bệnh có thể phát triển nhanh chóng theo cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi

Một trong những mầm bệnh quan trọng xâm nhiễm vào hải sản là các vi

khuẩn Vibrio, đặc biệt là vi khuẩn V parahaemolyticus tác nhân gây ra nhiều vụ

ngộ độc thực phẩm do tiêu thụ hải sản trên thế giới Ngoài các bệnh nhiễm trùng ở

người, một số loài Vibrio còn gây bệnh cho các động vật hải sản dưới nước, trong

đó có các loài cá và tôm có giá trị kinh tế cao

Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh là một trong những hướng nghiên cứu cần quan tâm

Đề tài “Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời các gen

độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh” được tiến hành với các

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tình hình dịch bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra

1.1.1 Trên thế giới

Vibrio xâm nhiễm trực tiếp vào hải sản và coi chúng như một phần môi

trường sống của mình Nhiễm độc thực phẩm do tiêu thụ hải sản gây ra bởi Vibrio xảy ra phổ biến mà nguyên nhân chính là do V parahaemolyticus, chiếm khoảng 25% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do Vibrio gây ra (Feldhusen, 2000)

V parahaemolyticus sống trên các sinh vật nổi, lơ lửng, động vật phù du, cá

và động vật hai mảnh vỏ (Kaneko và Colwell, 1973) Vi khuẩn này được xác định là tác nhân gây ra bệnh viêm dạ dày ruột trên toàn thế giới, đặc biệt là các vùng có

mức tiêu thụ hải sản cao như Đông Nam Á (Joseph và cộng sự, 1982) Năm 1997, một ổ dịch lớn do V parahaemolyticus gây ra do tiêu thụ hàu xảy ra dọc theo bờ

biển Thái Bình Dương (CDC, 1998)

Một số nước ở Châu Á cũng xảy ra nhiều ổ dịch như: ở Thái Lan các vụ ngộ

độc do V parahaemolyticus chiếm hơn một nửa các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra hàng năm (Leon và cộng sự, 2003), Trung Quốc (31,1% vụ ngộ độc thực phẩm được

báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20 - 30% các trường hợp từ 1981 đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm 1981 và 2003) Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha (1989, 1999, 2004),

Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng sự, 2005)

Ở Đài Loan, từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng V parahaemolyticus đã

được thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trường hợp tiêu chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh Năm kiểu huyết thanh thường gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%) Đa số

chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000)

Tại Hồng Kông, V parahaemolyticus đang là tác nhân gây bệnh hàng đầu

trong số tất cả các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây Theo số liệu

được cung cấp bởi DH (Department of Health), từ năm 1999 đến năm 2003 đã bùng phát 552 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó chiếm đến 331 (56,7%) vụ là do tiêu thụ hải sản

Trước năm 1994, ở Nhật bản tỷ lệ mắc bệnh do V parahaemolyticus được công bố còn ít Thời kì 1994-1995 đã có 1280 vụ về nhiễm bệnh do V parahaemolyticus được báo cáo, còn nhiều hơn các vụ ngộ độc thực phẩm do Salmonella Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy ra trong mùa hè, số lượng ca ngộ

độc xuất hiện nhiều nhất trong tháng tám Từ 1996 - 1998, đã có 496 ổ dịch, với

24.373 trường hợp do V parahaemolyticus gây ra Số lượng các trường hợp ngộ độc thực phẩm V parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997 (Yamazaki và cộng sự, 2000)

Ở Ấn Độ, từ năm 1994 - 1996, có 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi khuẩn V parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997) Tỷ lệ mắc tiêu chảy do chủng huyết

thanh O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở Calcutta giữa tháng 9 năm 1996 và tháng 4 năm 1997

Ở Hoa kỳ, trước năm 1997 có rất ít báo cáo về các ngộ độc gây ra bởi V parahaemolyticu; tuy nhiên chỉ từ năm 1997 - 1998 đã có 4 ổ dịch liên quan đến

việc tiêu thụ hàu sống hoặc chưa được nấu chín, ảnh hưởng hơn 700 người Sự gia

tăng đáng kể các vụ ngộ độc do V parahaemolyticus gây ra ở Hoa Kỳ có liên quan

đến chủng huyết thanh O3:K6 mà trước đây chỉ liên quan đến bệnh ở Châu Á

(Sakazaki và cộng sự, 2005)

Ở Mexico, trong tổng số 266 mẫu nước biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ

12 điểm khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau

trong năm cho thấy: V parahaemolyticus được tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến sự phân bố của V parahaemolyticus trong môi trường bao gồm nhiệt độ nước, nồng độ muối và oxy,

sự tương tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền

phù, cá và hải sản cũng như sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng

sự, 2004)

Ở Chile, tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của Puerto Montt, Chile V parahaemolyticus thu đƣợc từ động vật có vỏ và mẫu lâm sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự,

Bảng 1.2 Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus do tiêu thụ

cá nóc (25 ca), vi sinh vật (48 ca), nấm độc (46 ca) Thời điểm hay xảy ra ngộ độc thực phẩm trong năm là từ tháng 7 đến tháng 12 Loại thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm thường gặp là rau, thịt, nhưng hải sản cũng chiếm 11,11% các ca ngộ độc

Theo báo cáo của Tuyet và cộng sự (2002) từ giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa đã có 548 ca nhiễm bệnh do Vibrio gây ra được xác định Trong thời

gian này, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong số này có 471 người lớn và có 57 trẻ

em Đặc biệt, phân tích vi sinh cho thấy trong số 548 trường hợp tiêu chảy, có 53%

dương tính với vi khuẩn V parahaemolyticus

Nhiều địa phương trên cả nước hiện cũng đang phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng do nhu cầu ăn hải sản ngày càng nhiều, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt Ở Vĩnh Long, 10/2005 đã xảy ra dịch tiêu chảy trên diện rộng Khi xét nghiệm mẫu phân và mẫu nôn ói của bệnh nhân thì phát

hiện thấy sự hiện diện của vi khuẩn V parahaemolyticus

Tuy các phương tiện truyền thông đưa tin về ngộ độc thực phẩm do V, parahaemolyticus gây ra rất nhiều do ăn các các loài hải sản như tôm, cá (Võ Văn Nha và cộng sự, 2006) nhưng ở nước ta còn có ít nghiên cứu cơ bản về gen độc tố của vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh Đề tài được thực hiện để đáp ứng tình

hình thực tế, làm cơ sở cho nghiên cứu chẩn đoán và điều trị kịp thời

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio và Vibrio parahaemolyticus

1.2.1 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio

Hình 1.1 Cấu tạo Vibrio dưới kính hiển vi điện tử

Vibrio lần đầu tiên được phân lập vào năm 1854 từ các bệnh nhân tả bởi

Filippo Pacini, được gọi là “vibrions”

Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae Họ này gồm 5 chi, trong đó có 3 chi có tầm quan trọng trong y học là Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas Chi Vibrio gồm 30 loài, trong đó có 13 loài gây bệnh cho người, bao gồm V cholerae, V metschnikovii,

V minicus, V fluvialis, V funissii, V anguillarum, V alginolyticus, V parahaemolyticus, V cincinnatiensis, V damsela, V carchariae, V hollisae, V vulnificus

Vibrio là những trực khuẩn hình que, hơi cong, còn được gọi là phẩy khuẩn,

Gram âm, thường được tìm thấy trong nước Tế bào vi khuẩn có thể xếp liên tiếp nhau thành hình chữ S hay hình xoắn Chúng di động nhanh nhờ tiên mao đơn cực, dinh dưỡng theo phương thức dị dưỡng hữu cơ, không sinh nha bào, phản ứng oxidase dương tính, có thể tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện,

lên men đường không sinh hơi, chuyển nitrat thành nitrit (Thompson và cộng sự,

Hầu hết các loài Vibrio sống ở 30oC nhưng có một số loài ưa mặn sinh trưởng

ở 37o

C Các loài V parahaemolyticus, V alginolyticus, V cholerae có thể sinh

trưởng ở 42o

C Tất cả các loài Vibrio đều nhạy cảm với nhiệt độ, đun nóng đến khi

nhiệt độ bên trong hải sản đạt đến 60o

C trong vài phút thì có thể loại bỏ Vibrio Làm

lạnh là biện pháp quan trọng giúp kiểm soát và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn này

Vi khuẩn Vibrio nhạy cảm với môi trường acid và phát triển tốt nhất ở giá trị

pH trên trung tính, tức là từ 7,5 – 8,5 nhưng chúng cũng có khả năng chịu được môi trường kiềm Chúng bị ức chế ở pH dưới 6,8 và trên 10,2 (Rujiwat, 2007)

Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nước và mật độ phân bố tùy theo nhiệt độ,

nồng độ Na+, hàm lượng dinh dưỡng có trong nước và sự có mặt của các loài thực vật và động vật (McCarter, 1999) Chúng thường sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề mặt và trong ruột động vật biển Người ta thường phân lập chúng từ các cặn trầm

tích, nước, thực vật và hải sản Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio

sinh sống, bao gồm các loài như trai, sò, cua, tôm, mực Đối với các loài không ưa mặn, chúng có thể được phân lập từ mẫu nước ngọt (Rujiwat, 2007)

Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của người đều gây bệnh ngoại trừ V vurnissi Vibrio spp thường gây tiêu chảy hoặc nhiễm độc ngoài ruột, riêng V cholerae có thể gây ra cả hai hiện tượng Gần đây các loài V fluvialis, V hollisae, V minicus cũng được xác định là tác nhân có liên quan nhưng ít phổ biến

Các loài khác thuộc họ Vibrionaceae, gồm V vulnificus, AliiVibrio salmonicida và V harveyi, là tác nhân gây bệnh trên các loài hải sản và chúng gây ra thiệt hại lớn về kinh tế Photobacterium profundum, đại diện cho một chi khác trong

họ Vibrionaceae, cũng được kể đến trong danh sách các loài gây bệnh trên hải sản (Rujiwat, 2007)

Bảng 1.3 Đặc điểm của các loài Vibrio gây bệnh trên người liên quan đến việc

** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides

Chú thích: V = vàng; Km = không mọc hoặc mọc rất ít; N = nhạy cảm; 0 = không làm;

X = màu xanh; T = tùy chủng; K= kháng; Ti = màu tía; AGS = Arginine glucose slant; mCPC = Modified cellobiose polymyxin; KK = thạch nghiêng có kiềm; Ka = thạch nghiêng có tính kiềm hoặc acid nhẹ; KA = thạch nghiêng có acid

Nguồn: www.fda.gov

1.2.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Phân loại khoa học của Vibrio parahaemolyticus:

Theo khóa phân loại của Bergey, V parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm,

hình dấu phẩy, có tiên mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn Tiên mao đơn cực hoạt động nhanh hơn dưới động lực Na và giúp cho vi khuẩn chuyển động dễ dàng trong môi trường lỏng Chúng có thời gian thế hệ 8-9

phút (Daniels và cộng sự, 2000), thường phân bố ở các cửa sông và ven biển của hầu

hết các vùng trên thế giới Vi khuẩn này có thể được phân lập từ cát, bùn và nước

biển, cũng như ở hải sản (Maria và cộng sự, 2004)

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hiện diện và mật độ của V parahaemolyticus

trong môi trường nước bao gồm nhiệt độ nước, nồng độ muối và oxy, sự tương tác của các sinh vật phù du, các chất hữu cơ lơ lửng, cá và hải sản và cường độ thủy

triều

Các đặc tính sinh hóa đặc trưng cho V parahaemolyticus bao gồm: phản ứng

oxydase (+), khả năng sử dụng lysin (+), ornithin (+), arginine (+), khả năng lên men đường arabinose (+), lactose (-), sucrose (-), mannitol (+), mannose (+), phát triển được trong phạm vi nồng độ muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường không có muối (0%) hoặc nồng độ muối quá cao (10%)

Các chủng V parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu huyết thanh (serotype) Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của V parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của vỏ lipopolysaccharides (kháng nguyên O) và nang (kháng nguyên K) (Joseph và cộng

sự, 1983) Theo FDA, có 12 kiểu kháng nguyên O và hơn 70 kiểu kháng nguyên K

1.2.3 Gen độc tố của Vibrio parahaemolyticus

Một yếu tố độc tính từ lâu đã được xác định là có liên quan chặt chẽ đến khả

năng gây bệnh của vi khuẩn Vibrio là hemolysin Vì lí do này, hemolysin đã được

nghiên cứu rộng rãi trên thế giới

Chi Vibrio có 4 họ hemolysin chính là TDH, HlyA, TLH và -VPH, trong đó

TDH của V haemolyticus và HlyA của V cholera là các tác nhân chính trong tiến trình gây bệnh đã được nghiên cứu rộng rãi

V parahaemolyticus có thể là nhân tố gây viêm dạ dày ruột do tiêu thụ hải

sản nhiễm mầm bệnh, nhưng không phải chủng nào của loài này cũng gây bệnh

Phần lớn các chủng V parahaemolyticus phân lập từ các trường hợp viêm dạ dày

ruột ở người đều sản xuất beta-hemolysin trên môi trường thạch máu Wagatsuma (Wagatsuma, 1968) Khả năng gây tan máu trên môi trường được gọi là hiện tượng Kanagawa (KP) Chỉ có 1 - 5% các chủng có nguồn gốc từ môi trường dương tính

KP Do vậy, hemolysin được xem là yếu tố độc tố quan trọng và phản ứng KP được dùng để đánh dấu nhận biết cho các chủng độc hại

Hiện tượng KP gây ra bởi một loại hemolysin chịu nhiệt do gen tdh mã hóa

Hemolysin này có tên là TDH (thermostable direct hemolysin), là yếu tố độc lực

chính của vi khuẩn V parahaemolyticus (Kaper và cộng sư, 1984) Protein TDH có trọng lượng phân tử được xác định là 42 kDa bằng sử dụng sắc kí lọc gel (Takeda và cộng sự, 1978) Cấu trúc của nó không có lipit hay cacbohydrat mà là một dimer,

bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có khối lượng 21 kDa Protein này rất bền nhiệt, khi đun nóng ở 100oC trong 10 phút thì protein bị biến tính còn lại 165

amino axit với một cầu nối disulfua ở gần đầu carboxyl (–COOH) (Tsunasawa và cộng sự, 1987)

Năm 1988, Honda và các đồng nghiệp phát hiện ra một hemolysin mới trong

khi phân lập các chủng lâm sàng KP dương tính (Honda và cộng sựz1988)

Hemolysin này được gọi là TRH (TDH-related haemolysin), có tính chất hóa lý, miễn dịch và sinh học tương tự như TDH Hai protein TDH và TRH được coi là yếu

tố độc tính quan trọng trong khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus Chúng

được mã hóa bởi các gen tương ứng là tdh và trh có kích thước lần lượt là 269 bp và

250 bp (Nishibuchi và cộng sự, 1992; Honda và Iida, 1993; Xu và cộng sự, 1994) Giữa các chủng V parahaemolyticus khác nhau chứa các gen độc tố khác nhau Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng đều dương tính với gen tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong

khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có hoặc có với tỉ lệ thấp 1 - 5%

(Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự, 2004)

Các chủng V parahaemolyticus gây bệnh là các chủng KP dương tính, có chứa gen tdh và gen trh mã hóa các protein độc tố TDH, TRH nằm trong operon độc

tố Vp-toxRS và được điều hòa bởi gen toxR Operon Vp-toxRS có tên này là do cấu trúc và chức năng tương tự với operon toxRS của V cholerae mã hóa cho các gen nội độc tố tả Tương tự operon toxRS của V cholerae, operon Vp-toxRS của V parahaemolyticus không chỉ điều khiển sự phiên mã của gen độc tố ruột tdh mà còn các gen khác nữa Trình tự của operon Vp-toxRS được phát hiện có tất cả các chủng

V parahaemolyticus (Nishibuchi và cộng sự, 1995)

Do các gen độc tố tdh, trh ở các loài V cholerae, V mimicus, V hollisae có mức độ tương đồng cao so với V parahaemolyticus nên việc xác định gen toxR có thể giúp chỉ ra chính xác loài V parahaemolyticus (Nishibuchi và Kaper, 1995) Gen toxR có kích thước 368 bp, là gen điều hòa cho operon Vp-toxRS (Zulkifli và cộng

sự, 2009), tồn tại ở tất cả các chủng V parahaemolyticus, kiểm soát sự biểu hiện của

các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng như TDH, TRH, và ngoài ra là các gen liên quan đến các độc tố khác

Gen toxR là gen điều hòa có mặt ở nhiều loài trong chi Vibrio (Jun và cộng

sự, 2001) Ở V cholerae, gen toxR đóng vai trò chủ chốt trong điều hòa gen ctx và nhiều gen khác, bao gồm gen tcp mã hóa độc tố lông mao (toxin-coregulated pili), các gen ompU, ompT mã hóa các protein màng ngoài (OMPs) ở V cholerae Mức

độ tương đồng trong trình tự nucleotide của gen toxR ở ba loài V cholerae, V parahaemolyticus và V vulnificus được xác định là từ 52 – 63% % Trong đó, giữa hai operon của hai loài V parahaemolyticus và V cholerae có lần lượt là 52% trình

tự tương đồng (Zulkifli và cộng sự, 2009)

Vật liệu di truyền của V parahaemolyticus là hai nhiễm sắc thể dạng vòng I

và II có kích thước lần lượt là 3,2 và 1,9 Mb Việc giải trình tự gen hoàn toàn vi

khuẩn này đã được hoàn thành vào ngày 10 tháng 3 năm 2003 (Kozo và cộng sự, 2003) Các gen độc tố tdh, trh nằm trên nhiễm sắc thể II

T3SS (Type III Secretion System) là một trong những hệ thống bài tiết các protein của vi khuẩn vào môi trường ngoại bào hoặc giúp vi khuẩn tiêm các protein

độc tố vào tế bào vật chủ eucaryote của chúng Ở V cholerae không có hệ thống protein này trong khi V parahaemolyticus có hai hệ thống T3SS là T3SS1 và T3SS2, đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh của vi khuẩn này (Thomson và cộng sự, 2004, Honda và cộng sự, 2006) Jun và cộng sự (2001) đã phát hiện một dải gen gây bệnh Vp-PAI dài 80 kp trên nhiễm sắc thể II bảo tồn trong các chủng KP (+)

và không có trong KP (-) (Kodama và cộng sự, 2010) Vp-PAI không chỉ chứa gen tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2, do vậy, liên quan đến khả năng gây bệnh của V parahaemolyticus

Cùng với TDH và TRH, một hemolysin khác đã được phát hiện trên V parahaemolyticus là TLH (thermolabile haemolysin) TLH là một protein không bền nhiệt và có hoạt tính phospholipase / lysophospholipase (Shinoda và cộng sự, 1991) Cấu trúc của gen tlh có chứa một ORF dài 1254 bp Dạng tiền protein và protein

trưởng thành của TLH gồm có 418 và 398 amino acids với trọng lượng phân tử

tương ứng là 47,5 và 45,3 kDa (Shinoda và cộng sự, 1991) Hàm lượng G + C của tlh là 47,6% (Taniguchi và cộng sự, 1986) Nghiên cứu cho thấy không có sự tương đồng về trình tự của hai gen tdh và tlh Gen tlh đã được tìm thấy ở genome của tất cả các chủng V parahaemolyticus được phân lập từ các mẫu lâm sàng hay môi trường Tuy nhiên, vai trò của haemolysin này đối với việc gây bệnh dạ dày ruột của V parahaemolyticus vẫn chưa được biết đến

1.2.4 Khả năng gây bệnh của Vibrio parahaemolyticus

1.2.4.1 Nguồn lây nhiễm

V parahaemolyticus được tìm thấy chủ yếu trong các loại thực phẩm có

nguồn gốc từ biển như cua, hàu, sò…, chúng thường hiện diện khoảng 10 CFU/g –

103 CFU/g trong những ngày hè ấm áp Loài này có thế hệ thời gian ngắn (8-9 phút) Chúng chỉ cần một thời gian ngắn có nhiệt độ tăng (khoảng từ 30 - 42oC, tối ưu là

37oC) là đủ để phát triển đến mức độ lây nhiễm (106

tế bào/ml) (Daniels và cộng sự,

2000)

Khi gây bệnh trên người, sự lây nhiễm có thể qua đường ăn uống, lây nhiễm

từ người sang người do tiếp xúc với mầm bệnh (chất nôn, phân, dụng cụ, ), người bệnh không rửa tay kỹ, ăn thực phẩm tươi sống hay chưa nấu chín Đây là nguyên nhân chủ yếu gây ra viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) cấp tính Sự lây nhiễm qua vết thương cũng có, nhưng ít phổ biến hơn ngộ độc do ăn hải sản và thực phẩm bị nhiễm chéo với các loại thực phẩm hải sản khác, lây nhiễm trong quá trình chế biến hoặc nguồn nước sử dụng bị nhiễm và xử lý không đúng cách Ngoài ra, bơi lội hoặc làm việc ở vùng bị ảnh hưởng có thể dẫn đến nhiễm trùng mắt hoặc tai và các vết thương hở Loài vi khuẩn này gây bệnh không chỉ trên người mà còn là các đối

tượng hải sản như tôm, cá, (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

1.2.4.2 Cơ chế gây bệnh

Nhiều loài Vibrio gây bệnh cho người, và/hoặc cho động vật biển có xương

sống và không có xương sống Các loài gây bệnh sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác nhau bao gồm enterotoxin, hemolysin, cytotoxin, protease, lipase, photpholipase, siderophore, các nhân tố đính bám và/hoặc haemagglutinin

Đối với V parahaemplyticus các yếu tố độc lực được xem là có vai trò quan

trọng liên quan tới khả năng gây bệnh bao gồm β-hemolysin, các nhân tố đính bám, các enzyme, protein độc tố TDH, TRH

Hemolysin được gọi tên do khả năng làm tan màng tế bào hồng cầu và giải

phóng hemoglobin, là protein ngoại độc tố có mặt ở nhiều loài Vibrio gây bệnh và

đóng nhiều vai trò khác nhau trong quá trính lây nhiễm (Iida và Honda, 1997) Sắt là một ion thiết yếu cho sự phát triển và sao chép của vi khuẩn, đóng vai trò quan trọng

trong quá trình gây bệnh của Vibrio Hemolysin tấn công màng tế bào hồng cầu và

làm tan bào, dẫn tới giải phóng các protein liên kết với sắt (Fe3+) như hemoglobin, transferrin, lactoferrin thành dạng tự do Còn các ion sắt (Fe3+) sẽ được liên kết với các thể mang sắt của vi khuẩn có khả năng cạnh tranh với các protein gắn sắt của vật chủ Phức hợp này sau đó sẽ liên kết với các thụ thể trên màng tế bào và được vận chuyển vào trong tế bào (Zhang và Austin, 1998) Hoạt tính hemolysin của vi khuẩn

Vibrio phụ thuộc vào nồng độ ion sắt của vật chủ trong quá trình xâm nhiễm

(Stoebner và Payne, 1988) Trong nhiều trường hợp, hoạt tính tạo lỗ màng của hemolysin không chỉ giới hạn ở các tế bào hồng cầu mà còn ở một số loại tế bào khác như tế bào mast, các bạch cầu trung tính và các tế bào nhân đa hình (polymorphonuclear) làm tăng cường độc tính và dẫn tới phá hủy các mô (Iida và Honda, 1997)

Hemolysin có vai trò gây độc chính trong V parahaemolyticus là một hemolysin chịu nhiệt do gen tdh mã hóa Hemolysin này có tên là TDH TDH là

ngoại độc tố có khả năng làm tan máu, gây tiết dịch ruột, gây độc cho một vài loại tế

bào và hoạt động của tim (Iida và Honda, 1997) Theo Honda và cộng sự (1992)

TDH phá vỡ tế bào eukaryote theo ba bước Đầu tiên chúng liên kết với màng tế bào sau đó chúng tham gia tạo ra các kênh lỗ màng (porin channel) ở tế bào biểu mô thành ruột có đường kính khoảng 2 nm, các kênh này cho phép nhiều loại ion tràn vào như Na+

, Mg2+, Ca2+ Khi lượng TDH tăng lên thì cũng tăng lên các kênh này làm cho các ion tràn vào tự do và tế bào căng lên hết mức và bị phá vỡ do mất cân bằng thẩm thấu

1.2.4.3 Đặc điểm của bệnh

Vào những năm 1950, V parahaemolyticus lần đầu tiên được xác định là tác

nhân gây bệnh do thực phẩm ở Nhật Bản Đến cuối những năm 1960 và đầu những

năm 1970, V parahaemolyticus đã được công nhận là một căn nguyên gây ra bệnh

tiêu chảy trên toàn thế giới

V parahaemolyticus là một loại vi khuẩn ưa mặn, có khả năng gây ngộ độc

thực phẩm và viêm dạ dày ruột, nhiễm trùng vết thương, và nhiễm trùng huyết ở người Trong đó, nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng do vi khuẩn lây lan

nhanh, do sự hiện diện và tồn tại lâu dài của các độc tố do chúng sản xuất ra tuần hoàn trong máu Dấu hiệu đặc trưng là sốt hoặc hạ huyết áp và khả năng phát tán các

vi sinh vật từ máu Trong trường hợp nhiễm trùng huyết, các triệu chứng có thể bao gồm sưng, đau đớn tứ chi với xuất huyết (Hlady, 1997; Klontz, 1990) Tử vong cũng

có thể xảy ra tiếp theo sau nhiễm trùng huyết (Barker và Gangarosa, 1974)

Các triệu chứng đặc trưng do V parahaemolyticus gây ra là tiêu chảy đôi khi

còn kèm theo đau đầu, nôn mửa, sốt, ớn lạnh Thời kỳ ủ bệnh thường từ 12 giờ – 24 giờ và bệnh thường tự khỏi sau 3 ngày Thông thường bệnh nhẹ và ít nguy hiểm,

song nếu phát hiện chậm và không được điều trị kịp thời cũng có thể gây tử vong V parahaemolyticus gây ra hai hội chứng lâm sàng khác biệt nhau:

o Ca bệnh lâm sàng:

+ Dạng tả nhẹ: nôn và tiêu chảy dạng tả, phân lỏng, tóe nước, màu xanh hoặc xanh vàng, mùi hơi tanh Nôn và tiêu chảy nhiều có thể dẫn đến mất nước cấp, hầu như không sốt, không đau bụng

+ Dạng lỵ trực khuẩn: tiêu chảy phân lỏng lờ lờ máu cá, mùi thối kèm theo đau bụng và sốt, kiểu lỵ trực khuẩn

o Ca bệnh xác định: là ca bệnh tiêu chảy cấp khi lấy phân hoặc chất nôn nuôi

cấy bắt được V parahaemolyticus

Bảng 1.5 Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio

(Nguồn Barker và Gangarosa, 1974; Levine và cộng sự, 1993)

1.2.5 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Vibrio parahaemolyticus

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện V parahaemolyticus như:

quan sát hình thái dưới kính hiển vi, dựa vào các đặc tính sinh hóa và các kĩ thuật sinh học phân tử như PCR, RAPD, miễn dịch phân tử

Khi quan sát dưới kính hiển vi, V parahaemolyticus có hình dấu phẩy, di

động nhờ tiên mao đơn cực, kích cỡ tùy thuộc vào chủng Khi nhuộm Gram, chúng được xác định là vi khuẩn Gram âm

Các loài V parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TCBS

(Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh đậm

(Kudo và cộng sự, 2003) V parahaemolyticus còn phát triển trên môi trường chọn

lọc khác là CHROMagarTM

, khuẩn lạc có màu tía hoặc tím Ngoài ra V parahaemolyticus còn có thể được phát hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên môi

trường thạch Wagatsuma (một loại môi trường thạch máu đặc biệt) để kiểm tra khả

năng sản xuất β – hemolysin xung quanh khuẩn lạc bởi TDH của V parahaemolyticus (Miyamoto và cộng sự, 1969) hoặc bằng kĩ thuật ELISA (Enzyme

– linked immunosorbent assay) để phát hiện chủng sản xuất TDH (Honda và cộng

sự, 1989)

Cuối cùng, V parahaemolyticus có thể được phát hiện bằng các kĩ thuật sinh

học phân tử dựa trên nguyên lý PCR như Multiplex PCR, RT- PCR, RAPD, LAMP

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện V parahaemolyticus trong các mẫu khác

nhau bao gồm thủy hải sản hoặc mẫu nước Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin cậy do vậy thường được sử dụng để phân tích Các gen thường

được sử dụng để xác định loài V parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR là toxR và gyrB Gen toxR là gen điều hòa operon độc tố, bảo thủ đối với V parahaemolyticus (Kim và cộng sự, 1999) Ngoài toxR, gen gyrB cũng là gen bảo thủ ở V parahaemolyticus nên cũng có thể được sử dụng để xác định loài V parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009) Trong khi phản ứng khuếch đại các gen độc tố như tdh, tlh, trh lại được sử dụng để kiểm tra khả năng gây bệnh của vi khuẩn (Zulkifli và cộng sự, 2009)

1.3 Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài

1.3.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ở Việt Nam, việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm hầu hết chỉ dựa trên phương pháp truyền thống: nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch Các quy trình này rất phức tạp, tiêu tốn thời gian ít nhất từ 2 đến 6 ngày Đó cũng là lý do vì sao một vụ ngộ độc phải mất cả tuần mới tìm được nguyên nhân gây bệnh Mặt khác, phương pháp nuôi cấy kết hợp hoàn toàn không đáp ứng được yêu cầu kiểm tra, giám sát và kiểm dịch của các cơ quan quản lý Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nhanh chóng để kiểm soát bệnh và để sản xuất

ra thuốc điều trị kịp thời, tiện dụng là vô cùng cần thiết

Trong năm 2010, đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên “Phân lập và xác định

gen độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong hải sản tươi sống tại các chợ

của thành phố Nha Trang” của sinh viên Nguyễn Thị Cẩm Ly đã xây dựng được

quy trình PCR đơn phát hiện hai gen độc tố toxR, tlh là gen phổ biến ở tất cả các

chủng của loài V parahaemolyticus Tuy nhiên, trong đề tài này gen tdh vẫn chưa được phát hiện Gen này tuy có mặt với xác suất rất thấp trong các mẫu môi trường

(1 - 5%), nhưng lại có mặt trong hầu hết các mẫu lâm sàng và là gen mã hóa protein độc tố trực tiếp TDH TDH là độc tố chính, tác động trực tiếp lên tế bào hồng cầu, phá vỡ hồng cầu Đây là protein bền nhiệt, do đó nếu ăn phải mẫu thực phẩm nhiễm bệnh chưa được nấu chín thì khả năng bị ngộ độc rất cao Hơn nữa ở Việt Nam hiện vẫn chưa có một báo cáo cụ thể nào về việc phát hiện đồng thời các gen độc tố này

Do đó việc xác định được gen độc tố tdh và xây dựng một quy trình Multiplex PCR

nhằm phát hiện nhanh đồng thời 3 gen độc tố này có thể giúp cho việc phát hiện sớm nguyên nhân gây ngộ độc là rất cần thiết

Ưu điểm của phương pháp Multiplex PCR là cho phép phát hiện đồng thời các gen độc tố với các cặp mồi tương ứng trong cùng một phản ứng, do đó sẽ giảm thời gian phát hiện các gen độc tố, giảm chi phí về hóa chất, dụng cụ… Dùng phương

pháp Multiplex PCR để phát hiện đồng thời 3 gen độc tố toxR, tdh, tlh của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus vừa cho kết quả chính xác vừa rút ngắn thời gian phát hiện

các gen độc tố trên các mẫu thủy sản

1.3.2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài được tiến hành nhằm các mục tiêu sau:

Phân lập chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái và hóa sinh đặc trưng cho

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu

Mẫu hải sản (tôm, mực) được thu mua tại các chợ ở thành phố Nha Trang:

chợ Đầm, chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ

Hai chủng V parahaemolyticus (kí hiệu Vp1, Vp2) phân lập từ mẫu bệnh

phẩm do Viện Pasteur – Nha Trang cung cấp

Bảng 2.1 Các mẫu hải sản thu mua tại các chợ ở thành phố Nha Trang dùng để

phân lập vi khuẩn Vibrio

Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha)

Tủ sấy (Binder, Đức) Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan)

Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc) Máy chụp và phân tích ảnh gel (VWRTM

, Mỹ) Máy block nhiệt (VWRTM, Mỹ)

Máy vortex Maxi mix II M37615 (Thermolyne, Mỹ) Kính hiển vi (Motic BA 300, Mỹ)

Wizard SV lysis buffer

Wizard SV wash solution

Taq buffer 10X (Fermentas, Mỹ)

Taq polymerase 5 u/µl (Fermentas, Mỹ)

- Các hóa chất dùng tromg điện di

Loading dye 6X (Fermentas, Mỹ)

Agarose (Fermentas, Mỹ)

DNA marker 100 bp (Fermentas, Mỹ)

Ethidium bromide 10 mg/ml (Biorad, Mỹ)

- Nước cất : 1 lít

pH = 8,5 ± 0,2 Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc rồi đem hấp ở nhiệt độ 121oC, 1atm trong 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và

C, 1atm trong 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi

 Môi trường chọn lọc: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS)

- Sắt (III) citrate (FeC6H5O7) : 1 g

 Môi trường kiểm tra khả năng chịu muối: muối trypton có dải nồng độ NaCl là 0; 3; 6; 8 và 10% NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N3; T1N6; T1N8 và

T1N10)

Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất Sau đó, thêm lần lượt: 30, 60, 80 và

100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl 0; 3; 6; 8 và 10

% Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 ± 0,2 Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm Đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc Hấp ở nhiệt độ 121o

C, 1atm trong 15 phút Các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối

 Môi trường thử decarboxylase (Môi trường cơ bản)

- Phenol đỏ 0,02 g

- pH = 7,0 ± 0,2 Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g của một trong các loại amino acid: L-lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên Sau đó, rót

5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp Hấp ở nhiệt độ 121o

C, 1atm trong 10 phút Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy

 Môi trường lên men đường (Môi trường cơ bản)

C, 1atm trong 10 phút Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sucrose, lactose, D-mannitol

và arabinose) trong nước cất rồi lọc vô trùng Thêm 0,5 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường cơ bản Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%

 Dung dịch nước muối sinh lý

Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất Chia vào mỗi ống nghiệm 9ml, đậy nút bông không thấm nước và giấy bạc Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121o

C, 1atm trong

15 phút rồi để nguội

 Thuốc nhuộm Tím Violet

- Rượu ethylic 1 g

- Phenol tinh thể 2g

Pha chế:

Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1)

Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet

 Thuốc nhuộm Liugol

- Iod tinh thể : 1 g

- KI : 2 g

- Nước cất : 200 ml Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu

 Thuốc nhuộm Fuschin

Hòa tan Fuchsin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1)

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuchsin

2.2 Nội dung nghiên cứu

Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa trong hình 2.1:

Cấy ria

Khuẩn lạc thuần chủng

Phân lập Vibrio

Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng cách nhuộm Gram

Hình 2.1 Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập vi khuẩn

Quy trình phân lập và nuôi cấy thực hiện qua 4 bước và sơ đồ hóa ở Hình 2.2

 Hoạt hóa trên môi trường APW 3% NaCl

 Tăng sinh trên môi trường LB 3% NaCl

 Phân lập Vibrio trên môi trường thạch TCBS

 Quan sát hình thái vi khuẩn bằng cách nhuộm Gram

 Kiểm tra các đặc điểm hóa sinh (khả năng chịu muối, khả năng lên men

đường, khả năng sử dụng lysin) để chọn chủng có đặc tính giống với V parahaemolyticus

Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường LB

3%, ủ 42oC trong 18 – 24 giờ

Phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường TCBS, ủ

37oC trong 24 giờ Ðồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml môi trường APW 3%, ủ 37oC trong 18 – 24 giờ

- Ủ mẫu đã dập ở 37oC trong thời gian 6-8 giờ trong tủ ấm

- Tăng sinh: hút 100 µl dịch ủ sang 5ml môi trường LB 3% NaCl trong ống nghiệm đã pha sẵn, sau đó ủ trong tủ ấm 37oC từ 18 – 24 giờ

- Pha loãng :