Nghiên cứu sử dụng pepsin để khử protein trong qui trình sản xuất chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng

Tính cấp thiết của đề tài: Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hóa học có sử dụng các loại hóa chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài gây nên sự thủ

LỜI CẢM ƠN

Báo cáo này là một trong những báo cáo lớn nhất để đánh dấu kết thúc quá trình học tập, là thành quả 16 năm học và phấn đấu Đây là cơ hội để em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người đã giúp đỡ em trong suốt những năm tháng qua

Qua 3 tháng nỗ lực phấn đấu, cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các thầy

cô và bạn bè em đã hoàn thành đề tài này Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô, Thạc Sĩ Ngô Thị Hoài Dương, người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình thực tập, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình thực tập và thực hiện đề tài

Sinh viên Nguyễn Thị Vân

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM ĐÔNG LẠNH .3

1.1.1 Tình hình xuất khẩu tôm ở Việt Nam những năm gần đây 3

1.1.2 Nguyên liệu còn lại (NLCL) trong chế biến tôm .3

1.1.2 Thành phần, tính chất của đầu và vỏ tôm .4

1.1.2.1 Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm .4

1.1.2.2 Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITIN 6

1.2.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên .6

1.2.2 Cấu tạo-tính chất của chitin 7

1.2.2.1 Cấu tạo của chitin 7

1.2.2.2 Tính chất của chitin 7

1.2.3 Ứng dụng của chitin - chitosan 8

1.2.4 Các phương pháp sản xuất chitin 10

1.2.5 Yêu cầu chất lượng sản phẩm chitin 11

1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 12

1.3.1 Enzyme, phân loại enzyme 12

1.3.2 Nguồn thu nhận enzyme protease 14

1.3.3 Cơ chế tác dụng của protease 15

1.3.4 Hoạt độ enzyme .16

1.3.5 Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease 16

1.3.5.1 Protein thủy phân .16

1.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein của enzyme protease 18

1.3.7 Tính ưu việt của enzyme protease và ứng dụng của chúng .20

1.3.7.1 Tính ưu việt của enzyme protease .20

1.3.7.2 Ứng dụng của enzyme protease 21

1.4 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN 23

1.4.1 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản .23

1.4.2 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm 25

1.4.3 Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản 26

1.4.3 Quy trình sử dụng enzyme Papain để sản xuất chitosan Luyến, 2003) 27

1.4.4 Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto 28

PHẦN 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31

2.1.1 Nguyên liệu vỏ tôm 31

2.1.2 Enzyme Protease 31

2.1.3 Hóa chất sử dụng 31

Tất cả các hóa chất sử dụng trong đề tài đều ở dạng tinh khiết dùng cho phân tích .31

2.1.4 Thiết bị: 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 31

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 32

2.2.3 Bố trí thí nghiệm tổng quát 32

2.2.4 Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật .33

2.2.4.1 Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ .33

2.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ

sung enzyme Pepsin 34

2.2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng 35

2.2.4.4 Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân bằng pepsin .36

2.2.4.5 Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin 37

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC 39

2.3.1 Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050 C theo TCVN 3700-1990 39

2.3.2 Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 5500C theo TCVN 4588–1988 39

2.3.3 Xác định hàm lượng protein còn lại: Hàm lượng protein còn lại trên chitin được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng sự giới thiệu .39

2.3.4 Xác định hiệu xuất khử khoáng và protein: 39

Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử khoáng (DA (%)) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000) .39

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng với HCl 1% 40

3.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin 40

3.2.1 Ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein 40

3.2.2 Ảnh hưởng đến hiệu quả khử khoáng: 42

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin tới hiệu quả khử protein 43

3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân của enzyme pepsin .44

3.5 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme pepsin 50

3.6 Đề xuất qui trình sản xuất chitin .62

3.6.1 Thuyết minh quy trình 62

3.6.2 Sơ đồ 62

3.6.3 Đánh giá chất lượng của sản phẩm chitin thu được 63

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 64

4.1 KẾT LUẬN 64

4.2 ĐỀ XUẤT 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tỷ lệ nguyên liệu còn lại của các loại tôm 4

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm 5

Bảng 1.3 Yêu cầu chất lượng của chitin trong các lĩnh vực khác nhau 12

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của các thông số lên hoạt động của enzym protease và chất xúc tác vô cơ 21

Bảng 1.5 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp sử lý kiềm một giai đoạn 25

Bảng 1.6 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất Chitosan 28

Bảng 2.1 Một số thiết bị thí nghiệm 31

Bảng 2.2 Ma trận bố trí thí nghiệm 37

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin 38

Bảng 3.1 Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng 40

Bảng 3.2 Kết quả thăm dò ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt động của enzyme pepsin 45

Bảng 3.3 Kết quả thí nghiệm tối ưu quá trình thủy phân bằng enzyme Pepsin 51

Bảng 3.4 Kết quả phân tích bậc cho mô hình hồi qui 52

Bảng 3.5 Kết quả phân tích ANOVA của mô hình hồi qui đã chọn 52

Bảng 3.6 Kết quả phân tích các chỉ số thống kê 53

Bảng 3.7 Kết quả tối ưu tương ứng với điều kiện 3 57

Bảng 3.8 So sánh chất lượng chitin giữa sơ đồ dự kiến và các quy trình khác 63

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của chitin 7

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease 15

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân protein 16

Hình 1.4 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản 24

Hình 1.5 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến, 2003) 25

Hình 1.6 Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản 26

Hình 1.7 Quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất chitosan 27

Hình 1.8 Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto 28

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 32

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng 33

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin 34

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng 35

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử protein .41

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử khoáng 42

Hình 3.3 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ pepsin đến hiệu quả khử protein và khoáng 43

Hình 3.4 Bảng đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố 46

Hình 3.5 Mô hình Half-Nomal Plot 46

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ 47

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhân tố nồng độ 48

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhân tố thời gian 48

Hình 3.9 Sự tương quan giữa nhiệt độ và nồng độ 49

Hình 3.10 Sự tương quan giữa nhiệt độ và thời gian 50

Hình 3.11 Kết quả tối ưu tương ứng với điều kiện 1 55

Hình 3.12 Kết quả tối ưu tương ứng với điều kiện 2 56

Hình 3.13 Mô hình thiết kế tối ưu 59

Hình 3.14 Kết quả tối ưu 60

Hình 3.15 Mặt đáp ứng và contour tại chế độ tối ưu 61

Hình 3.16 Quy trình sản xuất chitin với sự kết hợp của HCl và enzyme pepsin 62

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài:

Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hóa học có sử dụng các loại hóa chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài gây nên sự thủy phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994), biến đổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993) làm ảnh hưởng tới chất lượng của chitin-chitosan Ngoài ra sản xuất chitin theo phương pháp hóa học có nhiều hạn chế như thải ra môi trường nhiều chất thải có chứa chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý quá lớn làm ô nhiễm môi trường sống, nên tốn chi phí xử lý môi trường kéo theo sự tăng giá thành của sản phẩm, khi sản xuất theo phương pháp hóa học không tận thu được các chế phẩm sinh học khác như protein, astaxanthin…Và nó cũng gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Vì vậy, việc nghiên cứu một quy trình cho phép giảm tối đa lượng hóa chất sử dụng là rất cần thiết để góp phần giảm chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm

Phương pháp sản xuất chitin-chitosan bằng cách sử dụng enzyme đã góp phần khắc phục hạn chế nói trên của phương pháp hóa học như: thể tích chất thải không lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme có thể thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lí môi trường…Tuy nhiên việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp rất nhiều khó khăn như tăng chi phí, hiệu quả khử khoáng và protein thấp, thời gian kéo dài

Xuất phát từ thực tế như trên, được sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Chế Biến- Khoa Công Nghệ Thực Phẩm- Trường Đại Học Nha Trang, dưới sự hướng

dẫn của cô Thạc Sỹ Ngô Thị Hoài Dương, đề tài “Nghiên cứu sử dụng Pepsin để khử protein trong qui trình sản xuất Chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng” đã được thực hiện

2 Mục đích của đề tài:

Xác lập các thông số cho quá trình khử protein trên vỏ tôm thẻ chân trắng với enzyme Pepsin nhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao chất lượng của chitin thành phẩm

3 Tính khoa học, thực tiễn của đề tài

Cung cấp thêm các dẫn liệu khoa học về việc sử dụng enzyme trong công nghệ sản xuất chitin

Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu triển khai hướng sản xuất chitin thân thiện với môi trường ở quy mô lớn

4 Nội dung của đề tài

- Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin

- Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme tới khả năng khử protein của enzyme Pepsin

- Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và khử protein

- Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein với enzyme pepsin

- Tối ưu quá trình khử protein với Pepsin

- Đề xuất quy trình và đánh giá chất lượng của sản phẩm chitin thu được

PHẦN 1: TỔNG QUAN

ĐÔNG LẠNH

1.1.1 Tình hình xuất khẩu tôm ở Việt Nam những năm gần đây

Trong những năm gần đây ngành chế biến thủy sản ở nước ta phát triển mạnh mẽ, các sản phẩm thủy sản của chúng ta đã vươn ra nhiều nước trên thế giới ngay cả những thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật Bản, Châu Âu… Ngành đã tạo công ăn việc làm cho hàng triệu người lao động Bên cạnh đó còn đem về cho nhà nước một nguồn ngoại tệ không nhỏ nhờ việc xuất khẩu các mặt hàng thủy sản đặc biệt là mặt hàng thủy sản đông lạnh như: tôm, mực, cá….Trong đó tôm đông lạnh chiếm tỉ lệ không nhỏ trong tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm

Các mặt hàng tôm xuất khẩu rất đa dạng, nhưng chủ yếu đều được phát triển

từ tôm nguyên con bỏ đầu hoặc tôm lột

Năm 2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so với năm 2006 Năm 2008 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,27 tỉ USD Năm 2009 kim ngạch xuất khẩu cả năm nước đạt 4,3 tỷ USD Năm 2010 xuất khẩu thủy sản

của Việt Nam thiết lập kỷ lục mới với trên 5 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2009

Tôm là mặt hàng chủ lực đem lại con số 5 tỷ USD của thủy sản Việt Nam năm 2010 Đây là lần đầu tiên xuất khẩu tôm của Việt Nam vượt con số 2 tỷ USD, với 241.000 tấn, tăng 13,4% về khối lượng và 24,4% về giá trị so với 209.567 tấn và 1,675 tỷ USD của năm 2009 Năm 2011, XK thủy sản của Việt Nam đã cán đích 6,1 tỷ USD, tăng 21% so với năm 2010 và tăng gấp hơn 3 lần so với mức 2 tỷ USD năm 2002,

XK tôm của Việt Nam tiếp tục đà tăng trưởng mạnh với giá trị năm 2011 đạt gần 2,4 tỷ USD, trong đó XK tôm sú chiếm 59,7% tổng giá trị, XK tôm thẻ chân trắng

chiếm 29,3%, còn lại là tôm các loại khác Bộ NN và PTNT đặt mục tiêu năm 2012,

cả nước phấn đấu đạt tổng kim ngạch XK thủy sản 6,5 tỷ USD

1.1.2 Nguyên liệu còn lại (NLCL) trong chế biến tôm

Nguyên liệu còn lại sau quá trình sản xuất tôm đông lạnh xuất khẩu gồm có: đầu, vỏ, thịt vụn Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30-

70%, trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến (Watkin và cộng

sự, 1982; Evers và Carroll

Trong đó phần đầu thường chiếm 34-45% và phần vỏ 10-15% so với lượng

tôm nguyên liệu đưa vào chế biến [1] Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống loài

và giai đoạn sinh trưởng của chúng [1] [2]

Nguồn phế liệu này nếu biết tận dụng triệt để sẽ đem lại nguồn lợi nhuận khổng lồ Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao mà còn có ý nghĩa bảo vệ môi

1.1.2 Thành phần, tính chất của đầu và vỏ tôm

1.1.2.1 Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm [1] [4]

Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường

bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác của protein và các chất không hòa tan

Vỏ chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi, lớp không bị canxi hóa

Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện những thể hình hạt của vật

chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khí hoặc những không bào Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con đường cho canxi thẩm thấu vào và lớp này có chứa chitin

Lớp biểu bì: Những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ

bởi Fucxin, có điểm pH = 5,1; không chứa chitin Nó khác với các lớp vỏ còn lại, bắt màu xanh với aniline xanh Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của acid ở nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong Màu của lớp này thường vàng rất nhạt

Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải

đều khắp và lớp có chứa chitin

Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một

phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin-protein bền vững không có canxi và puinone

1.1.2.2 Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm

Bảng 1.2 Thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm [5]

Đơn vị: (%)

Bộ phận Protein Chất béo Chitin Tro Canxi Photpho

Tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc

điểm sinh thái, sinh lý…

 Thành phần:

- Protein

Protein đầu vỏ tôm phần lớn thuộc loại khó tiêu và khó trích ly, protein đầu

và vỏ tôm thường tồn tại ở 2 dạng chính là dạng tự do (có trong nội tạng và cơ gắn với phần thân tôm) và dạng liên kết không hòa tan, thường liên kết với chitin hoặc canxi cacbonat, lipid tạo thành lipoprotein, sắc tố tạo proteincarotenoid…như một thể thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

- Enzyme

Trong đầu tôm chứa một lượng không nhỏ enzyme nội tại, đó là enzyme protease Nó tồn tại trong nội tạng nên chủ yếu nằm trong đầu tôm Hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đv hoạt độ/g tươi Ngoài ra còn có enzyme alkaline phosphatease, chitinase, N-acetyl glucosamidase, lipaza, tyrozinaza

bị oxi hóa thành Astaxin

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHITIN [1]

1.2.1 Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên

Chitin là polysaccharide mạch thẳng, phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật Ở động vật thủy sản, chitin tồn tại rất nhiều, nó là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ bao ở một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác (tôm, cua, ghẹ), giun tròn, chitin được coi là chất tạo xương hữu cơ chính ở động vật không xương sống

Trong thực vật: Chitin có trong vách tế bào của nấm và một số loại tảo chlorophyceae Vì vậy, chúng là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất Chitin-Chitosan

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể Nó có cấu trúc gồm nhiều phân

tử đường được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dạng sợi

ít nhiều có tổ chức Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của Chitin, nó liên kết dưới dạng phức hợp chitin-protein, chitin với các hợp chất hữu cơ,…khi tồn tại như thế chitin có sự đề kháng với các chất thủy phân, hóa học và enzyme Do đó nó gây khó khăn cho việc tách chiết và tinh chế Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và

sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người ta có thể thấy sự thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của Chitin

Trong tự nhiên, Chitosan rất hiếm gặp, chỉ có trong vách một số lớp vi nấm (đặc biệt: zygomycetes, mucor,…) và ở vài loại côn trùng như ở thành bụng của mối chúa

1.2.2 Cấu tạo-tính chất của chitin

1.2.2.1 Cấu tạo của chitin

Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, có cấu trúc tuyến tính gồm các đơn

vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside R:-NH-COCH3

Công thức phân tử: ( C8H13O5N)n

Phân tử lượng: M=(203.19)n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:

Đối với tôm hùm: n=700-800

Đối với cua: n=500-600

Đối với tôm thẻ: n= 400-500

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Cấu trúc của chitin

1.2.2.2 Tính chất của chitin

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo

Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO4, nước Javen, NaClO,…người

ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho Chitin

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884-890cm

Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao,

có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da Chitin bị enzyme kháng khuẩn lysozyme, một loại enzyme chỉ có ở cơ thể người, phân giải thành monomer N-acetyl-D-glucosamine

Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac (NH3), không hòa tan trong thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia Điều này có thể là do

sự thay đổi nhóm hydroxyl (OH) tại vị trí C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH3) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết

Khi nung nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử mất gốc acetyl tạo thành chitosan Khi đun nóng chitin trong acid HCl đặc thì chitin sẽ bị thủy phân tạo thành Glucosamine 85.5%, acid acetic 14,5%

1.2.3 Ứng dụng của chitin - chitosan [1] [6] [7]

- Trong y học và mỹ phẩm

Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược độn, tá dược chính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…làm chất mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác dụng chậm kéo dài, làm hoạt chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết bỏng, vết mổ vô trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể, hạ lipid và cholesterol trong máu, thuốc chữa bệnh đau dạ dày, tiểu đường, xương khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư, chống HIV

Dùng làm vật liệu y học: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép

Trong mỹ phẩm Chitosan được bổ sung vào kem chống khô da, kem lột mặt

để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím

- Trong công nghệ thực phẩm [8]

Chitosan được xem như một phụ gia tạo độ cứng, tạo keo, phân lớp và khử acid của trái cây và đồ uống, tăng cường mùi vị tự nhiên Tạo màng để bao gói thực phẩm, hoa quả, rau tươi Là một polymer dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học đa dạng, chitosan được coi là thành phần bổ dưỡng đưa vào thực phẩm,

bánh kẹo, nước giải khát, thức ăn vật nuôi và thủy sản Chitosan được sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm

- Ứng dụng trong nông nghiệp [1] [7]

Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh

Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa

- Ứng dụng trong sinh học

Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh vật, làm chất mang sử dụng trong sắc kí chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp polymer sinh học

- Ứng dụng trong các nghành công nghiệp khác

Trong công nghiệp dệt:

Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa, ưu điểm có thể thay thế được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ sát, bề mặt đẹp, bền trong kiềm

Làm vải chịu nước, không bắt lửa: Hòa tan Chitosan trong dung dịch acid acetic loãng cùng với axetat nhôm và acid stearic thu được hỗn hợp Hỗn hợp này đem sơn lên vải, khi khô tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và không bắt lửa Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động

Làm sợi chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na2SO4 bảo hòa rồi đem kéo sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai Đem sợi này trộn với sợi cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi chitin-cellulose Khả năng bắt màu thuốc nhuộm càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin

Trong công nghiệp giấy:

Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng bằng 1% trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bên của giấy khi ẩm ướt, tăng độ nét khi in Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy

Trong ngành phim ảnh:

Phim chitosan có độ nhớt rất cao, không tan trong nước, acid Độ cứng được cải thiện bằng cách tổng hợp đúc chitosan, rồi xử lý bằng dung dịch acid

Ứng dụng trong mỹ phẩm:

Chitosan được ứng dụng trong sản xuất kem chống khô da, do bản chất chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì da bởi những nhóm NH4 + thường được các nhà khoa học gắn với những chất giữ nước hoặc những chất lọc tia cực tím Vì vậy, chitosan là gạch nối giữa kem và da

1.2.4 Các phương pháp sản xuất chitin [4][9]

Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy

ở dạng tinh khiết Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và canxi

Vì vậy, nó cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kì mục đích thương mại nào

Hiện nay việc làm sạch chitin bao gồm hai bước chính:

- Khử khoáng: Loại bỏ khoáng bằng acid hoặc một tác nhân tạo phức

- Khử protein: Tách protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease

Phương pháp hóa học: Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc

sử dụng HCl hoặc acid hữu cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phòng với cơ chế như sau:

CaCO 3 + 2HCl = CaCl 2 + CO 2 + H 2 O

Ca 3 (PO4) 2 + 6HCl = 3CaCl 2 + 2H 3 PO 4

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này:

a Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn

đến sản phẩm còn nhiều tạp chất Ngược lại, nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất lượng sản phẩm

b Tỷ lệ acid/nguyên liệu: Nếu tỷ lệ này quá thấp thì sẽ không khử hết

khoáng, nếu quá lớn sẽ ảnh hưởng xấu tới mạch, đồng thời tốn chi phí

c Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng

trực tiếp tới chất lượng của sản phẩm Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị nát sẽ rất khó xử lí ở những công đoạn tiếp theo, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm cuối cùng Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không được loại triệt để

Thông tường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian xử lí ngắn, ngược lại, nếu có điều kiện thì tiến hành ở nhiệt độ thấp cùng với thời gian xử lí dài thì chất lượng sản phẩm thu được sẽ cao hơn

Phương pháp sinh học: Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc

sử dụng hệ enzyme có sẵn trong phế liệu tôm hoặc bổ sung enzyme nguồn gốc từ thực vật (papain, bromelain…), động vật (nội tạng cá thu,cá ngừ, mực ống…), vi sinh vật (protease từ nấm mốc và vi khuẩn) để thủy phân protein đầu tôm thành các phần peptid, aminoacid và thu hồi chúng

Giống phương pháp sinh học, trải qua hai bước khử khoáng và khử protein tuy nhiên khử khoáng có thể dùng phương pháp lên men lactic hoặc ủ xilo và công đoạn khử protein không sử dụng hóa chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để Phương pháp sinh học có thể được thực hiện ở cả hai công đoạn hoặc kết hợp khử khoáng theo phương pháp hóa

học kết hợp khử protein theo phương pháp sinh học [2]

Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp rất nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm cao tùy thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hóa học nhưng không thể đạt được bằng phương pháp sinh học Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp

Trong phương pháp sinh học thì thể tích chất thải không lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme có thể thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lí môi trường Vì vậy, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng nhất hơn về các đặc tính lý hóa thì chúng ta nên áp dụng phương pháp sử lý nhẹ hơn như việc sử dụng enzyme

1.2.5 Yêu cầu chất lượng sản phẩm chitin [18]

Tùy theo mục đích sử dụng và yêu cầu của khách hàng mà yêu cầu về chất lượng của chitin cũng thay đổi

Bảng 1.3 Yêu cầu chất lượng của chitin trong các lĩnh vực khác nhau

Hạng mục Dùng trong công

nghiệp Dùng trong y dược

Dùng trong thực phẩm

Hình dạng bên

ngoài

Dạng vảy màu trắng hoặc vàng nhạt Dạng vảy màu trắng Màu trắng tinh

Quy cách bao gói Bao tải dệt chuẩn, trọng lượng tịnh 10 kg/bao hoặc đóng gói

theo yêu cầu khách hàng

1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE [10]

1.3.1 Enzyme, phân loại enzyme

Enzym là protein có hoạt tính xúc tác, có phân tử lượng từ 20 000 đển 1 000 000 dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonucleaza 12 700 dalton) Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường gần pH sinh lý

Enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao, đó là khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng

+ Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối: enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu liên kết nhất định và đòi hỏi rất khắt khe các nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà enzyme tác dụng

+ Đặc hiệu cơ chất tương đối: enzyme chọn một kiểu liên kết để xúc tác nhưng đòi hỏi không quá khắt khe với nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà nó tác dụng

Do những đặc điểm trên, việc nghiên cứu và ứng dụng của enzym có ý nghĩa rất to lớn về mặt lý thuyết cũng như về mặt thực tế áp dụng

Phân loại enzyme: [15]

 Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:

 Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ

của mạch polypeptit

 Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon

của mạch polypeptit

 Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit

 Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch

 Theo Barett và Donald (1956), protease được phân ra thành 2 nhóm lớn là:

 Endopeptidase: Là các enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch

polypeptit Chúng là những enzyme được sử dụng nhiều nhất để thủy phân protein cho tính đặc hiệu rộng hơn và được phân thành bốn nhóm sau:

- Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những protease mà trong trung tâm

hoạt động của nó có nhóm (-OH) của axit amin serin Phân nhóm này gồm các enzyme như: Trypsin, Chymotrypsin

- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt

động của nó có nhóm Thiol (-SH) của axit amin xistein Nhóm này gồm các enzyme Cathepsin

- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease mà trong trung tâm

hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (-COOH) của aspartic như enzyme Pepsin

- Phân nhóm 4: Protease – kim loại Đây là những protease mà trong trung

tâm hoạt động của nó có ion kim loại Enzyme này hoạt động trong môi trường trung tính Ví dụ như Collagenase

 Exopeptidase (peptidase): Là các enzyme không có khả năng thủy phân

liên kết peptid ngoài cùng của chuỗi polypeptide hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl

để lần lượt giải phóng ra các axit amin tự do ra khỏi chuỗi polypeptit Vì vậy, chúng còn được gọi là aminopeptidase hoặc cacboxypeptidase Ngoài ra, những exopeptidase còn có thể liên kết với các endopeptidase để thực hiện một sự thủy phân phức tạp hơn

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

1.3.2 Nguồn thu nhận enzyme protease.[15]

a Từ động vật: enzyme đuợc tách ra từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột

và nội tạng của một số loài thủy sản (mực, cá,…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin…

b Từ thực vật: có thể thu nhận được papain từ đu đủ, bromelain từ thân, lá,

vỏ dứa

c Nguồn vi sinh vật

Enzyme Protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm

nhiều loại thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và

một số loại nấm men

- Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng

500 tấn Chiếm khoảng 59% enzyme sử dụng Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein

[4]

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis,

B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất ( Nguyễn Trọng Cẩn

và cộng sự, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp

trong vùng pH trung tính và kiềm yếu

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau:

 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

 Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu nhiều lần quanh năm

 Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó

1.3.3 Cơ chế tác dụng của protease [15]

Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein có tính đặc hiệu cao, nó có khả năng tương tác lên các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và cơ chất tương tự, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra khi có yếu tố nước tham gia Thông thường enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất phải trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức

hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết vandecvan

Giai đoạn 2: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra sự biến đổi cơ chất,

dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn 3: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và enzyme được

giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease

Trong đó:

E: Kí hiệu cho enzyme

S: Kí hiệu cho cơ chất

P và P+ biểu thị kết quả các peptid có kích thước khác nhau được tách ra

E + S ES EP + H – P+ E + P – OH + H – P+

H2O

b : độ pha loãng của dịch enzyme

c : thể tích của dịch thu được để đo

t : thời gian xảy ra phản ứng (phút)

1.3.5 Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease

1.3.5.1 Protein thủy phân [11][12]

Protein là một chuỗi polymer dài, bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên peptid Phản ứng liên quan tới việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein

Trong môi trường nước, sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình 1.3

Protease

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân protein

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự tấn công nuclephilic bởi phân tử nước, tạo thành axit cacboxylic và amin Nhóm cacboxyl và nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều hơn hay ít ion hóa hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân Từ đây sẽ hình thành anion RCOOH- và cation R-NH3+

Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH2) có thể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion RCOOH - và cation R-NH3

+ Vì vậy trong quá trình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein Sự thủy phân protein xảy ra rất chậm ở điều kiện bình thường như pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn như amino axit Enzyme mà xúc tác cho phản ứng thủy phân protein là protease hay proteinase

Quá trình thủy phân diễn ra như sau:

Enzyme enzyme enzyme

Do vậy, tùy thuộc vào mức độ thủy phân, thời gian thủy phân mà người ta có thể thu được peptid hay axit amin

Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân và cấu trúc của peptid tạo thành Điều này phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein

và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt độ, thời gian, pH… Giá trị dinh dưỡng của protein thường được giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà tiến hành dưới các điều kiện phản ứng nhẹ nhàng Protein bị cắt mạch thành các đơn vị nhỏ hơn như peptid hay acid amin

Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ thủy phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian Phản ứng thủy phân tạm dừng khi không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme Độ thủy phân tối đa có thể đạt được phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và đặc trưng của enzyme

1.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein của enzyme protease [10] [11] [15]

Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, xúc tác cho các phản ứng bên trong và ngoài cơ thể Hoạt động của enzym phụ thuộc chặt chẽ vào nhiều yếu

tố khác nhau như: nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzym và cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hóa…Tất cả các yếu tố trên nếu thích hợp thì vận tốc phản ứng do enzym

sẽ là tối đa

*Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tính chất của enzym Nhiệt

độ cao làm biến tính không thuận nghịch enzym Nhiệt độ thấp làm biến tính thuận nghịch enzym, tức là khi đưa enzym từ nhiệt độ thấp lên nhiệt độ bình thường, thì enzym sẽ phục hồi khả năng xúc tác của mình nên người ta thường bảo quản enzym

ở nhiệt độ thấp Giá trị nhiệt độ mà enzym bắt đầu mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn Giá trị nhiệt độ mà enzym thể hiện cao nhất khả năng xúc tác gọi là nhiệt độ tối thích

Cùng một enzym nhưng lấy từ các nguồn khác nhau thì vùng nhiệt độ tối thích cũng khác nhau

*Ảnh hưởng của pH môi trường

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động mạnh trong vùng axit hay kiềm Phế liệu tôm có thể bị thủy phân bởi enzyme protease có sẵn trong đầu tôm vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trường có pH thích hợp cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hưởng của các enzyme khác

Tại pH tối thích thì enzym lẫn cơ chất đạt đến trạng thái ion hóa thích hợp nhất khiến cho chúng dễ dàng kết hợp với nhau nên vận tốc phản ứng tăng lên

* Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Chất kìm hãm là những chất làm giảm khả năng xúc tác của enzyme, có khi làm cho enzyme vô hoạt Những chất kìm hãm thường là những chất hữu cơ phân tử nhỏ, các ion lạ, đặc biệt là các ion kim loại nặng rất độc với enzyme (Cu2+, Hg2+, Cd2+,…)

*Ảnh hưởng của chất kích hoạt

Chất kích hoạt là những chất có khả năng làm tăng hiệu lực xúc tác của enzyme hoặc chuyển enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Mỗi enzyme đòi hỏi cho mình chất hoạt hóa riêng

Vai trò của chất hoạt hóa:

Phục hồi một số nhóm chức hoạt động yếu hoặc không hoạt động thành hoạt động Các chất hoạt hóa có khả năng cắt đứt 1 vài đoạn peptid đang kìm hãm sự hình thành trung tâm hoạt động của enzyme Chất kích hoạt có thể là ion kim loại kiềm: Ba2+, Ca2+, Cl-, Br-, I-… những ion này có vai trò làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất, tăng diện tích tiếp xúc giữ enzyme với cơ chất, ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác

* Ảnh hưởng của nồng độ enzyme:

Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng nồng độ enzyme protease thì quá trình thủy phân xảy ra càng mãnh liệt Khi nồng độ enzyme bão hòa với nồng

độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa vận tốc của quá trình thủy phân rất ít thay đổi

* Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất:

Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là phế liệu tôm, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme Quá trình này cứ tiếp tục xảy

ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lượng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng

*Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc:

Khi thủy phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease và phế liệu tôm cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ phế liệu tôm Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại

* Ảnh hưởng của thời gian:

Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất Nhưng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra nhiều sản phẩm cấp thấp như: NH3, H2S, indol, scaptol,

…đồng thời khi kéo dài hiệu quả kinh tế kém Khi rút ngắn thời gian thủy phân, sự thủy phân protein chưa triệt để dẫn tới hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu và gây khó khăn cho khâu lọc rửa để thu dịch protein

* Độ tươi của nguyên liệu:

Độ tươi của phế liệu tôm có vai trò quan trọng quyết định đến chất lượng của sản phẩm protein thu hồi từ quá trình thủy phân và chitin Độ tươi của phế liệu tôm giảm thì làm giảm chất lượng của bột protein do có sự phân hủy protein trong đầu tôm tạo thành những sản phẩm cấp thấp như: indol, scaptol, NH3, H2S …gây ra mùi khó chịu cho sản phẩm

* Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân:

Nước là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến phản ứng thủy phân Nó có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, bởi lẽ nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương, là môi trường khuyếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho tốc độ phản ứng xảy ra Do vậy quá trình thủy phân nguyên liệu đầu tôm nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ thấp sẽ hạn chế được hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy sản phẩm thành các sản phẩm thứ cấp Vì vậy, ta phải xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

1.3.7 Tính ưu việt của enzyme protease và ứng dụng của chúng

1.3.7.1 Tính ưu việt của enzyme protease.[19]

Enzyme là chất xúc tác cho phản ứng hóa sinh Bản chất của enzyme là

protein Nhưng so với chất xúc tác vô cơ, enzyme có những đặc tính ưu việt hơn

- Phản ứng thực hiện gần như có hiệu quả 100% và không kèm theo phụ phẩm thừa

- Đồng thời có thể xảy ra nhiều phản ứng độc lập khác nhau, không bị rối bởi các sản phẩm phụ

- Vận tốc phẩm ứng nhanh hơn, cường độ xúc tác mạnh hơn

- Điều kiện phản ứng ôn hòa, đại đa số xảy ra ở môi trường trung tính

- Các phản ứng chịu sự điều hòa hợp lý và tiết kiệm nhất, tiêu tốn năng lượng là tối thiểu

- Một đặc tính rất quan trọng nữa của enzyme là trong quá trình thực hiện phản ứng nó không bị phá hủy Khi phản ứng xúc tác kết thúc, chúng được tự do và tiếp tục xúc tác các phân tử cơ chất mới

Chính vì vậy enzyme ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và kỹ thuật

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của các thông số lên hoạt động của enzym protease và

1.3.7.2 Ứng dụng của enzyme protease [11]

- Trong hóa phân tích : dùng để định tính và định lượng các chất

- Trong y học : có thể dùng enzyme để chữa bệnh, sản suất các sinh tố và các chất

kháng sinh Ví dụ : có thể dùng enzyme để tăng thêm lượng enzyme cho cơ thể, chữa các bệnh thiếu enzyme bẩm sinh hoặc dùng làm các nội quan nhân tạo, dùng enzyme để chữa các bệnh tiêu hóa kém hoặc để loại bỏ các phần mô bị hỏng,

bị thối ở các ổ viêm, các vết thương hoặc hòa tan các cục máu đông làm tắc nghẽn

mạch máu Ngoài ra cũng có thể dùng enzyme để phân giải thuốc khi cơ thể bị dị ứng với thuốc

- Trong công nghiệp :

Trong công nghiệp xà phòng dùng làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp

Sử dụng enzyme amylase để khử hồ trên vải trong công nghiệp

Sử dụng protease của Asp – oryzea 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp thuộc da, cho hiệu suất cao hơn phương pháp vôi sunfua

Dùng enzyme thủy phân bào mòn màng cellulose để trích ly các chất keo trong rong biển

Dùng enzyme để sản xuất bột giấy và giấy

- Ứng dụng trong thực phẩm : chế phẩm enzyme được sử dụng rất rộng rãi

trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân protein trong thịt

Trong chế biến thủy sản: Chế biến nước mắm ngắn ngày rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao hiệu quả kinh tế

Trong công nghiệp sữa: protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ tác dụng làm đông tụ sữa

Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian nhào trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và độ nở tốt hơn

Trong sản xuất nước giải khát: làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Làm trong và ổn định nước quả, rượu vang

- Trong nông nghiệp:

Có thể dùng enzyme sản xuất thức ăn cho động vật nhằm tăng giá trị dinh dưỡng cho thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn Các enzyme được sử dụng với mục đích này thường là các enzyme thủy phân như amylase, protease, đặc biệt là cellulose, hemicellulose Chúng thủy phân các phân tử lớn thành dạng dễ hấp thụ hơn nên thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn lên khoảng 10%, tăng trọng gia súc trung bình 10-15%

- Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm từ phế liệu thủy sản

Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm từ phế liệu tôm, cua, ghẹ Việc kết hợp sử dụng enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin-chitosan có ưu thế hơn

so với phương pháp hóa học truyền thống Nó giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vượt trội về chất lượng chitin, chitosan thu được và thu hồi sản phẩm protein-astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử

lý môi trường Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản Đây

là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn Chitin-chitosan thu được có chất lượng cao hơn so với phương pháp hóa học, đặc biệt là độ nhớt và phân tử lượng Đồng thời, giảm hơn

50% lượng hóa chất sử dụng so với phương pháp hóa học truyền thống [3]

1.4 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN

Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin-chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ…Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin-chitosan đó là: Nhật,

Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp Sau đây là một số nghiên cứu tiêu biểu:

1.4.1 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản

Nhận xét: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy

màu Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm

Hình 1.4 Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản

HCl 6 N

T 0 phòng

T =48h w/v = 1/2,5

NaOH 8%

T 0 =100 0 C

T = 2h w/v = 1/2,5

NaOH 40%

T 0 =24 0 C

T = 24h w/v = 1/1

Vỏ tôm khô

Rửa trung tính Ngâm HCl

1.4.2 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến)

Hình 1.5 Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học

với một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến, 2003)

Bảng 1.5 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương

pháp sử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)

HCl 10%

T 0 phòng

t = 5h w/v = 1/10

NaOH 40%

T 0 = 80 ±2 0 C

T = 5h w/v=1/10

1.4.3 Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản

Quy trình của Trung Tâm Chế Biến có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi

máy móc thiết bị phức tạp Do đó, rất dễ dàng để sản xuất lớn Tuy nhiên thời gian sản xuất kéo dài và nồng độ hóa chất sử dụng còn khá cao, vẫn chưa có hướng xử lý nước thải từ quá trình sản xuất

Hình 1.6 Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản

HCl 7%

T 0 phòng

t =24h w/v=1/5

NaOH 6%

T 0 phòng

T = 24h w/v = 1/5

NaOH 40%

T 0 = 80 0 C

T =6,5h w/v = 1/10

1.4.3 Quy trình sử dụng enzyme Papain để sản xuất chitosan ( Trần Thị Luyến, 2003)

Hình 1.7 Quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất chitosan ( Trần Thị Luyến, 2003)

HCl 10%

T 0 phòng

T =5h w/v =1/10

HCl 10%

T 0 phòng

T =5h w/v =1/10

Bảng 1.6 Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất Chitosan (Trần Thị Luyến, 2003)

1.4.4 Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto

Hình 1.8 Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto

pH = 8,5

t 0 = 55 0 C

tỷ lệ E/NL = 3% w/v = 1/1

Khử protein bằng enzyme Alcalase

Bột protein Sấy lạnh Phần dịch nổi phía trên

Ngoài ra, còn có rất nhiều các nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học khác trên thế giới cũng như tại Việt Nam như:

Gagne và Simpson (1993) đầu tư ứng dụng chymotrypsin và papain để khử protein của phế liệu tôm Nghiên cứu chỉ ra protein còn lại trong phế liệu sau khi thủy phân là 1,3 % khi xử lý bằng chymotrypsin và 2,8% với papain

Theo Jen-Kuo Yang và cộng sự (1999) sử dụng protease từ Bacillus subtilis

ở nhiệt độ 500C, pH 8,0 để khử protein từ vỏ tôm, vỏ ghẹ, vỏ tôm hùm trong công nghệ sản xuất chitosan Kết quả đã loại bỏ được 88%, 67%, 83% protein theo thứ tự

Synowiecki và cộng sự (2002) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein

của phế liệu vỏ tôm Crangon cragon nhằm thu hồi chitin và protein Ban đầu vỏ tôm Crangon cragon được khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 200C trong 30 phút và khử protein bởi enzyme thương mại Alcalase ở 550C và pH 8,5 Dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (Nx6,25) Hàm lượng protein còn lại sau thủy phân khoảng 4% có thể do trong quá trình thủy phân

có sự kết hợp khử protein bằng NaOH 4M

Holanda và Netto, (2006), nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và

pacreatin Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42%

protein; 31,98% tro; và 19,92% chitin Tiến hành thủy phân khử protein bằng enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3%, nhiệt độ 600C, pH 8,5 Kết quả cho thấy rằng Alcalase có hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin, chitin cao hơn so với trypsin, chimotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi protein từ 57,5% lên 64,6% và astaxanthin từ 4,7 lên 5,7mg/100g phế liệu khô

Rao và Stevens (2005) đã sản xuất Chitin bằng cách ủ xi lô đầu và vỏ tôm

với Lactobacillus plantarum 541 Hiệu suất thu hồi Chitin từ đầu và vỏ tôm là 4,5%

và 13% với đầu tôm đã khử được 83% protein và 88% khoáng, khử được 66% protein và 63% khoáng từ vỏ tôm

Gần đây Trường đại học Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý,

ứng dụng công nghệ enzyme và có nhiều kết quả được công bố đã góp phần đáp ứng yêu cầu cấp bách xử lý phế liệu tôm đông lạnh và trước những yêu cầu khắt khe hơn về chất lượng chitin - chitosan trên thị trường

Trần Thị Luyến và Đỗ Thị Bích Thủy (2006) nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp

vi khuẩn Bacillussubtilis để loại bỏ protein ra khỏi vỏ của phế liệu tôm Sau 24h

phần trăm protein còn lại trong phế liệu tôm so với mẫu chưa xử lý là 12,99%

PHẦN 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu vỏ tôm

Vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) được chọn là đối tượng nghiên

cứu Vỏ được lấy từ nguyên liệu tôm Thẻ chân trắng chế biến tại Công ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17), Khánh Hòa

Model Memmert WNB 29

Hãng sản xuất Memmert - Đức VELP- Italy

Công ty (Nhà máy) và nước sản xuất: Shimazu,

Nhật

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu

Nguyên liệu vỏ tôm được thu từ phân xưởng chế biến, Công Ty Cổ Phần Nha Trang Seafoods (F17) Yêu cầu nguyên liệu phải còn tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất Nguyên liệu sau khi lấy cho ngay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm Nguyên liệu được loại bỏ tạp chất, ép sơ bộ để tách nước và tiến hành làm thí nghiệm Trong trường hợp chưa làm ngay thì nguyên liệu được cho vào túi polymer (mỗi túi 1kg),

và bảo quản đông ở nhiệt độ -200C Thời gian bảo quản 1 tháng

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và

bổ sung enzyme tới khả năng khử protein của enzyme Pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

- Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố và tối ưu quá trình thủy phân protein với enzyme pepsin bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

2.2.3 Bố trí thí nghiệm tổng quát

a Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]

Xác định hàm lượng protein và hàm lượng khoáng sau 2 giờ khử khoáng

Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và

Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến hoạt động của enzyme pepsin

Tỉ lệ E/NL: [5000-20000] Nhiệt độ: [28-430C] Thời gian: [6÷18]