Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật đông khô và ứng dụng vào bảo quản chủng vi sinh vật

Trong quá trình đông khô thì sản phẩm ở trong môi trường áp suất chân không nhỏ hơn 6.11 mbar và hơi nước bay ra từ sản phẩm sẽ được ngưng tụ tại bề mặt rất lạnh của bộ ngưng tụ ice cond

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu và các Thầy Cô khoa Chế Biến, trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang đã tận tình giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức quý báu trong thời gian em học tại trường

PGS.TS Lê Văn Hiệp – Viện Trưởng Viện Vacxin Nha Trang, người đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thiện tốt đồ án này

ThS Nguyễn Công Bẩy - Tổ trưởng tổ kiểm vi, phòng kiểm định, Viện vacxin Nha Trang, người đã tận tâm chỉ bảo, động viên khuyến khích và giúp đỡ

em trong suốt quá trình công tác, học tập và nghiên cứu để hoàn thành đồ án Các anh chị công tác tại Tổ kiểm vi, phòng kiểm định Viện Vacxin Nha Trang đã nhiệt tình cộng tác giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đồ án

H ThÞ Kim Thy

mơc lơc

trang

MỞ ĐẦU 1

PHẦN THỨ NHẤT – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ 3

1.1 Lịch sử ra đời của kỹ thuật đông khô 4

1.2 Nguyên lý đông khô 4

1.2.1 Sự thăng hoa 4

1.2.2 Chân không 6

1.2.3 Áp suất bay hơi 6

1.2.4 Áp suất chân không 7

1.2.5 Áp suất an toàn 7

1.2.6 Áp suất báo động 8

1.2.7 Các tá chất sử dụng trong đông khô .9

1.3 Các giai đoạn của quá trình đông khô 9

1.3.1 Giai đoạn làm đông 9

1.3.2 Giai đoạn làm khô 15

PHẦN THỨ HAI - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

I Đối tượng .21

1.1 Máy đông khô Epsilon 2-6 D, hãng Christ 21

1.2 Chủng vi sinh vật 21

II Vật liệu 21

2.1 Dơng cơ, m¸y mc 21

2.2 M«i tr-ng, ha cht, dung dÞch 22

2.3 Tá chất sử dụng trong đông khô

III Phương pháp nghiên cứu .22

3.1 M« h×nh nghiªn cu 22

3.2 Thời gian nghiên cứu .22

3.3 Mô hình nghiên cứu .22

3.4 Ph-¬ng ph¸p kiĨm tra ® sng 23

3.5 Phương pháp đông khô chủng .24

3.6 phương pháp kiểm tra độ ẩm tồn dư 26

3.7 phương pháp kiểm tra chân không .26

3.8 Ph-¬ng ph¸p xư lý s liƯu 27

PHẦN BA - KẾT QUẢ 28

A KẾT QUẢ .28

I Các thông số kỹ thuật của quy trình đông khô chủngVSV .28

1.1 Thời gian đông khô chủng .28

1.2 Điểm đông và nhiệt độ đông… .29

1.3 Thay đổi áp suất, nhiệt độ và hình thái vật lý của sản phẩm trong quá trình đông khô…… .30

II Kết quả kiểm tra chất lượng trước và sau đông khô chủng 31

2.1 Độ sống của chủng trước và sau đông khô 31

2.2 Kết quả kiểm tra độ ẩm tồn dư .32

2.3 Mức độ hư hỏng sản phẩm do quá trình đông khô .33

2.4 Kết quả kiểm tra độ chân không sau đông khô .33

B BÀN LUẬN 34

I Thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô .34

1.1 Thời gian đông khô .34

1.2 Điểm đông và nhiệt độ sản phẩm .35

1.3 Thay đổi áp suất chân không, nhiệt độ sản phẩm và hình thái vật lý 35

1.4 Nút cao su và nút nhôm .36

II Kết quả đông khô chủng VSV .37

2.1 Độ sống……… 37

2.2 Tá chất .37

2.3 Độ ẩm tồn dư, sản phẩm hỏng với thời gian đông khô 38

PHẦN THỨ TƯ -KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

A KẾT LUẬN 39

1 Các thông số của kỹ thuật đông khô .39

2 Đông khô chủng VSV .39

B ĐỀ NGHỊ .40 tµi liƯu tham kh¶o

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Đông khô, là một kỹ thuật tiên tiến để bảo quản các mẫu vật phẩm, được áp dụng một cách rộng rãi trong nhiều ngành và lĩnh vực khác nhau như y học, công nghệ vi sinh vật, công nghệ phóng xạ hạt nhân, khảo cổ học, nông nghiệp, bảo quản thực phẩm Càng ngày, đông khô càng được ứng dụng nhờ những đặc tính ưu việt vượt trội, mang lại hiệu quả kinh tế cao Nhờ sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, công nghệ đông khô đã

có sự phát triển vượt bậc, kỹ thuật đông khô ngày càng hiện đại, rút ngắn thời gian đông khô,giảm tỷ lệ hư hỏng sản phẩm Chi phí về nhân công giảm bớt đáng kể nhờ sự tự động hóa và đơn giản hóa, góp phần hạ giá thành sản phẩm

Công tác bảo quản chủng giống vi sinh vật có một ý rất lớn trong các phòng nghiên cứu và trong công nghệ vi sinh vật Việc bảo quản không chỉ đơn thuần giữ chủng sống, mà phải duy trì được những đặc tính ban đầu, không bị thay đổi tính chất

Vì quan trọng như vậy, nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc gia, thành lập các trung tâm giữ giống như American type Culture Collection - ATCC – Mỹ, National Collection of Type Cultures –NCTC – Anh, Korean Collection of Type Cultures – KCTC – Hàn Quốc, Japan Collection of microorganisms – JCM – Nhật

Có rất nhiều phương pháp bảo quản chủng giống vi sinh vật khác nhau Tuỳ theo mục đích và thời gian bảo quản mà ta có thể áp dụng các hình thức bảo quản thích hợp như: cấy truyền, bảo quản trong lạnh thông thường, đông băng Để bảo quản lâu dài thì cách tốt nhất là đông khô

Ở Việt Nam, đông khô đã được ứng dụng từ lâu, trong nhiều lĩnh vực khác nhau như đông khô sữa, chất phóng xạ, thực phẩm và sản phẩm nông nghiệp khác Trong công nghệ vi sinh vật, đông khô được sử dụng phổ biến để giữ những chủng quý hiếm

Trong 10 năm(1986-1995) phòng gốc giống viện Vacxin đã giữ chủng vi khuẩn đông khô và hình thành hệ thống lô giống cho việc sản xuất các Vacxin tả, thương hàn, bạch hầu- ho gà – uốn ván đạt tiêu chuẩn quốc tế Các chủng vi sinh vật khác rất cần được bảo quản lâu dài bằng kỹ thuật đông khô, nhằm duy trì và phát triển hệ thống chủng giống phong phú của Viện

4 chủng vi sinh vật mới được Trung tâm Kiểm định Quốc gia cung cấp cho Viện Vacxin để phục vụ cho công tác kiểm định Các chủng này có hồ sơ đầy đủ, nhưng số lượng mỗi chủng chỉ có 2 ống Để có đủ số lượng chủng cho những năm tiếp theo thì cần nhân chủng và bảo quản bằng phương pháp thích hợp

Vì thế, mà em tiến hành đề tài “ Bước đầu tìm hiểu kỹ thuật đông khô và ứng dụng vào bảo quản chủng vi sinh vật”

Với hai mục tiêu sau:

1 Tìm hiểu kỹ thuật đông khô

2 Anh hưởng của kỹ thuật đông khô đến độ sống của chủng vi sinh vật

Để thực hiện được mục tiêu trên, các nội dung cần phải tiến hành nghiên cứu là:

Nội dung 1: Tiến hành đông khô 4 chủng hiện có tại Tổ kiểm vi

Nội dung 2: Kiểm tra độ sống của chủng vi sinh vật trước và sau khi đông khô Nội dung 3: Kiểm tra độ ẩm tồn dư sau đông khô

Nội dung 4: Kiểm tra độ chân không sau đông khô

Trong nghiên cứu, trình độ và kinh nghiệm thực tế của em có hạn, chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong quý Thầy cô đóng góp ý kiến bổ sung hoặc chỉ ra những chỗ cần sữa chữa để đồ án của em hoàn thiện hơn

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đồ án này

PHẦN THỨ NHẤT

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ 1.1 Lịch sử đông khô:

Altmann (1890) làm khô các mô ở –20 OC và chân không để nghiên cứu về lịch sử, ông giấu 40 năm sau, khi chết mới công bố

Shackell (1909) là người đầu tiên đông khô thành công ở thực phẩm và huyết thanh

Hai ông Predtets Chensky (1912) Griorowitch đã lặp lại thành công kỹ thuật này

Tival (1927) ở Pháp và Elser (1934) ứng dụng rộng rãi vào công nghệ Elser (1935) báo cáo về đông khô huyết thanh

Flosdorf-Mudd (1935) mô tả rộng rãi phương pháp ở Mỹ và Greaves (1939) ở Anh Các ông này vạch ra khả năng ứng dụng đông khô huyết thanh cho lâm sàng và đông khô bổ thể (1940)

Stobes (1943) tóm lược lý luận và có nhiều kết quả nghiên cứu đi sâu vào phương pháp này

Đông khô chủng vi khuẩn do Schackell – Hammer (1911) Swift (1921) Brown (1932) Flosdorf –Mudd (1938) Stamp (1947) Sordelli –Greaves (1944) phát triển kỹ thuật, chế tạo dụng cụ và chọn tá dược

Hêthrington – Craig trong labor Difco (mỹ) ứng dụng đông khô môi trường nuôi cấy thành công (1939- 1940)

B.Gorsy là người dùng máy đông khô huyết thanh và chủng giống vi khuẩn đầu tiên ở Viện HUMAN (Hungary) vào năm 1940 với máy Flosdorf –type

Sau hai thập kỷ 50-60 phát triển kỹ thuật đông khô với nhiều bước tiến vượt bậc

và xác lập thành lý thuyết công nghệ đến từng chi tiết (Ở Pháp có Rey là người đóng góp nhiều công sức để ứng dụng đông khô cho thực phẩm)

Tuy giámáy đông khô và các trang thiết bị cao, song kỹ thuật đông khô có nhiều hứa hẹn khi ứng dụng đông khô chủng giống VSV, chế phẩm miễn dịch, vacxin - huyết thanh, dược phẩm cao cấp và cả thực phẩm quý hiếm nữa

1.2 Nguyên lý đông khô

Huyền dịch vi khuẩn được làm đông, nước sẽ chuyển thẳng từ trạng thái rắn sang trạng thái khí và thăng hoa nhờ máy hút chân không tạo ra áp suất thấp ở nhiệt độ rất thấp.[1]

Theo nguyên lý này tế bào vi khuẩn được làm khô mà vẫn giữ nguyên hình thái Khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc bằng một dung dịch thích hợp thì tế bào lại trở lại trạng thái ban đầu

1.2.1 Sự thăng hoa [14]

Trong quá trình đông khô thì sản phẩm ở trong môi trường áp suất chân không (nhỏ hơn 6.11 mbar) và hơi nước bay ra từ sản phẩm sẽ được ngưng tụ tại bề mặt (rất lạnh) của bộ ngưng tụ (ice condenser) Bộ ngưng tụ hoạt động như máy bơm hơi nước, máy bơm chân không để giữ áp suất chân không trong khoang

Nhưng để thăng hoa được thì sản phẩm phải được cấp nhiệt (theo nguyên lý nhiệt học thì bay hơi thì thu nhiệt) Khi đông khô ví dụ như các bình to đáy tròn thì nhiệt độ phòng chính là nguồn nhiệt cung cấp cho sản phẩm Nếu đông khô các lọ nhỏ trong khay thì nhiệt cấp cho sản phẩm là từ các giá đỡ sản phẩm(giá sản phẩm điều khiển được nhiệt độ)

Khoảng 90-99 % lượng nước được lấy ra từ sản phẩm trong quá trình đông khô chính (main drying), lượng nước liên kết trong sản phẩm còn lại sẽ được lấy ra trong quá trình đông khô cuối cùng (final drying) dưới áp suất chân không rất thấp

1.2.1 Sự thăng hoa

- Nếu áp suất khí quyển lớn hơn 6.11 mbar và cố định thì khi thay đổi nhiệt độ, nước sẽ tồn tại ở ba trạng thái

+ lỏng + rắn + khí

- Tại áp suất chính xác 6.11 mbar và nhiệt độ 0oC thì nước sẽ tồn tại cả ở ba trạng thái rắn, lỏng, khí (điểm cắt của ba trạng thái)

- nếu áp suất nhỏ hơn 6.11 mbar thì nước sẽ chuyển trực tiếp từ rắn sang khí và ngược lại bằng việc thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếp từ rắn sang khí được gọi là thăng hoa)

1.2.2 Chân không [15]

Định luật khí lý tưởng p × V = m × Rm × T = const

p = áp suất khí (Pa), 105 Pa = 1 bar

Ví dụ: 1,0 gam đá tại áp suất

1,0 mbar, thu được 1 m3 hơi 0,1 mbar, thu được 10 m3 hơi 0,01 mbar, thu được 100 m3 hơi Khi ở áp suất chân không rất sâu thì sẽ có một lượng rất lớn hơi nước tạo ra, nhưng không nhất thiết phải giảm nhanh lượng nước trong mẫu

1.2.3 Ap suất bay hơi [15]

Ap suất bay hơi là lực bay hơi của một chất lỏng Nó bằng hàm của nhiệt độ T và loại chất, đơn vị là (Pa), 105 Pa = 1 bar khi nhiệt độ tăng thì áp suất bay hơi sẽ tăng Đường cong áp suất bay hơi miêu tả sự chuyển đổi trạng thái rắn, lỏng, khí có dạng logarithmic [14]

1.2.4 Ap suất chân không : [16]

Độ chân không tốt: - áp suất bay hơi thấp và

- lượng hơi nước tạo ra nhiều

Rắn

Tan chảy

Nhiệt độ đông của sản phẩm là rất quan trọng để xác định độ chân không và nhiệt độ khô Trong quá trình khô, nhiệt độ sản phẩm được điều chỉnh chủ yếu bởi áp suất chân không (mà không bởi nhiệt độ giá) theo áp suất bay hơi của nước

Nhiệt độ bề mặt sản phẩm gần như độc lập với nhiệt độ giá Trong quá trình khô thì phải đảm bảo sản phẩm không bị tan chảy, bởi vậy nhiệt độ khô nên thấp hơn ít nhất nhiệt độ đông 10o

C Căn cứ vào nhiệt độ này ta dễ dàng tra được áp suất chân không khô theo bảng đường cong áp suất bay hơi [14]

Ví dụ : Nhiệt độ đông : teu = -10 o C Nhiệt độ khô : tdry = -20 oC

⇒Ap suất chân không : Pdry = 1, 030 mbar

1.2.5 Ap suất an toàn :

Để sản phẩm có độ an toàn cao nhất thì nhất thiết phải đặt áp suất an toàn Nếu áp suất trong buồng khô tăng quá cao (quá giới hạn áp suất an toàn) thì nhiệt độ của giá cấp cho sản phẩm phải được dừng và quá trình thăng hoa chậm lại, tránh được sự tan chảy của sản phẩm Nhiệt độ an toàn nên thấp hơn 5oC so với điểm tan chảy (hay điểm đông) [14] Theo đường cong áp suất bay hơi dễ dàng tìm được Psafe

Ví dụ : Nhiệt độ đông teu =-10oC Nhiệt độ khô t dry = -20 oC

Ap suất chân không Pdry= 1, 030 mbar Nhiệt độ an toàn tsaf = -15oC

Ap suất chân không an toàn Psaf = 1,650 mbar

1.2.6 Ap suất báo động:

Các máy lớn có giá điều nhiệt bằng chất lỏng thì có thể có hệ thống cảnh báo áp suất báo động Nếu áp suất trong buồng khô tăng tới giá trị đặt áp suất báo động thì máy sẽ cắt cấp nhiệt cho sản phẩm Bộ điều khiển sẽ cho ra âm thanh báo động và nhiệt độ giá được làm lạnh xuống nhiệt độ tiền đông càng nhanh càng tốt Nhiệt độ báo động nên thấp hơn nhiệt độ đông từ 3oC (5o C)[14]

Nhiệt độ đông teu = -10o C Nhiệt độ khô tdry =-20oC

Ap suất khô Pdry = 1,030 mbar Nhiệt độ an toàn tsaf = -15oC

Ap suất an toàn Psaf = 1,650 mbar Nhiệt độ báo động talarm = -13o C

Ap suất báo động Palarm =1,980 mbar

1.2.7 giới thiệu tá chất sử dụng trong kỹ thuật đông khô

Tá dược thường dùng:

Cho vi khuẩn : Sacarose :10 % Gelatin 2%

Hoặc Sữa phi kem 20%(ATCC Mỹ) Huyết thanh :

Saccarose 10% [29]

1.3 Các giai đoạn của quá trình đông khô [4], [11], [24], [30]

1.3.1 Giai đoạn làm đông

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp xuống và những tinh thể rắn được hình

thành Do đó, nếu làm đông nhanh thì tế bào ít bị tổn thương do kích thước tinh thể nhỏ, còn nếu làm đông chậm thì tế bào dễ bị tổn thương do kích thước tinh thể lớn làm rách tế bào

Giai đoạn làm đông chế phẩm làm cho các phản ứng hoá học bị giảm thiểu đồng thời làm ngưng hẳn các hoạt động xúc tác của các enzyme có trong tế bào VSV Kỹ thuật làm đông không chỉ tạo thể rắn cho chế phẩm mà quan trọng hơn là hình thành một trạng thái kết tinh tối ưu có thể tránh được sự huỷ hoại chế phẩm trong giai đoạn nước chuyển

từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí[4]

có nhiệt độ eutectic là –21,6 oC, dung dịch CaCl2 là –55 o C

+hình thành tinh thể: Đối với tố chất và thành phần hoạt tính của chế phẩm được làm đông đến một nhiệt độ xác định thì dung dịch chuyển sang trạng thái kết tinh một cách

từ từ bằng cách tăng dần nồng độ rắn, độ nhớt trong dung dịch và trở nên cứng như chất rắn

Ở nhiệt độ –1o

Cđến –4oC số tinh thể đá được tạo thành trong sinh phẩm rất ít, nên

có kích thước trung bình tương đối lớn Ở nhiệt độ –10oC đến -40oC số tinh thể đá tạo thành nhiều vô kể, nên kích thước rất nhỏ,khoảng từ 5-10 µ.m Ở nhiệt độ –80o

C thì chất lỏng sẽ không tạo thành được tinh thể mà chỉ tạo đươc chất rắn vô hình định (dạng thuỷ tinh thể)

Nhiều công trình nghiên cứu cho biết ở nhiệt độ cao hơn –30oC thì kích thước tinh thể phát triển bình thường ra xung quanh, lớn dần chiều dài cũng như chiều ngang.Ở nhiệt

độ thấp hơn –30o

C thì kích thước tinh thể đá chỉ phát triển theo chiều dài, nên tinh thể đá trở thành sợi dài bao bọc xung quanh tế bào.Trong trường hợp này các tinh thể đá không những không phá huỷ cấu trúc tế bào của chế phẩm mà bảo vệ toàn vẹn tế bào

Sự khác biệt các thành phần trong chế phẩm đóng vai trò quyết định quá trình làm đông.Do đó với mỗi loại chế phẩm thì có quy trình làm đông phù hợp nhằm tạo ra chế phẩm đông khô đạt chất lượng [4]

* Điểm ơ tectic và nhiệt độ đông toàn phần

- Ơtectic là cấu trúc tinh thể đá được hình thành có điểm tan chảy không đổi khả dĩ thấp nhất

- Trong chế phẩm mỗi thành phần có nhiệt độ đông (nhiệt độ ơtectic)riêng, ví dụ NaCl là –21,6oC dextran là –100C, gelatin là –11oC, glucose là –40o

Nhiệt độ đông toàn phần của chế phẩm là nhiệt độ thấp nhất xác định được bằng thiết bị đo,ví dụ nhiệt độ đông toàn phần của nước là 0 o

C, sữa là –13 oC, vẵcin là –25 oC

Nhiệt độ đông toàn phần của chế phẩm được xác định bằng cách dựa vào giản đồ lý thuyết đường biểu diễn nhiệt độ của các thành phần trong chế phẩm hoặc bằng thực nghiệm dựa vào sự thay đổi điện trở xuất của chế phẩm theo nhiệt độ khi chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn

Cách đơn giản để xác định điểm đông toàn phần của chế phẩm là điểm giao nhau của đường biễu diễn nhiệt độ và điện trở xuất

Khi nhiệt độ đông hoàn toàn của chế phẩm được xác định thì nhiệt độ làm khô và

áp xuất chân không phải được xác định cho phù hợp Để tránh hiện tượng tan chảy chế phẩm trong suốt quá trình làm khô thì nhiệt độ làm khô (nhiệt độ làm khô cấp1) phải thấp hơn nhiệt độ đông toàn phần ít nhất là 10 oC

* Tốc độ làm đông

Tốc độ làm đông là mối tương quan giữa nhiệt độ và thời gian Tốc độ làm đông liên quan đến hình thành cấu trúc tinh thể của chế phẩm khi chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn Tuỳ thuộc vào loại sản phẩm đông khô mà có tốc độ làm đông phù hợp để tạo hình thái tối ưu cho quá trình làm khô

Đối với chế phẩm phẩm đông khô là vi khuẩn thì tốc độ làm đông chậm nhỏ hơn hoặc bằng 0,5o C /phút

Chế phẩm là virut và các thành phần của virut thì tốc độ làm đông trung bình từ 0,5- 1,0o C / phút

Còn đối với các loại tế bào khác thì tốc độ làm đông nhanh từ 1,0-3,0 oC/phút

Trong quá trình làm đông, tốc độ làm đông khác nhau thì chế phẩm có hình thái tinh thể khác nhau

- Tốc độ làm đông chậm (< 0,5o C /phút): chế phẩm tạo thành có kích thước tinh thể lớn, số lượng tinh thể ít Các tinh thể này sắp xếp theo chiều thẳng đứng từ dưới lên trên,dạng này dễ thăng hoa và độ ẩm sau thăng hoa thấp

- Tốc độ làm đông nhanh(1,0 - 3,0oC /phút): chế phẩm tạo nhiều tinh thể, tinh thể có kích thước nhỏ Các tinh thể này sắp xếp không theo một trật tự nào,dạng này khó đông khô và ảnh hưởng đến độ ẩm sau đông khô Những chế phẩm có độ nhớt cao thì khi làm đông tạo nhiều tinh thể đá có kích thước rất nhỏ và khả năng thoát hơi nước kém trong giai đoạn làm khô Do đó, quá trình làm khô chậm lại và chế phẩm dễ bị thay đổi cấu trúc

Trong quá trình làm đông những chế phẩm có độ đặc càng cao thì nhiệt độ đông toàn phần càng thấp và còn tồn tại một số vùng trong chế phẩm chưa đông hoàn toàn Vì vậy phải pha loãng huyền dịch trước khi tiến hành đông khô

Khi nhiệt độ chế phẩm đạt 0oC (hình trên), huyền dịch chế phẩm vẫn còn ở trạng thái lỏng (A) điểm đông bắt đầu hình thành với số lượng ít B Các điểm đông phát triển tạo tinh thể có kích thước lớn, số lượng tinh thể ít và sắp xếp theo hướng từ dưới lên trên (C)

Tại (D) chế phẩm đông hoàn hoàn có cấu trúc ổn định Cấu trúc này tạo điều kiện cho quá trình thăng hoa và chế

Đồ thị 3 đông chậm vá quá trình kết tinh

Khi nhiệt độ chế phẩm đạt 0oC (hình trên) điểm đông hình thành với số lượng nhiều (A) các điểm đông bắt đầu phát triển lớn dần (B).Số lượng tinh thể nhiều, kích thước nhỏ (C) tại điểm (D) sinh phẩm đông hoàn toàn

Đến cuối giai đoạn làm đông yêu cầu chế phẩm phải đạt được một trạng thái phù hợp nhất cho giai đoạn thăng hoa Vì vậy nhiệt độ sau cùng của giai đoạn làm đông phải

Ngược lại, tốc độ làm đông quá chậm thì nước thẩm thấu ra ngoại bào ở mức tối

đa, nên môi trường nội bào quá cô đặc làm phá huỷ tế bào

Thực chất của quá trình đông khô diễn ra khi môi trường ngoại bào được làm đông Khả năng làm khô tế bào phụ thuộc vào tốc độ làm đông và khả năng thẩm thấu của tế bào

*Giai đoạn làm khô

Sau khi đạt được nhiệt độ đông và cấu trúc tinh thể phù hợp ở giai đoạn làm đông, chế phẩm được làm khô bằng cách hấp thụ nhiệt lượng để chuyển các phân

tử nước từ dạng tinh thể thành hơi trong đều kiện chân không mà không qua trạng thái lỏng gọi là quá trình thăng hoa

*Giai đoạn làm khô cấp một.[11]

Ở giai đoạn này, nhờ máy hút chân không tạo môi trường áp suất thấp nên nước

sẽ chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng sau đó được thăng hoa ra ngoài Khi quá trình làm khô kết thúc thì toàn bộ nước tự do sẽ bay hơi Lượng nước liên kết còn lại khoảng 7-8%

Trong suốt thời gian làm khô cấp 1, nhiệt độ dàn ngưng tụ, nhiệt độ chế phẩm và

áp suất chân không là những yếu tố quyết định tốc độ thăng hoa của chế phẩm Nhiệt độ của dàn ngưng tụ phải thấp hơn 15oC so với nhiệt độ làm khô của sản phẩm Nhiệt độ

Đồ thị 4: Đông nhanh và qúa trình kết tinh

làm khô phải thấp hơn nhiệt đô đông toàn phần từ 5- 10oC Áp lực chân không phải đạt

10-2 Torr hoặc thấp hơn nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thăng hoa diễn ra Khi nhiệt độ chế phẩm tương đương hoặc thấp hơn 3- 50 C so với nhiệt độ kệ thì giai đoạn làm khô cấp 1 kết thúc.[29]

Hinh 6 Sự thay đổi trạng thái chế phẩm trong giai đoạn làm đông

Trong quá trình làm khô cấp 1, nước tự do dưới dạng tinh thể được tách khỏi chế phẩm theo hướng từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong, tạo thành hai lớp gồm lớp khô và lớp đông, giữa hai lớp này là mặt phân cách

Hình 6 Quá trình thăng hoa của nước trong quá trình làm khô

Do áp suất hơi nước tại mặt phân cách lớn hơn áp suất hơi nước dàn ngưng tụ, nên hơi nước từ các tinh thể đá di chuyển ra khỏi chế phẩm đến bám vào dàn ngưng tụ

Nước ở trạng thái rắn nhận nhiệt lượng để chuyển sang hơi thoát khỏi sản phẩm, sau đó hơi nước thải nhiệt trở thành trạng thái rắn bám vào dàn ngưng tụ Nếu nhiệt độ sinh phẩm cao hơn nhiệt độ đông toàn phần thì chế phẩm sẽ bị tan chảy Vì vậy áp lực chân không và nhiệt độ chế phẩm phải được kiểm soát trong suốt quá trình làm khô

* Giai đoạn làm khô cấp hai

Sau khi giai đoạn làm khô cấp 1 kết thúc, chế phẩm có dạng khô xốp Tuy nhiên vẫn còn khoảng 7-8% lượng nước còn tồn tại dưới dạng nước liên kết Chế phẩm sẽ không ổn định về cấu trúc và hoá học cũng như độ ẩm tồn dư cao sau khi đông khô nếu lượng nước liên kết không được tách khỏi chế phẩm

Ơ giai đoạn làm khô cấp hai, nước liên kết tách khỏi chế phẩm bằng cách tăng nhiệt độ chế phẩm Giai đoạn này đòi hỏi áp suất chân không thấp hơn 10-3 Torr, nhiệt

độ dàn ngưng tụ phải thấp hơn –60 o

C Tuỳ thuộc vào loại chế phẩm mà thời gian làm khô cấp 2 bằng 1/3 đến 1/2 so với thời gian làm khô cấp 1.[29]

Trong giai đoạn thăng hoa, áp lực chân không và nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng của chủng VSV Vai trò của nhiệt lượng trong quá trình thăng hoa được minh hoạ

ở hình bên dưới

Hình 7 Chuyển hoá nhiệt và hơi nước trong quá trình làm khô

Trong quá trình đông khô, sản phẩm khô từ trên xuống và từ ngoài vào trong của lọ

chứa Do đo, hơi nước thăng hoa phải đi xuyên qua phần khô của sản phẩm với tốc độ thay đổi tuỳ thuộc vào độ xốp (cấu trúc tinh thể) và bề dày của phần khô Để kích thích

và duy trì tốc độ thăng hoa, áp lực chân không cần được điều chỉnh hạ xuống song song với nhiệt lượng gia tăng [10]

Lượng nước khi thăng hoa càng lớn sẽ giải phóng theo một lượng nhiệt lớn Nhiệt lượng này có thể làm tan trở lại và huỷ hoại một phần sản phẩm nếu như chúng không được giải phóng nhanh ra khỏi sản phẩm Do vậy, khi dùng nhiệt để kích thích quá trình thăng hoa phải kèm theo mức độ chân không phù hợp.[10]

Ở cuối giai đoạn đông khô nhiệt độ kích vẫn duy trì và nhiệt độ chung VSV tự động nâng lên dần Trong những trường hợp cần thiết, có thể cung cấp thêm nhiệt lượng để kích thích tách các phân tử nước còn lại bên trong chủng VSV, vì các phân tử này thường bám rất chặt bên trong sản phẩm Nhiệt độ kích ở giai đoạn này liên quan đến nhiệt độ sau cùng và tính ổn định của chủng sau đông khô Nhiệt độ này cần thiết phải được điều chỉnh trong khoảng+30oC đến + 50oC để chủng không bị huỷ hoại.[10]

Ap suất hơi nước thay đổi theo nhiệt độ, khi nhiệt độ chế phẩm tăng thì áp suất hơi nước tương ứng càng lớn, vì vậy độ chênh lệch áp suất hơi nước giữa mặt phân cách với dàn ngưng tụ càng lớn, do đó quá trình thăng hoa diễn ra càng nhanh

Ví dụ nhiệt độ chế phẩm ở –10oC có áp suất tương ứng là 2,560 mbar,ở –20oC là 1,030mbar, ở –40oC là 0,120 mbar, trong khi đó nhiệt độ ở dàn ngưng tụ ít nhất la -60 oC tương ứng 0,009 mbar.[4]

* Cơ chế truyền nhiệt.[4],[11]

Nhiệt lượng được truyền từ kệ vào chế phẩm theo hình thức dẫn nhiệt trực tiếp hoặc bức xạ nhiệt hoặc kết hợp cả hai hình thức truyền nhiệt này

Ở các thiết bị đông khô cũ nguồn cấp nhiệt bằng điện trở Còn thiết bị đông khô mới dùng dung dịch silicon tải nhiệt nên chênh lệnh nhiệt độ giữa các điểm trên bề măt kệ chỉ khoảng 1oC.[10]

Cuối giai đoạn làm khô, chế phẩm có dạng khô xốp và có tính háo nước rất mạnh nhưng vẫn còn một lượng nước nhỏ cố định trong sinh phẩm gọi là độ ẩm tồn dư Độ ẩm tồn dư được xác định khi áp suất hơi nước của sinh phẩm tương đương với áp suất hơi nước của dàn ngưng tụ tại một nhiệt độ xác định.[10][69]

Nếu độ ẩm tồn dư chưa đủ thấp thì tiếp tục loại nước liên kết trong chế phẩm bằng cách hạ thấp nhiệt độ của dàn ngưng tụ từ –60oC xuống –80oC hoặc tăng nhiệt độ sinh phẩm từ 20oC lên 30oC nhằm tăng độ chênh lệch áp suất hơi

nước giữa chế phẩm với dàn ngưng tụ Nhiệt độ chế phẩm tăng trong giới hạn cho

phép giảm độ ẩm tồn dư mà không huỷ hoại chế phẩm

Hình

thức

tr

Đông băng Đông khô cấp 1 Đông khô cấp 2

Thăng hoa

Tách nước liên kết

Độ ẩm tồn dư

Sinh phẩm đông băng

Nước liên kết Nước kết tinh

Giai đoạn đông khô

Hình 8 Lượng nước chuyển hóa trong quá trình đông khô