Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được từ tôm hùm ở khánh hòa

Đến những năm của thế kỷ 18, thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ lần đầu tiên được Pasteur và Joubert sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên đ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự giúp

đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè Nhờ đó mà tôi đã hoàn thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến:

Trước hết là ThS Lê Phương Chung, người trực tiếp hướng dẫn đề tài Trong suốt thời gian thực hiện, thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn thành đồ án đúng định hướng ban đầu

Sau đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Văn Duy, Viện phó, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đồ án này Đồng thời bày

tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi, cung cấp đầy đủ thiết bị, dụng cụ cho tôi thực hiện đề tài một cách xuyên suốt

Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, chị Nguyễn Minh Nhật, và các anh chị cao học

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó Chúc tất cả mọi người sức khỏe thành đạt

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT vi

LỜI MỞ ĐẦU 2

Chương I TỔNG QUAN 4

1.1 Bacteriocin 4

1.1.1 Khái niệm 4

1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin 4

1.1.3 Phân loại 6

1.1.4 Tính chất của bacteriocin 13

1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin 15

1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin 16

1.2 Tôm hùm 19

1.2.1 Phân bố 20

1.2.2 Tập tính 20

1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng 21

1.2.4 Đặc điểm sinh sản 22

1.2.5 Giá trị của tôm hùm 22

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bacteriocin 23

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên liệu 28

2.1.2 Mẫu tôm hùm 28

2.1.3 Chủng chỉ thị 28

2.1.4 Môi trường hóa chất và thuốc thử 28

2.1.5 Thiết bị chuyên dụng 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 32

2.2.2 Tuyển chọn chủng sinh bacteriocin 34

2.2.3 Xác định đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 38

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm Hùm 44

3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập 45

3.3 Xác định hoạt tính bacteriocin 47

3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 48

3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 50

3.5.1 Khả năng chịu muối 50

3.5.2 Thử catalase 51

3.5.3 Tính di động 52

3.5.4 Khả năng sinh hơi 53

3.6 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 53

Chương IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I 5

Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II 6

Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16] 9

Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20] 12

Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn 14

Bảng 3.1: Chủng vi khuẩn phân lập được 44

Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn 46

Bảng 3.4: Khả năng chịu muối của N14 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của nisin 7

Hình 1.2 : Cấu trúc sakacin P 10

Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin 16

Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I 18

Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II 19

Hình 1.6: Tôm hùm Bông 22

Hình 2.1: Quy trình thực hiện 31

Hình 2.2: Trình tự pha loãng 32

Hình 2.3: Quy trình thử tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với chủng chỉ thị 35 Hình 2.4: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri 36

Hình 2.5 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính bacteriocin 37

Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định đặc điểm vi khuẩn 38

Hình 3.1: Các chủng vi khuẩn ở nồng độ 10-3 44

Hình 3.2: Kết quả của 12 chủng nổi bật đối kháng với chủng Bacillus B1.1 45

Hình 3.3 : Thử nghiệm với enzyme proteinase K và α-chymotripsin 48

Hình 3.4 : Hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn N14 49

Hình 3.5 : Khả năng chịu muối của chủng N14 51

Hình 3.6 : Khả năng sinh catalase của N14 52

Hình 3.7 : Khả năng di động của chủng N14 52

Hình 3.8 : Khả năng sinh hơi của chủng N14 53

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

LỜI MỞ ĐẦU

Vào thời kỳ khai sinh ra vi sinh học hiện đại ngày nay, nhiều nhà khoa học

đã nghiên cứu và phát hiện ra chất kháng sinh Từ thế kỷ 17, một thầy thuốc Hoàng gia Anh đã biết cách chữa bệnh bằng cách dùng rêu áp lên vết thương, hay dùng mẫu bánh mì để chữa trị thương tích Đến những năm của thế kỷ 18, thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ lần đầu tiên được Pasteur và Joubert sử dụng để mô tả hiện tượng kìm

hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh,

và một số nhà khoa học khác đã phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của một vài chủng vi sinh vật Vào năm 1929, khi Alexander Fleming tìm ra thuốc kháng sinh

penicillin từ nấm Penicillium notanum, có khả năng ức chế vi khuẩn sự sinh trưởng

của các loại vi khuẩn, được ứng dụng để chữa trị các bệnh nhiễm trùng trên phạm vi rộng

Việc tìm ra thuốc kháng sinh của Alexander Fleming đã mở ra bước ngoặc mới cho y học loài người Chỉ với một số lượng rất nhỏ nhưng hiệu quả tiêu diệt vi sinh vật của penicillin rất cao Thuốc kháng sinh không chỉ được ứng dụng trong điều trị bệnh cho người, mà còn dùng điều trị bệnh cho vật nuôi, tăng trọng cho vật nuôi và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetracycllin dùng để bảo quản thịt; tetracycline, oromycine… để bảo quản sản phẩm nhằm ngăn chặn quá trình thối rữa của thịt cá, tôm) Tuy nhiên do lạm dụng quá mức kháng sinh đã dẫn đến khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn

Không những thế, trong những năm gần đây, khi người tiêu dùng đã nhận thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và chuộng các loại thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn cho thực phẩm Và từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về an toàn thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn góc tự nhiên

Xuất phát từ những yêu cầu đó, việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn mới trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi, và trong công nghệ thực phẩm Một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi sinh vật và có khả năng kháng khuẩn mà không gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật Ngoài ra, bacteriocin cũng không gây dị ứng cho con người, an toàn với sức khỏe Đó là một sự lựa chọn được xem là có nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài

“ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập đƣợc từ tôm hùm ở Khánh Hòa ”, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập

chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển chọn chủng, và hiểu được đặc tính của các chủng này để tăng khả năng sinh bacteriocin

Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây:

- Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng kháng khuẩn từ tôm hùm

- Sàng lọc các chủng vi sinh vật phân lập từ tôm hùm có khả năng sinh bacteriocin

- Xác định các đặc điểm của vi sinh vật sàng lọc được

- Định danh vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin phân lập được bằng phương pháp sinh học phân tử

Chương I TỔNG QUAN 1.1 Bacteriocin

Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của

Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến

những năm 1950 Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được

nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.;Listeria sp và Staphylococcus sp Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia

tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an

toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm[12],[23]

1.1.1 Khái niệm

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase

1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin

Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm :

- Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

- Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở

vi khuẩn gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo

bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm

Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn

Gram âm, điển hình là E coli sinh tổng hợp colicin Tuy nhiên những nghiên cứu

về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này Ba chủng vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là

Bacillus sp.;Listeria sp và Staphylococcus sp

Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây

hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây

ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền

Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu

cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm

Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I

Streptococcus Salivarius 20P3 Bacillus spp

Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II

L curvatus LTH1174 Carnobacterium pisciocola divergens V41 Enterococcus faecium CTC492/T136 Enterococcus faecium P13

Leuconostoc gelidum UAL187; Leuconostoc carosum Talla

Leuconostoc mesenteroides Y105

1.1.3.1 Lớp I

Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng Một bacteriocin của nhóm này là nisin Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc

Hình 1.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005)

Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic,

được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm Nó có phổ kháng khuẩn Gram

(+) rộng, E coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng

ngoài của chúng bị phá hỏng Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả

đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp và Clostridium spp [24] Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực

phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm

chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium Nisin cũng được

ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra [10]

 Phân lớp Ib

Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan [11], gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm Chúng thường hoạt động trong các phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn Nhóm này bao gồm các chất kháng khuẩn như mersacidine , actagardin, cinnamycin, mutacin A [20]

Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16]

Lactococcus lactis Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis

Lactobacillus sake LTH 674 Lactobacillus acidophilus 11088 Carnobacterium piscicola LV 17 A Carnobacterium piscicola LV 17 B Carnobacterium piscicola LV 17 B Bacillus cereus Bc7

Lactococcus lactis subsp cremoris 9 B4

L lactis subsp cremoris LMG 2130

L lactis subsp lactis bv diacetylactis

WM4

L lactis subsp cremoris 9 B4

L lactis subsp cremoris 9 B4

L lactis subsp lactis LMG 2081

L lactis subsp lactis LMG 2081

1.1.3.2 Lớp II

Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine Các bacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc

 Lớp IIa

Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện

đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1 Các sakacin A, sakacin P cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này Các bacteriocin nhóm này hoạt động bằng cách phá vỡ tính toàn năng của màng tế bào, làm mất cân bằng và thất thoát ion phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt vi khuẩn [20]

Sakacin A là bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB 706, được

cấu tạo bởi 41 acid amin (tiền thân là 90 acid amin) Bacteriocin này là một polypeptide ổn định nhiệt, mang đặc tính di truyền[9]

Sakacin P là một polypeptide nhỏ, ổn định nhiệt, được tổng hợp bởi

ribosome, mang đặc tính di truyền [15], được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB

673

Hình 1.2 : Cấu trúc sakacin P

Các bacteriocin này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng cộng nghiệp nhờ vào hoạt

động kháng Listeria mạnh của chúng Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng

Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin) Sakacin được ứng dụng

trong sản xuất xúc xích, xử lý ở các sản phẩm thịt để giữ được lâu (như sản phẩm jăm bông [18]và thịt đông lạnh [21]), pho mát, các sản phẩm lên men acid lactic khác Ngoài ra, còn được sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn không mong muốn, có thể là nguyên nhân gây nhớt và gây mùi ở các sản phẩm

là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK

Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt động bổ sung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ Lactococcin Gα gồm có 39 acid amin, còn Lactococcin Gβ gồm có 35 acid amin Bactericoin này được sử dụng như một

chất bảo quản thực phẩm, có khả năng kháng tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis

Hoạt động diệt khuẩn chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của cả 2 peptid, mặc dù 2 peptide này có khả năng diệt khuẩn độc lập

Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20]

phân tử(Da)

Amino acid

Gốc cystein

LV17A

Lactococcus lactis LMG2130 Lactococcus cremoris 9B4 Lactococcus lactis WM4 Carnobacterium divergens

III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus [24] Đại diện cho nhóm này là halveticin J [17] được sản xuất bởi vi khuẩn L halveticus

481 và helveticin V, acidifilicin A và lactacin A, lactacin B được sản xuất bởi L acidophilus

1.1.3.4 Lớp IV

Hiện nay, có rất ít tài liệu nghiên cứu về nhóm này Một cách tổng quát các bacteriocin nhóm IV được định nghĩa là bacteriocin phức tạp có chứa lipid hoặc carbohydrate moities Bao gồm các glycoprotein (lactocin 27), hoặc lipoprotein (lacstrepcins) được quy định bởi non-protein [20]

1.1.4 Tính chất của bacteriocin

1.1.4.1 Thành phần hóa học

Bacteriocin có bản chất là protein, nhưng cũng có thể là hỗn hợp của protein với các chất khác Để kiểm tra bản chất protein, người ta sử dụng các enzyme đặc trưng như proteinase Dựa vào bảng phân tích hóa học cho thấy một vài bacteriocin

là protein đơn giản Tuy nhiên, trong khi làm sạch bacteriocin của Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus cho thấy là những phân tử phức tạp với thành phần

lipid, hydratcarbon và cộng thêm với protein Một ví dụ khác về phân tử bacteriocin

có nhiều thành phần, streptocin STH1 là một trong những phân tử phức tạp bao gồm protein, lipid và nhóm gốc phosphate

1.1.4.2 Độ bền

 Độ bền nhiệt

Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng các loại bacteriocin của những loài khác nhau thì khả năng chịu nhiệt cũng khác nhau Mỗi loài có khả năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định nhưng chủ yếu chúng thuộc nhóm I, II Chủng

ST28MS và ST26MS được sản xuất bởi Lactobacillus plantarum không giảm khả

năng hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút tại 1000

C hay 20 phút tại 1210C Hay

đặc điểm tính chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin

 Độ bền pH

Cũng như độ bền nhiệt, một số bacteriocin có thể hoạt động tốt dưới những khoảng pH nhất định Chủng ST28MS và ST26MS ngoài có độ bền nhiệt cao, chúng lại có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2-12 Những đặc tính này đều dựa vào bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó Độ bền nhiệt độ và pH rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm Tùy

vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ sung và sao cho phù hợp với mục đích sản xuất

 Độ bền enzyme

Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các aminoacid khác nhau nên sẽ chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzyme khác nhau, thích hợp với nó Khi bị phân cắt bởi các enzyme này sẽ khiến bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời đây cũng là dấu hiệu giúp ta nhận biết được đó có phải là bacteriocin không

Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi

vi khuẩn Gram dương được trình bày ở bảng sau

Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp

bởi vi khuẩn

Bacteriocin Độ bền nhiệt Độ bền pH Enzyme thủy phân

Megacin A-216 600C, 30 phút 2 – 7 Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin Clostosin A 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Clostosin B 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Clostosin C 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Clostosin D 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Boticin E-S5 1000C, 10 phút 1,1 – 9,5 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pepsin Bioticin P 600C, 30 phút 6,5 – 7,5 Trypsin, Rnase, Alkaline

phosphotase, Phospholipases C, D

1.1.4.3 Tính miễn dịch

Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều bacteriocin có tính kháng nguyên cao Tuy nhiên, hiện nay chỉ có duy nhất một vài bài báo cáo nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh bởi vi khuẩn Gram dương Megacin A-216 là một kháng nguyên và tế bào cũng sinh ra một kháng thể

có khả năng chống lại ảnh hưởng giết chính nó Việc nghiên cứu những kháng thể đến bacteriocin trong huyết thanh của con người có lẽ là một lĩnh vực thú vị cho những nghiên cứu sau này

Một thuộc tính cần thiết để bảo đảm sự sống sót của vi sinh vật sinh bacteriocin là có sự miễn dịch đặc biệt Theo Koponen (2004) tế bào vi khuẩn có một số cơ chế miễn dịch, đây là khả năng của tế bào trong việc bảo vệ chính nó để chống lại bacteriocin sinh ra bởi sự trao đổi của chính mình

Cả cấu tạo thành tế bào và thành phần cấu tạo màng lipid của vi khuẩn cho thấy sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như sự kháng cự bacteriocin

Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những bacteriocin đáng kể Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có thể thay đổi giữa những gen khác nhau, những loài cùng bộ gene và thậm chí đến môi trường nuôi cấy từ những điều kiện ngoại cảnh khác

Có hai kiểu miễn dịch được thấy ở Lantibiotic Một kiểu miễn dịch dựa vào protein miễn dịch đặc trưng, LanI Trong khi kiểu miễn dịch khác dựa vào vật chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (Lan EFG) Bacteriocin sẽ nhận biết được những vi sinh vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ thể đặc biệt

và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi sinh vật đó[14]

1.1.5 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các loài vi khuẩn Gram dương đôi khi nó cũng ức chế một số loài vi khuẩn Gram âm

1.1.5.2 Cơ chế hoạt động

Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng

phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào

Một loại bacteriocin là Lacticin 3147 có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tuong tác đầu tiên với thành tế bào Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K+ và phosphate vô cơ đi ra khỏi tế bào Trong

sự nổ lực để tái tích lũy lại những ion này, các ATP sẽ bị thủy phân Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng trong tế bào, như gradient

pH tại màng tế bào , thì đã không còn nữa, những chức năng sẽ bị phá vỡ và tế bào dần mất năng lượng và chết [13],[1]

Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin(Nguồn Fidel Toldrá, 2009)

1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin

Vì bacteriocin có bản chất là polypeptide nên sinh tổng hợp theo cơ chế của sinh tổng hợp protein nhờ ribosome

Trong tế bào vi khuẩn có mang các gene mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp bacteriocin Qua quá trình phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein đi vào giai đoạn tạo ra bacteriocin hoàn chỉnh, giải phóng nó ra khỏi tế bào vi khuẩn Tuy nhiên vì hoạt tính ức chế/tiêu diệt vi khuẩn của bacteriocin nên

nó cũng có thể tác động ngược trở lại lên vi khuẩn sản xuất ra nó, do đó vi khuẩn sản xuất đòi hỏi phải có protein miễn dịch, giúp nó miễn dịch khỏi tác động của bacteriocin do chính nó tạo ra

Các loại gen khác nhau được quy định cho việc tổng hợp bacteriocin:

- Gene tạo ra chất tiền thân của bacteriocin: pre – bacteriocin

- Gene tạo miễn dịch cho chủng sản xuất (immunity gene)

- Gene mã hóa kênh vận chuyển cho pre – bacteriocin ra khỏi tế bào kích hoạt cơ chế vận chuyển đặc biệt (kênh vận chuyển ABC – ABC transporter)

- Gene kích hoạt cơ chế tạo ra protein tiếp nhận thông tin (accessing protein), giữ vai trò quan trọng vận chuyển và kích hoạt hoạt động kháng khuẩn của bacteriocin khi bacterocin được xuất ra khỏi tế bào (từ pre – bacteriocin thành bacteriocin) Ngoài ra còn có những gene khác trong sinh tổng hợp bacteriocin được tìm thấy ở nhóm II

Khi gặp vi khuẩn đối nghịch, để tổng hợp ra bacteriocin tiêu diệt/ức chế vi khuẩn đối nghịch cần phải có cơ chế điều hòa tổng hợp bacteriocin, đó chính là operon

Gene điều hòa (Promoter) – trình tự nucleotide để 1 gene được phiên mã

Promoter được nhận diện bởi RNA polymerase, bắt đầu quá trình phiên mã mRNA Trong tổng hợp RNA, promoter chỉ thị gene nào cần được sử dụng để tạo mRNA,

do đó kiểm soát tế bào tạo ra protein nào, protein ức chế để gắn vào gene chỉ huy hay protein cần cho tế bào hoạt động

Gene chỉ huy (Operator) – một đoạn DNA để protein kìm hãm gắn vào, do

đó ngăn cản RNA polymerase phiên mã gene

Gene cấu trúc (Structural gene) – các gene được điều hòa tổng hợp bởi

operon Quay trở lại cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin, trên gene cấu trúc có mang

thông tin để phiên mã tạo mRNA chứa thông tin tạo ra pre-bacteriocin (tiền bacteriocin) cũng như các gene khác như gene miễn dịch (giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động tiêu diệt/ức chế của bacteriocin do chính nó tạo ra) mRNA sau đó cùng với ribosome, tRNA đi vào quá trình dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, protein miễn dịch

Sau khi quá trình phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, dưới tác động

của các enzyme trong tế bào chất, pre-bacteriocin khi được giải phóng ra khỏi màng

tế bào được cắt bỏ leader peptide để tạo thành bacteriocin hoàn chỉnh có khả năng kháng khuẩn và được vận chuyển ra khỏi màng thông qua hệ thống vận chuyển ABC Vai trò của leader peptide trong pre-bacteriocin là để bảo vệ vi khuẩn chính

nó khỏi tác động tiêu diệt của bacteriocin trong khi tạo ra nó

Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I (Nguồn P.Michael Davidson, 2005)

Mỗi nhóm bacteriocin sẽ có một cơ chế sinh tổng hợp khác nhau Ở nhóm 1, được tóm tắt như sau (hình 1.4 ):

1 Hình thành tiền bacteriocin

2 Tiền bacteriocin được biến đổi bởi LanB và LanC, được dịch mã thông qua kênh vận chuyển ABC-transporter LanT, và được xử lý bởi LanP, kết quả tạo ra được bacteriocin trưởng thành

3 HPK nhận diện sự hiện diện của bacteriocin và tự động phosphoryl hóa

4 Nhóm phosphoryl được truyền đến nhân tố đáp ứng điều hòa RR

5 RR phiên mã gen điều hòa

6 Sản phẩm chất kháng khuẩn

Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II(Nguồn P.Michael Davidson, 2005)

Khác với nhóm I, ở nhóm II ban đầu sẽ hình thành bacteriocin và IF (một peptide có cấu trúc giống bacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn) do đó HPK phải nhận diện IF để truyền tín hiệu đến RR để kích hoạt tiếp quá trình phiên

mã, tạo được bacteriocin hoàn chỉnh (hình 1.5 )

1.2 Tôm hùm

Tôm hùm là tên gọi chung của nhóm giáp xác mười chân thuộc 4 họ:

Palinuridae, Scyllaridae, Nephropidae và Synaxidae, giữa chúng có những điểm

đặc trưng về tập tính và môi trường sống Với sự phong phú về thành phần giống loài, chúng tạo nên mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn và có vai trò thiết yếu trong hệ sinh thái của biển và đại dương Ở Việt Nam, cho đến nay đã xác định được 9 loài thuộc họ tôm hùm Gai (Palinuridae), 9 loài thuộc họ tôm Mũ Ni (Scyllaridae) và 4 loài thuộc họ Nephropidae Trong đó, một số loài thuộc họ tôm hùm Gai được nuôi phổ biến hiện nay như tôm hùm Bông (tôm hùm Sao, tôm hùm

Hèo), tôm hùm Đá (xanh chân ngắn), tôm hùm Đỏ (hùm lửa), tôm hùm Sỏi (xanh chân dài, hùm ghì), tôm hùm Tre (Tề Thiên)

Hệ thống phân loại tôm hùm

Trên thế giới tôm hùm phân bố chủ yếu ở các vùng biển Nhiệt đới đến Á

nhiệt đới như: Úc, Ðài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-si-a,…

Ở Việt Nam, tôm hùm phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền Trung từ Quảng Bình đến Bình Thuận, đặc biệt phân bố nhiều ở các tỉnh Khánh Hoà, Ninh Thuận và Bình Thuận

Phân bố theo độ sâu: Tùy vào giai đoạn phát triển và tùy vào từng loài mà chúng phân bố theo độ sâu khác nhau Ở giai đoạn trưởng thành tôm hùm bông thường phân bố ở độ sâu từ 20m trở lên, ở giai đoạn ấu trùng và con non chúng thường phân bố ở các bãi rạn, đá san hô ở độ sâu từ 2 - 10m nước

Tôm hùm thường sống ở các bãi rạng đá, rạng san hô nơi có nhiều hang hốc, khe rãnh ven biển Chúng có tập tính sống quần tụ chủ yếu là ở tầng đáy với chất đáy sạch, không bùn Ban ngày trú ẩn trong các hang đá ít hoạt động, ban đêm hoạt động tích cực tìm mồi

Tôm hùm sống thích hợp ở các vùng biển có độ mặn từ 30 -36 ‰, nhiệt độ

các loại thực vật như rong rêu., chúng thường có tập tính bắt mồi tích cực vào ban đêm và tờ mờ sáng Tuỳ vào giai đoạn phát triển mà nhu cầu dinh dưỡng khác nhau, tôm càng nhỏ thì nhu cầu dinh dưỡng càng cao, ở giai đoạn trước lột xác 2-4 ngày tôm ăn rất mạnh, giai đoạn lột xác tôm sẽ ăn chậm lại

Tôm hùm cũng như nhiều giáp xác khác sinh trưởng thông qua quá trình lột xác Ở giai đoạn tôm còn nhỏ chu kỳ lột xác ngắn, tôm càng lớn chu kì lột xác càng dài, sau mỗi lần lột xác thì kích thước và khối lượng của tôm tăng lên rất nhiều Nhìn chung thì tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do vậy tốc độ tăng tưởng của chúng tương đối chậm

Do ảnh hưởng của nhiệt độ nước làm tăng giảm quá trình trao đổi chất trong

cơ thể tôm từ đó hoạt động tích lũy năng lượng cần thiết cho quá trình sinh trưởng của tôm cũng bị thay đổi theo Khi nhiệt độ nước thay đổi đột ngột 3 – 50

C, tôm con

có thể bị chết do không kịp thích nghi Khi nhiệt độ tăng cao và ổn định (29 – 300

C) thời gian lột xác là 4 – 6 ngày; khi nhiệt độ hạ thấp xuống 20 – 240C, thời gian giữa hai lần lột xác kéo dài gấp 1 – 1,2 lần

Tôm có kích cỡ càng nhỏ càng nhạy cảm với ánh sáng Những con nuôi trong điều kiện không có ánh sáng không những bị kéo dài chu kỳ lột xác mà hoạt động bắt mồi cũng bị ảnh hưởng, đặc biệt là mất dần các sắc tố và biến đổi màu tự nhiên của vỏ, làm cho tôm phát triển không bình thường[7]

Nhìn chung, tôm hùm lớn lên nhờ quá trình lột xác Tôm càng nhỏ, quá trình lột xác càng ngắn và tôm lớn càng nhanh Tôm hùm có chu kỳ lột xác dài hơn so với các loài giáp xác khác, do đó, tốc độ tăng trưởng của chúng cũng chậm hơn

Qua mỗi lần lột xác kế tiếp, tỷ lệ phần trăm chiều dài giáp đầu ngực của tôm giảm xuống nhưng độ dài vỏ tôm vẫn tăng nhiều [8]

1.2.4 Đặc điểm sinh sản

Tôm hùm sinh sản rải rác quanh năm nhưng mùa vụ sinh sản của giống Palinurus chủ yếu từ tháng 4-5 và tháng 9 hàng năm Sức sinh sản của tôm hùm tương đối lớn và chúng có thể đẻ nhiều lần trong một năm (thường là 2 lần/năm) Tôm hùm có kích thước vỏ đầu ngực từ 90 – 99 mm đã bắt đầu tham gia sinh sản

Đến mùa sinh sản tôm thành thục kết đàn di cư ra các vùng biển sâu 10-35m

và có độ mặn 30/340

/00 để đẻ Tôm thụ tinh ngoài, con đực gửi khối túi tinh trên mảnh ức của con cái Túi tinh được làm rách nhiều giờ trước khi con cái đẻ để thụ tinh với trứng ở phần bụng và chân bơi Tôm giữ trứng ở các đôi chân bụng cho đến khi trứng nở Ấu trùng Phyllosoma qua 12 lần lột xác và biến thái thành ấu trùng Puerulus Ấu trùng Puerulus qua 4 lần lột xác thành tôm hùm con Từ lúc trứng nở đến giai đoạn ―tôm trắng‖ kéo dài khoảng 10 – 12 tháng

1.2.5 Giá trị của tôm hùm

Tôm hùm được tôn vinh là vua của các loại hải sản giá trị dinh dưỡng cao Thịt tôm hùm chắc, dai, ngọt ăn một lần không thể nào quên Tập trung sự tinh túy nhất ở con tôm hùm là gạch san đúng nơi đầu tôm và chạy thành dải vàng dọc sống lưng

Gạch tôm hùm béo, thơm, nhiều đạm

Hình 1.6: Tôm hùm Bông

Về chất lượng sản phẩm, theo các tài liệu phân tích, phần ăn được của tôm hùm chiếm 20 – 30% thể trọng Trong thịt của tôm Hùm tính theo trọng lượng tươi, hàm lượng protein chiếm 17,62%, lipid chiếm 0,29%, các axit amin chiếm 77,2% protein cơ thể Do thịt thơm ngon giàu chất dinh dưỡng, nên tôm Hùm được coi là món ăn sang trọng quý hiếm và được ưa thích ở nhiều nước 70% còn lại là vỏ, đầu thân được sử dụng để sản xuất chitosan ứng dụng trong lĩnh vực y dược, thực phẩm, bao gói bảo quản thực phẩm và hóa mỹ phẩm phục vụ nhu cầu của nền kinh tế

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của bacteriocin

1.3.1 Ứng dụng

Từ rất lâu các bacteriocin này đã được ứng dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, điển hình là Nisin Năm 1953, thương phẩm Nisaplin xuất hiện trên thị trường như chất bảo quản thực phẩm và đến năm 1969, tổ chức WHO công nhận Nisin là chất bảo quản an toàn có nguồn gốc sinh học Từ đó, các bacteriocin càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, nhất là trong trong bảo quản thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp… để thay thế cho các chất kháng sinh để hạn chế tác dụng phụ của nó, nhờ tính

ưu việt của chúng:

- Bacteriocin có tính an toàn cao trong thực phẩm dành cho người Chúng có ít hạn chế hơn so với những chất bảo quản hóa học vì là các phân tử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men trong thực phẩm lên men truyền thống

- Không gây tác động đến môi trường vì chúng bị thoái biến nhanh chóng

- Các bacteriocin được sử dụng như nguồn thức ăn chủ yếu đối với các tác nhân gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi

- Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm

- Chúng có phổ hoạt động rõ ràng

- Có tác dụng bổ sung cho các tác nhân kháng khuẩn

Không chỉ vậy, bacteriocin còn được ứng dụng trong chăn nuôi làm thuốc tăng trọng Trong y dược, thú y, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm

sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá…

1.3.2 Tình hình nghiên cứu

Bacteriocin mang lại nhiều lợi ích, và ứng dụng trong cuộc sống nhờ các tính chất đặc trưng của chúng Song còn nhiều vấn đề liên quan đến bacteriocin chưa được sáng tỏ Vì vậy, thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu lĩnh vực này Và việc nghiên cứu và phát triển các loài vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin có phổ kháng khuẩn lớn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực là vấn đề mà nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm Có rất nhiều công trình nghiên cứu từ trước đến nay đã góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống nhân loại

Vào tháng 1/1999, Budu-Amoako E cùng cộng sự thuộc trung tâm Công nghệ thực phẩm PEI, Canada đã nghiên cứu được hiệu quả kết hợp của Nisin và nhiệt độ trung bình để tăng khả năng tiêu diệt Listeria monocytogenes trong các thùng chứa bảo quản tôm hùm Theo đó, khi thêm Nisin ở mức 25mg/kg vào thùng chứa tôm hùm có muối bao xung quanh, kết hợp với quá trình xử lý nhiệt 60oC trong 5 phút và 65oC trong 2 phút sẽ giúp giảm đáng kể L.mono

Năm 2002, Soore cùng cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người

Năm 2004, nhóm tác giả Todorov, Van và Dicks thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng

Lactobacillus Plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được phân

lập từ bia barley (kích thước phân tử 10kDa) ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường có

ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường

mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất

Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

Năm 2006, Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết

kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty hoá chất

BASF của Đức phát triển Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về

răng miệng Chủng Lactobacillus mới có tên là L anti-caries có khả năng sinh

bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng

Tháng 3/2007 nhóm tác giả Todorov và Dicks KM thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch- Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của

chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiella pneumoniae và Lactobacillus curvatus Sự phát triển của chủng ST712BZ trên môi trường BHI,

M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất

Các nhà nghiên cứu Csiro để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin Lợi ích chính của việc sử dụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh

Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra một loại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩn tạo ra loại pho mát Thụy Sĩ Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tính chất của pho mát Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thường gặp

Năm 2009, pinto và cộng sự đã nghiên cứu mô tả đặc tính chống vi khuẩn

Listeria của bacteriocin phân lập từ động vật có vỏ, kháng sinh tiềm năng kiểm soát

chất lượng thủy sản không lên men

Tháng 11/2009, Satish Kumar R, Arul V thuộc khoa Công nghệ sinh học trường đại học Pondicherry, Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập bởi tôm thẻ chân trắng Ấn Độ được đặt tên phocaecin PI80 Chất kháng khuẩn này nhạy cảm với các enzyme: trypsin, proteinase, pepsin, chymotrypsin Có hoạt động ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V.fischeri

Tháng 2/2011, Ozdemir cùng cộng sự thuộc khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Adnan Menderes, Thổ Nhĩ Kỳ đã xây dựng một bộ sưu tập gồm 57 chủng Enterococcal phân lập từ các nguồn gốc khác nhau (bao gồm nước sông, xử

lý cây trồng, nước thải, đất, động vật, và các loại rau) được sử dụng để sản xuất

bacteriocins Enterococcin được xác định ở các cấp độ loài như Enterococcus faecium, E hirae, E casseliflavus, E durans, E faecalis, E mundtii và E avium

40 chủng trong 57 chủng phân lập được có khả năng ức chế sự tăng trưởng của ít nhất một loại vi khuẩn chỉ thị

Gần đây vào tháng 6/2012, Samar L cùng cộng sự thuộc phòng thí nghiệm ERT 62, trường đại học Biopharma Ambrilia S.A, Pháp đã tìm ra một loại bacteriocin mới lacticin LC14 sản sinh bởi Lactococcus lactis BMG6.14 phân lập từ môi trường nước thịt kết tủa bởi ammonium sulfate Lacticin LC14 cho thấy hoạt động diệt khuẩn, loại kháng sinh chống lại một số vi khuẩn axit lactic và các chủng gây bệnh bao gồm cả vi khuẩn Listeria monocytogenes Nó bị bất hoạt bởi proteinase K và E pronase, nhưng kháng papain, lysozyme, lipase và catalase

Lacticin LC14 có khả năng chịu nhiệt, ổn định trong một phạm vi rộng của độ pH (2-10) rất có khả năng ứng dụng làm probiotic và điều trị bệnh

Cũng như các nước trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam cũng rất quan tâm đến bacteriocin cũng có nhiều công trình khoa học nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực, được quan tâm nhiều nhất vẫn là ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Song các công trình nghiên cứu này vẫn còn hạn chế về nhiều mặt

Năm 2006, Phạm Thùy Linh nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại Việt Nam Sản phẩm của nghiên cứu này là protein HisentP tái tổ hợp có hoạt tính kháng khuẩn và các đặc tính sinh hóa tương đồng với enterocin P tự nhiên, bước đầu đã có khả năng kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm và có thể tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh học dùng cho bảo quản

Năm 2008, Nguyễn Thúy Hương đã nghiên cứu việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC) để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin Kết quả thu được như sau: Hiệu quả

sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 - 10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng Kết quả thu được cũng góp phần thăm dò 2 ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): sử dụng BC làm chất mangtrong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm màng baothực phẩm

Các nghiên cứu này đóng góp rất lớn trong việc mở rộng lĩnh vực tìm hiểu

về bacteriocin Trong tương lại, sẽ có nhiều công trình nghiên cứu hơn về bacteriocin để vạch ra một hướng đi mới cho chúng

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.2 Mẫu tôm hùm

Mẫu tôm hùm được thu mua ở trại tôm Bình Ba, Khánh Hòa Tôm hùm sử dụng cho thí nghiệm có kích thước khoảng 27cm, nặng 600g Mẫu tôm được bảo quản sống đưa về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập vi sinh vật từ máu, nội tạng, và cơ thịt

2.1.4 Môi trường hóa chất và thuốc thử

2.1.4.1 Môi trường phân lập, nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường TSB (pH 7,3 ± 0,2; 1,5% NaCl)

Hòa tan 30g môi trường TSB tổng hợp, bổ sung thêm 10g NaCl (để đạt nồng

độ cuối là 1,5%) trong 1000ml nước cất, chuẩn pH = 7, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác (ống nghiệm), làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng

1210C trong thời gian 15 phút