Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh khánh hòa

Nhiều phương pháp như lai in situ, kính hiển vi điện tử TEM, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện LSNV trên tôm sú giúp người nuôi phá

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Anh Thư đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Nha Trang, tháng 07 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU 2

1.1.1 Trên thế giới 2

1.1.2 Tại Việt Nam 4

1.2 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV) 9

1.2.1 Hình thái, Cấu trúc 9

1.2.2 Cơ chế xâm nhiễm 11

1.2.3 Cách thức lan truyền 11

1.2.4 Dấu hiệu tôm nhiễm bệnh 11

1.2.5 Sự nhạy cảm của các loài tôm với LSNV 12

1.2.6 Mô mục tiêu 13

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LSNV TRÊN TÔM 13

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học 13

1.3.2 Phương pháp lai tại chỗ 14

1.3.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua 15

1.3.4 Phương pháp PCR 15

1.3.4.1 Chương trình PCR 16

1.3.4.2 Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR 17 1.3.5 Phương pháp RT-PCR 20

1.4 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 21

1.4.1 Tính cấp thiết 21

1.4.2 Mục tiêu của đề tài 21

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU 22

2.1.1 Mẫu thí nghiệm 22

2.1.2 Cặp mồi cho phản ứng PCR 22

2.1.3 Hóa chất 23

2.2.4 Thiết bị chuyên dụng 24

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Thu và chuẩn bị mẫu 25

2.3.2 Tách chiết RNA tổng số 25

2.3.2.1 Nguyên tắc 25

2.3.2.2 Phương pháp tiến hành 25

2.3.3 Nhân gen bằng kỹ thuật RT- PCR 26

2.3.3.1 Thiết lập điều kiện phản ứng 26

2.3.3.2 Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai 28

2.3.3.3 Tính đặc hiệu của phương pháp 28

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp (độ nhạy của quy trình) 29

2.2.4 Điện di trên gel agarose 29

2.2.4.1 Nguyên tắc 29

2.2.4.2 Phương pháp tiến hành 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 31

3.1.1 Các đặc tính của mồi trên lý thuyết 31

3.1.1.1 Các thông số của mồi 31

3.2.1.2 Tính đặc hiệu của mồi 34

3.2.2 Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR 35

3.2.2.1 Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế 35

3.2.2 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 36

3.2.3 Xác định tính đặc hiệu 38

3.2.4 Giới hạn phát hiện của phương pháp 39

3.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰC TỈNH KHÁNH HÒA 42

3.3.1 Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo mùa thu mẫu 44

3.3.2 Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo khu vực thu mẫu 45

3.3.3 Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo loại mẫu 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Ước tính sản lượng tôm nuôi tại châu Á và châu Mỹ latin 3

Bảng 2.1 Các mẫu thu ở các khu vực tỉnh Khánh Hòa 22

Bảng 2.2: Các thông số của cặp mồi LSNV 20AF/20AR 22

Bảng 3.1: Một số đặc tính của cặp mồi LSNV 20AF/20AR 31

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tính theo mùa (mẫu thu từ tháng 11/2011 đến tháng 5/2012) 44

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tính theo khu vực thu mẫu 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001 5

Hình 1.2: Năng suất và sản lượng tôm nuôi Việt Nam từ năm 2001 đến năm 2011. 6

Hình 1.3: Kết quả so sánh trình tự nucleotide một phần gen RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) từ chủng LSNV phân lập ở Sóc Trăng (LSNV-VN) và các chủng ở Thái Lan 8

Hình 1.4: Kết quả phân tích sự tương đồng của chuỗi trình tự acid amin của LSNV và một số virus có RdRp từ họ Luteovirida và từ Nấm 9

Hình 1.5: Cây phân loại chuỗi 13 acid amin virus RNA polymerase phụ thuộc RNA (Clustal W) tần số khởi động 1000 10

Hình 1.6: Hình tôm sú thả nuôi sau 100 ngày có biểu hiện chậm lớn (con có kích thước nhỏ) so với tôm bình thường (con có kích thước bình thường) trong cùng một ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng 12

Hình 1.7: Thể vùi mô tôm bị nhiễm bệnh và mô tôm bình thường nhuộm bằng kỹ thuật nhuộm thường quy (H & E) 14

Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ (insitu) dương tính với mẫu dò 20A của mẫu tôm ở độ phóng đại thấp (a) và ở độ phóng đại cao (b) 14

Hình 1.9: Ảnh chụp hiển vi điện tử mẫu tôm nhiễm bệnh cho thấy các hạt virus 15

Hình 1.10: Chu kì của phản ứng PCR 17

Hình 1.11: Sơ đồ minh họa một quy trình RT- PCR 20

Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 24

Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 20AF và 20AR 32

Hình 3.3: Một số cấu trúc self- dimer của mồi 33

Hình 3.4: Một số cấu trúc hetero- dimer của mồi 20AF/AR 33

Hình 3.5: Kết quả blast trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên Genbank 34

Hình 3.6: Kết quả sắp gióng các mồi với trình tự chuẩn DQ127905.1 35

Hình 3.7: Kết quả áp dụng quy trình RT-PCR trên mẫu dương tính 36

Hình 3.8 : Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tối ưu hóa nhệt độ lai 37

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc

hiệu của quy trình RT-PCR 39

Hình 3.9: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR hai bước 40 Hình 3.10: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR một bước 41

Hình 3.11: Kết quả RT-PCR các mẫu tôm sú dương tính với LSNV thu vào mùa mưa

42

Hình 3.12: Kết quả RT-PCR các mẫu tôm sú dương tính với LSNV thu vào mùa khô.43

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

20AF : Mồi xuôi (forward primer)

20AR : Mồi ngược (reverse primer)

µl : Microlitre

µM : MicroMol

A : Adenosine

BChV : Bệnh khảm lá củ cải đường (Beet cholorosis virus)

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : Base pair

Btv : Bệnh lưỡi xanh (Bluetongue virus)

BYDV : Bệnh vàng lùn lúa mạch (Barlay yellow drawf virus)

C : Cytidine

CABYV : Virus truyền bệnh qua rệp vàng trên cây bí (Cucurbit aphid-borne

yellows luteovirus) cDNA : Complementary DNA

dATP : Deoxyadenosine triphosphate

dUTP : Deoxyuridine Triphosphate

EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

FAO : Food and Agriculture Organization

G : Guanosine

GAV : Virus gây bệnh trên mang (Gill associated virus)

ha : Hecta

HPV : Bệnh gan tụy (Hepatopacreatic parvovirus)

H&E : Kỹ thuật nhuộm thường quy (Hematoxylin and Eosin)

Ibdv : Virus gây bệnh Gumboro ở gà (Infectious bursal disease

virus) IHHNV : Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ

(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus)

ISH : Lai tại chỗ (in situ hybridization)

JEV : Japanese encephalitis virus (Bệnh viêm não Nhật Bản)

kDa : Kilodalton

MBV : Bệnh tôm còi (Monodon baculovirus)

mM : MilliMol

MSGS : Hội chứng chậm lớn (Monodon slow growth syndrome)

mRNA : RNA thông tin (Messenger RNA)

NCBI : National Center for Biotechnology Information

OD : Mật độ quang (Optical Density)

PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction)

PLRV : Bệnh cuốn lá khoai tây (Potato leaf roll virus)

RdRp : RNA polymerase phụ thuộc RNA

(RNA-dependent RNA polymerase)

RNA : Ribonucleic Acid

RT-PCR : Phản ứng khuếch đại gen sử dụng enzyme phiên mã ngược

(Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction) RIA2 : Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2

(Research Institute for Aquaculture No.2) RNAsin : RNase inhibitor

Rrv : Ross river virus

Sfv : Semliki forest virus

TAE : Tris - Acetic acid - EDTA

TE : Tris – EDTA

TEM : Kính hiển vi điện tử truyền qua

(Transmission electron microscopy)

Ta : Nhiệt độ lai (Annealing temperature)

Tm : Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperature) UNG : Uracil-DNA glycosylase

YHV : Bệnh đầu vàng (Yellow Head virus)

WSSV : Bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus) Wnv : West nile virus

LỜI NÓI ĐẦU

Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang

lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới Trong đó tôm sú (P monodon) là

loài quan trọng được nuôi tại Việt Nam từ hơn 30 năm qua Trong nhiều năm loài này được xem là giống chính đưa Việt Nam vào danh sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ, dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Dịch bệnh do virus là một trong những nguyên nhân gây nguy hiểm cho môi trường biển Người ta ước tính rằng khoảng 60% thiệt hại kinh tế ở tôm nuôi trồng thủy sản đã được gây ra bởi các mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn Có nhiều loài virus được tìm

thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên tôm sú (P monodon) như GAV, YHV, MBV,

HPV Laem singh virus (LSNV) là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp Tôm sú nhiễm bệnh này thường không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi

và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi LSNV có mặt ở tất cả các giai đoạn sản xuất từ tôm sú bố mẹ, tôm giống và tôm nuôi thương phẩm với tỷ lệ cao ở Việt Nam Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép

phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Nhiều phương pháp như lai in situ, kính hiển vi điện tử TEM, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục

những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện LSNV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây

ra, nâng cao năng suất

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng quy trình PCR

để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa”

Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây:

- Ứng dụng quy trình PCR chuẩn phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ngờ nhiễm bệnh

- Khảo sát sự hiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú khu vực tỉnh Khánh Hòa

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU

1.1.1 Trên thế giới

Nuôi trồng thủy sản là một trong những lĩnh vực sản xuất có các đóng góp đáng

kể vào nền kinh tế của nhiều quốc gia và cung cấp một lượng lớn nhu cầu thực phẩm thủy sản cho con người, đồng thời đóng góp tích cực vào việc làm giảm lượng carbon trong khí quyển, góp phần làm giảm biến đổi khí hậu Trong các đối tượng thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất Theo công bố của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO – Food and Agriculture Organization), sản lượng tôm nuôi ngày càng tăng, mức tăng bình quân khoảng 10,5% mỗi năm, cụ thể năm 2003 ước đạt 1,35 triệu tấn tăng 11% so với sản lượng ước tính năm 2002 và 15% so với sản lượng thực tế năm 2001 Hơn thế nữa, theo

dự báo của trung tâm thủy sản thế giới, nhu cầu tiêu thụ tôm ngày càng tăng ở cả các nước phát triển và các nước đang phát triển Với hiệu quả kinh tế và xã hội to lớn trên, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút các nhà đầu tư.Theo ước tính sản lượng tôm nuôi thế giới 2007 – 2012 của Liên minh người nuôi trồng thủy sản toàn cầu (Global Aquaculture Alliance) tại Hội thảo 2010 đã công bố thông tin về sản lượng tôm thế giới (Bảng 1.1) Ước tính sản lượng tôm nuôi ngày càng tăng

Bên cạnh những lợi nhuận mang lại thì thiệt hại do nghề nuôi tôm gây ra cũng rất lớn Dịch bệnh liên tiếp xảy ra ở nhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là ở các nước châu Á Trong đó bệnh virus bùng phát gây ảnh hưởng đặc biệt nghiêm trọng đến ngành công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới Ước tính tổng thiệt hại do virus gây

ra là hàng tỷ USD mỗi năm

Năm 2002, nông dân nuôi tôm ở Thái Lan gặp hàng loạt vấn đề với hiện tượng chậm lớn ở tôm sú nuôi MSGS (Monodon slow growth syndrome) (Kanokporn và cộng sự, 2004) Báo cáo sau đó ở hội nghị lần thứ 5 của tổ chức Asia Regional Advisory Group về lĩnh vực sức khỏe vật nuôi thủy sản (2006) cho thấy hội chứng

chậm lớn đặc biệt tác động nghiêm trọng lên các hộ nuôi tôm sú ở Thái, và đã làm thiệt hại lớn về sản lượng (ước lượng khoảng 1,6 tỷ USD) vào năm 2002 Hội chứng chậm lớn trên tôm sú nuôi (Monodon Slow Growth Syndrome, MSGS) xuất hiện và nhanh chóng lan sang các nước trong một khoảng thời gian ngắn, cho thấy

có khả năng nguyên nhân xuất phát từ một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm Một số thông tin cho rằng hiện tượng tôm sú chậm lớn cũng đang xảy ra ở Ấn Độ, Indonesia, Malaysia và Việt Nam (Flegel và cộng sự, 2006)

Bảng 1.1: Ước tính sản lượng tôm nuôi tại châu Á và châu Mỹ latin

(Nguồn:http://agro.gov.vn/news/tID18617_Uoc-tinh-san-luong-tom-nuoi-the-gioi-2007 2012.htm) Một điều tra liên quan đến sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh ở ao có MSGS lẫn ao bình thường Theo đó các mẫu tôm có biểu hiện chậm lớn được kiểm tra sự hiện diện của một số tác nhân virus gây bệnh: tôm còi (Monodon baculovirus

- MBV), bệnh gan tụy (Hepatopacreatic parvovirus - HPV) và bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus - IHHNV) bằng phương pháp PCR Kết quả cho thấy trong nhiều trường hợp, các ao

bị nhiễm hai hoặc nhiều hơn một virus cùng lúc Tuy nhiên, không có mối tương quan giữa các tác nhân gây bệnh này với sự hiện diện MSGS Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng có thể có một tác nhân gây bệnh mới gây ra hiện tượng MSGS

Trong quá trình điều tra tác nhân gây bệnh MSGS tác giả Sritunyalucksana và cộng sự đã phát hiện ra sự hiện diện của một virus mới từ mẫu bệnh phẩm có đặc điểm của bệnh MSGS và đặt tên Laem singh virus (LSNV) (Sritunyalucksana và cộng sự, 2006)

Bệnh tôm chậm lớn do Laem Singh Virus là một trong những virus mới được phát hiện gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm Theo nghiên cứu của Pratoomthai và cộng sự (2007) các cá thể tôm có kích thước nhỏ hay bình thường ở ao bị nhiễm MSGS đều có sự hiện diện của thể virus hình lập phương LSNV Bằng các phương pháp khác nhau Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction (RT-PCR), kính hiển vi điện tử (TEM), lai tại chỗ với mẫu dò đặc hiệu (ISH) và phương pháp mô học các tác giả đã xác định LSNV có mặt ở cơ quan tạo máu lymphoid, mang, mô thần kinh, ngoài ra các tác giả còn phát hiện LSNV hiện diện trong mắt tôm

Nhóm nghiên cứu của tác giả Prakasha đã tiến hành thu ngẫu nhiên 56 mẫu tôm bệnh ở khu vực ven bờ Tây Nam và Đông Nam Ấn Độ để xác định một số tác nhân gây bệnh WSSV, MBV, HPV bằng phương pháp PCR và LSNV bằng phương pháp RT-PCR Kết quả cho thấy 3 trong số 56 mẫu dương tính với virus LSNV và đồng thời cũng bị nhiễm WSSV, MBV hoặc HPV (Prakasha và cộng sự, 2007) Một nghiên cứu vừa được công bố gần đây của tác giả Sittidilokratna đã ghi nhận một số mẫu tôm sú phát triển bình thường cũng nhiễm LSNV, cụ thể là Việt Nam có 2 trong số 6 mẫu tôm sú bình thường được xác định bị nhiễm LSNV, Malaysia có 6/6 mẫu tôm sú bình thường nhiễm LSNV và 39 trong số 40 mẫu tôm sú có nguồn gốc

từ Thái Lan có biểu hiện chậm lớn được xác định nhiễm LSNV Cũng trong nghiên cứu này các tác giả đã điều tra 81 mẫu tôm sú thu năm 2007 ở Andhra Prades Ấn

Độ, kết quả cho thấy có đến 58,1% số mẫu bị nhiễm LSNV (Sittidilokratna và cộng

sự, 2009)

1.1.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm cũng đã phát triển khá lâu nhưng thực sự phát triển mạnh trong những năm gần đây Diện tích ao tôm ngày càng được mở rộng, đồng thời sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh, đặc biệt từ sau năm 2000 Việt Nam

trở thành một trong những nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới

Hình 1.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001 (Nguồn: Globefish)

Năm 2011, diện tích nuôi tôm cả nước đạt 656.425 ha tôm, sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng 2,71% về diện tích và 5,48% về sản lượng so với năm 2010 (hình 1.2).Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, bằng 95,81% năm 2010 Phần lớn tôm nuôi ở Việt Nam tập trung ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), nơi đây là vùng nuôi tôm trọng điểm của cả nước với diện tích 602.416 ha (bằng 91,8% diện tích cả nước), trong đó diện tích tôm sú là 588.419 ha Sản lượng thu hoạch đạt 368.983 tấn, bằng 74,4% sản lượng của cả nước, trong đó, tôm sú là 296.958 tấn

(http://thuysanvietnam.com.vn/index.php/news/details/index/1939.let)

Do những lợi nhuận mang lại từ con tôm sú (P monodon) và do ưu đãi của

thiên nhiên nên nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ trong cả nước Đặc biệt, nhằm đẩy mạnh xuất khẩu, ngành thủy sản Việt Nam đã tiến hành xây dựng tôm sú là một trong ba mặt hàng tiêu biểu cho thủy sản Việt Nam (tôm sú, cá tra, ba sa và cá ngừ)

Hình 1.2: Năng suất và sản lượng tôm nuôi Việt Nam từ năm 2001 đến năm 2011

(Nguồn: Globefish)

Theo báo cáo của bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, sản lượng nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng và đạt con số kỉ lục là 3 triệu tấn vào năm 2011 vừa qua (http://bannhanong.vn/danhmuc/Nw==/baiviet/10-Su-kien-tieu-bieu-nganh-thuy-san-2011/MTY2Mg==/index.bnn) Bộ cũng cho biết xuất khẩu thủy sản Việt Nam năm 2011 đạt 6,1 tỷ USD, tăng 21% so với 5.016 tỷ USD năm 2010 và tăng hơn gấp 3 lần so với mức 2 tỷ năm 2002 Trong đó tổng giá trị xuất khẩu tôm khoảng 2,39 tỷ USD, riêng xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ USD Sau lần đầu tiên vượt qua mốc 2 tỷ USD năm 2010, tôm đã trở thành mặt hàng đơn lẻ thứ 4 của Việt Nam đạt và vượt giá trị xuất khẩu 2 tỷ USD/năm (sau dầu thô, gạo và cao su), tốc

độ xuất khẩu tôm Việt Nam ngày càng tăng mạnh về giá trị đáng kể so với tốc độ tăng khối lượng Xuất khẩu tôm chiếm 18% về khối lượng và 38% về giá trị xuất khẩu của thủy sản Việt Nam (http://www.fistenet.gov.vn/f-thuong-mai-thuy-san/a-xuat-nhap-khau/toan-canh-xuat-khau-tom-nam-2011/)

Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long là khu vực nuôi tôm có kim ngạch xuất khẩu thủy sản chủ yếu của nước ta Năm 2011 xuất khẩu thủy sản của vùng này ước đạt 4 tỷ USD, tăng 27% so với năm 2010

Các tỉnh ven biển Miền Trung điển hình như tỉnh Khánh Hòa cũng là khu vực

có sản lượng tôm thương phẩm lớn Năm 2011, tổng diện tích nuôi tôm thương

phẩm toàn tỉnh Khánh Hòa đạt khoảng 6.484 ha Trong đó, diện tích nuôi tôm tôm

sú là 532 ha Tổng sản lượng tôm thương phẩm đạt 13.993 tấn, riêng tôm sú 1.909 tấn Hàng năm, kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng thủy hải sản của Khánh Hòa chiếm khoảng 300 triệu USD, góp phần đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (http://www.vasep.com.vn/Tin-Tuc/51_1785/Khanh-Hoa-Nam-2011-san-luong-tom-thuong-pham-dat-gan-14000-tan.htm)

Mặc dù vậy nghề nuôi tôm vẫn còn nhiều khó khăn do kỹ thuật nuôi của người dân chưa cao, hằng năm vẫn bị thiệt hại khá lớn bởi dịch bệnh mà chủ yếu là dịch bệnh do virus gây ra Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh lây lan trên diện rộng đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi tôm Năm 2011, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 97.691 ha, trong đó trong đó trên 82.000 ha nuôi tôm sú bị thiệt hại (http://www.camautravel.vn/vn/newsdetail/3280/xuat-khau-tom-su-se-tiep-tuc-giam.html) Mặc dù tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam, tuy nhiên tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần gây nhiều thiệt hại cho người nuôi tôm

Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, giai đoạn 1995-

2003 phong trào nuôi tôm sú ở Khánh Hòa phát triển khá rầm rộ Một thời gian dài, Khánh Hòa là địa phương đứng đầu cả nước về sản xuất tôm giống Sản lượng xuất ra thị trường ngoại tỉnh đạt từ 3,5 - 4 tỷ con giống mỗi năm Trên địa bàn tỉnh hiện có

226 trại sản xuất giống tôm sú, năng lực sản xuất đạt 1,5 tỷ con tôm giống/năm; 11 cơ

sở được phép sản xuất giống tôm thẻ chân trắng, năng lực sản xuất 2,5 tỷ con tôm giống/năm, phục vụ nhu cầu sản xuất tôm sú, tôm thẻ thương phẩm trên quy mô toàn quốc Tuy nhiên, trong năm 2011, toàn tỉnh chỉ sản xuất được trên 1,2 tỷ con tôm giống, bằng 1/3 năng lực sản xuất của các trại Hiện có hơn 50% số trại tôm sú đã tạm ngừng sản xuất

(http://www.vietlinh.vn/lobby/aquaculture_news_show.asp?ID=14557) Hiện tượng tôm sú nuôi chậm lớn gần đây là một hiện tượng phổ biến có mặt tại các vùng nuôi trọng điểm trong toàn quốc tiêu biểu là các vùng nuôi tôm

sú ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Các ao tôm mắc phải hiện tượng này thường phải kéo dài thời gian vụ nuôi nuôi thành 5 đến 6 tháng, thay vì hoàn tất vụ nuôi

từ 3,5 đến 4 tháng như trước đây Hiện tượng tôm chậm lớn làm cho kích thước

tôm thu hoạch cũng bị nhỏ đi chỉ còn khoảng 40-50 con/kg, thông thường trước

đó là 30-35 con/kg Một nghiên cứu của tác giả Sittilokratna năm 2009 cho rằng 2/6 mẫu tôm sú nuôi ở Việt Nam có nhiễm LSNV

Điều tra của nhóm nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 về

sự hiện diện của LSNV từ một số mẫu tôm sú có biểu hiện chậm lớn thu tại Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết quả kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR trên một số mẫu tại tỉnh Sóc Trăng (thu mẫu vào 7/2008) và mẫu tại Kiên Giang (thu mẫu vào 3/2008) cho thấy các mẫu này dương tính với virus LSNV, tần xuất bắt gặp sự hiện diện của LSNV trên các mẫu tôm có biểu hiện chậm lớn ở các mẫu nghiên cứu là rất cao chiếm 63% mẫu phân tích Kết quả giải trình tự nucleotide sản phẩm khuếch đại từ các mẫu dương tính này đã khẳng định sự tương đồng cao về trình tự nucleotide được phân tích với các chủng LSNV đã được công bố trước đó (tương đồng 97% với chủng LSNV phân lập ở Ấn Độ và tương đồng 98% với chủng LSNV phân lập tại Thái Lan Kết quả này đã khẳng định có sự hiện diện virus LSNV trên tôm sú nuôi tại Việt Nam (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011)

Hình 1.3: Kết quả so sánh trình tự nucleotide một phần gen RNA polymerase phụ

thuộc RNA (RdRp) từ chủng LSNV phân lập ở Sóc Trăng (LSNV-VN) và các chủng

ở Thái Lan (FJ356709, FJ356710, DQ127905, EF593037) (Nguyễn Viết Dũng và

cộng sự, 2011)

1.2 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV)

1.2.1 Hình thái, Cấu trúc

LSNV là một loại virus gây bệnh trên tôm sú Virus này có hình lập phương, đường kính 15-25nm, không có màng bao icosahedron, mật độ trong CsCl là 1,1843g/ml (Panphut và cộng sự, 2011), vật liệu di truyền là RNA chuỗi đơn dương (Sittidilokratna và cộng sự, 2009)

- Tên khoa học : Laem Singh Virus

- Tên thông thường : LSNV

- Cấp độ : Loài

- Nòi : Viruses

- Nhóm : + ssRNA ( RNA chuỗi đơn, dương )

- Vật chủ: tôm sú (Penaeus monodon)

Sự hiện diện của LSNV được xác định bằng kỹ thuật tạo dòng ‘shot-gun’ Kết quả tạo ra 22 dòng cDNA không xác định, một dòng trong số đó được gọi là 20A ( Mã truy cập trên ngân hàng GenBank DQ127905) Kết quả phân tích dòng 20A cho thấy nó tương đồng với trình tự acid amin bảo tồn của RNA polymerase

phụ thuộc RNA (RdRp) họ virus Luteovirida (Hình 1.4) và còn tương đồng với

virus hình que kí sinh ở nấm (Sritunyalucksana và cộng sự, 2006)

Hình 1.4: Kết quả phân tích sự tương đồng của chuỗi trình tự acid amin của LSNV

và một số virus có RdRp từ họ Luteovirida và từ Nấm (theo dữ liệu từ ngân hàng

GenBank)

Bao gồm các virus : PLRV - virus gây cuốn lá khoai tây (AAF31445); BYDV - virus vàng lùn lúa mạch (BAA01054); SCYLV - virus vàng gân lá mía (AAK66856); CABYV - virus truyền bệnh qua rệp vàng (CAA54251); BChV - virus khảm lá củ cải đường (AAK49964); Mushroom - virus nấm bacilliform (AA53090); LSNV – Laem Singh Virus (DQ127905) (Sritunyalucksana và cộng sự, 2006)

Hình 1.5: Cây phân loại chuỗi 13 acid amin virus RNA polymerase phụ thuộc RNA

(Clustal W) tần số khởi động 1000

Bao gồm các virus giống hình trên và các virus Sfv – Semliki forest virus, số đệ trình trên GenBank CAA75053; Rrv - Ross river virus, NP740681; JEV – virus viêm não Nhật Bản, NP059434; Wnv – West nile virus, NP776022; Ibdv – virus gây bệnh Gumboro ở gà, NP690839; Btv – virus lưỡi xanh, P13840 (Sritunyalucksana và cộng sự, 2006)

Tuy nhiên, phân tích phát sinh loài (Hình 1.5), cho thấy virus trong họ

Luteoviridae hình thành một nhánh riêng biệt, trong khi virus nấm bacilliform và LSNV giảm giữa nhánh và phân nhánh của đại diện từ các họ Togaviridae, họ Flaviviridae và nhóm virus dsRNA gồm virus gây bệnh Gumboro ở gà (Ibdv) và

virus lưỡi xanh (Btv) với các giá trị khởi động thấp Vì vậy cần thêm thông tin bộ gen cần thiết để phân loại thích hợp loại virus này

1.2.2 Cơ chế xâm nhiễm

Khi xâm nhập vào tôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận như nội bì, mô, mang, mắt, chân bơi và các bộ phận khác

Sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus cởi áo trong không bào của tế bào chất, RNA được dùng trực tiếp làm mRNA để tổng hợp protein không cấu trúc, trong đó enzyme RNA polymerse phụ thuộc RNA (RdRp) RdRp xúc tác để sao chép RNA, tổng hợp nên RNA sợi âm (đối gen) có kích thước đủ RNA bộ gen Sau

đó từ chuỗi sợi âm làm khuôn tiến hành sao chép để tạo ra nhiều chuỗi RNA bộ gen mới Các mRNA dưới bộ gen (có kích thước nhỏ hơn bộ gen) tiến hành dịch mã để tạo ra protein cấu trúc Còn bộ gen mới tạo thành tiến hành dịch mã để tạo nhiều protein không cấu trúc và sau đó lắp ráp với protein cấu trúc để tạo virus mới

Quá trình tự nhân bản của virus trong vật chủ dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào chủ Quá trình này làm số lượng virus tăng lên nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào Virus tiếp tục phát triển, cuối cùng làm tan tế bào vật chủ, phóng thích ra môi trường và tiếp tục xâm nhiễm vào các đối tượng khác Nếu như virus không tìm được kí chủ mới thì nó có thể sống tự do trong nước khoảng 24 giờ (Phạm Văn Ty)

1.2.3 Cách thức lan truyền

LSNV lan truyền theo chiều ngang hay chiều dọc Sự lan truyền theo chiều ngang là

do tập tính ăn thịt lẫn nhau hoặc do môi trường, nguồn nước bị nhiễm LSNV cũng có thể lan truyền qua trục dọc từ tôm bố mẹ Sự lan truyền có thể từ bố hoặc từ mẹ hoặc cả hai Nhưng không rõ sự lan truyền có trong trứng hay không (Prakasha và cộng sự, 2007)

1.2.4 Dấu hiệu tôm nhiễm bệnh

Khi tôm mới nhiễm virus LSNV dấu hiệu bệnh không rõ ràng Ao tôm nhiễm bệnh khi thể hiện tương quan khác biệt kích thước ≥ 35% so với trường hợp không nhiễm bệnh còi MBV (Monodon Baculovirus), bệnh gan tụy (Hepatorancreatic

Parvovirus - HPV) hoặc bất kì tác nhân gây bệnh nào gây nhiễm lên mô gan tụy, thêm vào đó là ba trong số năm đặc điểm sau:

- Tôm tối sậm màu bất thường, kém ăn, hoạt động yếu

- Có đốm vàng sáng bất thường trên thân tôm, đốt bụng tôm có dạng thân đốt tre

- Râu tôm dễ bị đứt gãy

- Tốc độ tăng trưởng trung bình < 0,1g/ngày trong 4 tháng làm kéo dài vụ thu hoạch ao tôm nuôi

Các đặc trưng này phân biệt hôi chứng chậm lớn khác với chậm lớn do MBV và HPV gây nên (Sritunyalucksana và cộng sự, 2006)

Hình 1.6: Hình tôm sú thả nuôi sau 100 ngày có biểu hiện chậm lớn (con có kích

thước nhỏ) so với tôm bình thường (con có kích thước bình thường) trong cùng một

ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011)

1.2.5 Sự nhạy cảm của các loài tôm với LSNV

Bệnh LSNV có khả năng lây lan nhanh, rộng và gây hiện tượng chậm lớn trong suốt quá trình nuôi Để kiểm tra khả năng lây nhiễm của virus LSNV, tác giả

Sathish Kumar đã phân tích 6 loài tôm (gồm P.monodon, Fenneropenaeus merguiensis, Metapenaeus dobsoni, Litopenaeus vannamei, F indicus, Marsupenaeus japonicus) ở nhiều giai đoạn sống, có nguồn gốc từ tự nhiên và từ các trang trại, cũng như ấu trùng của Cua Scylla serrata (Sathish Kumar và cộng sự, 2011) Kết quả kiểm tra bằng RT-PCR cho thấy ngoài sự lây lan giữa tôm sú (P

monodon) với nhau thì một số loài giáp xác quanh khu vực ao nuôi tôm sú cũng đã

được xác định là bị lây nhiễm với virus LSNV trong thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo

trên gồm Fenneropenaeus merguiensis, Metapenaeus dobsoni và cả tôm thẻ Litopenaeeus vannamei Do virus LSNV có khả năng lây nhiễm ở các loài giáp xác

quanh khu vực nuôi nên có thể rất ảnh hưởng đến sự lan truyền của virus LSNV trong hệ thống canh tác

LSNV cũng được phát hiện trong cả tôm sú có kích thước nhỏ và bình thường được thu thập từ cùng một ao Tỷ lệ bị nhiễm LSNV tăng dần ở các tháng nuôi sau

so với tôm sú giống, tôm càng lớn thì tỉ lệ nhiễm virus LSNV càng cao

1.2.6 Mô mục tiêu

LSNV xâm nhiễm và sao chép trong các mô có nguồn gốc ngoại bì và trung phôi bì Tuy nhiên, mô mục tiêu chủ yếu bao gồm: mang, chân bơi, cơ quan tạo máu Lymphoid, mô thần kinh và các mô khác Ngoài ra LSNV còn được tìm thấy ở

cơ quan Bellonci trong mắt tôm (Pratoomthai và cộng sự, 2007)

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LSNV TRÊN TÔM

Có nhiều phương pháp cho phép phát hiện sự có mặt của LSNV trên tôm hiện nay như dựa vào dấu hiệu bệnh lý, phương pháp mô học truyền thống, kính hiển vi

điện tử (TEM), lai tại chỗ insitu (ISH), lai dot blot, các kỹ thuật sinh học phân tử

dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) như nested PCR, RT-PCR

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học

Phương pháp mô học giúp chuẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bất thường của cấu trúc tế bào, mô cơ quan Phương pháp mô học được tăng cường độ nhạy phát hiện bằng cách cố định mẫu, làm tiêu bản mô học, nhuộm với Hematoxylin và Eosin, sau đó quan sát thể vùi (inclusion body) bên trong nhân tế bào (Pratoomthai và cộng

sự, 2008) Ngoài ra, phương pháp mô học còn được thực hiện bằng cách tạo mẫu ép mỏng, cố định trong methanol, nhuộm với Giemsa và tìm sự xuất hiện của thể vùi trong nhân Hiện tượng nhân phồng to là một chỉ thị của sự nhân bản và tích lũy virion bên trong nhân và là dấu hiệu đặc trưng của bệnh (hình 1.7)

Tuy nhiên, nghiên cứu mô học chỉ áp dụng được cho trường hợp đã phát bệnh, không áp dụng được khi virus còn ở dạng tiềm ẩn trong bộ gen của tế bào chủ Phương pháp này còn nhiều trở ngại là thao tác tương đối chậm, tốn thời gian, công sức và có độ nhạy thấp nên ít được sử dụng để chẩn đoán bệnh LSNV

Hình 1.7: Thể vùi mô tôm bị nhiễm bệnh và mô tôm bình thường nhuộm bằng kỹ

thuật nhuộm thường quy (H & E) (Pratoomthai và cộng sự, 2008)

1.3.2 Phương pháp lai tại chỗ

Lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH) là một kiểu lai phân tử trong đó trình

tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết

Phương pháp lai tại chỗ được phát triển để chẩn đoán bệnh LSNV [3, 11] bằng cách sử dụng mẫu dò 20A đánh dấu digoxigenin (DIG) chuyên biệt cho LSNV để dò tìm sự hiện diện của virus trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh Sự bắt cặp của mẫu dò với RNA virus trên mẫu tôm cho phép kết luận mẫu tôm bị nhiễm bệnh (hình 1.8)

Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ (insitu) dương tính với mẫu

dò 20A của mẫu tôm ở độ phóng đại thấp và ở độ phóng đại cao(Sritunyalucksana

và cộng sự)

1.3.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua

Kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy, TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số

TEM được sử dụng để chẩn đoán sự có mặt của LSNV (Anantasomboon và cộng sự, 2006; Sritunyalucksana và cộng sự, 2006; Panphut và cộng sự, 2011)

Hình 1.9: Ảnh chụp hiển vi điện tử mẫu tôm nhiễm bệnh cho thấy các hạt virus có

kích thước đường kính khoảng 25nm (mũi tên 1) và 15nm (mũi tên 2) (Panphut và

cộng sự, 2011)

1.3.4 Phương pháp PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử

PCR được Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, đây là một phát minh đóng vai trò quan trọng nhất trong sinh học phân tử bởi PCR đã nhanh chóng trở

thành một phương pháp phổ biến ở mọi phòng thí nghiệm sinh học phân tử để chẩn đoán và phân tích di truyền

 Nguyên lý

PCR là sự khuếch đại các dòng đặc trưng hoặc các trình tự DNA bộ gen nhờ enzyme và sử dụng cặp mồi DNA khuôn có chứa trình tự đích, mà còn có thể dài hàng chục hoặc hàng chục ngàn nucleotide Mặc dù, mục đích của phương pháp PCR để khuếch đại DNA khuôn, nhưng một bước phiên mã ngược sẽ cho phép khởi đầu với vật liệu RNA

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động PCR là một quy trình dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu Mồi là những đoạn DNA ngắn (oligonucleotide) có trình tự biết trước được gọi là mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài nhờ hoạt động của Taq polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh Số lượng DNA đích sẽ tăng theo mỗi chu kì của phản ứng

1.3.4.1 Chương trình PCR

Chương trình PCR đòi hỏi một chuỗi lặp lại các chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước

cơ bản: biến tính DNA khuôn mạch kép, bắt cặp của 2 mồi với mạch khuôn đơn và

sự kéo dài mồi nhờ enzyme để tạo ra các bản sao mà đóng vai trò làm khuôn trong các chu kỳ sau đó

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính (hình 1.10):

- Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94 – 95oC trong vòng 30 giây -

1 phút, làm phá vỡ các liên kết hydro giúp phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới

- Giai đoạn bắt cặp (annealing): Trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn

nhiệt độ nóng chảy của các mồi), cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng, dao động từ 40 –

70oC, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

- Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của Taq polymerase, nhiệt độ được tăng lên đến 72oC, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA polymerase hoạt động Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Chu kỳ ba giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân và theo tính toán, sau n (25≤

n ≤ 40) chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 2n so với số lượng bản mẫu ban đầu

Chọn mồi cần tính toán để bảo đảm Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5oC và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72oC Độ dài mồi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 Các mồi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp ở giữa khuôn PCR không thành công Tỉ lệ G-C giữa các mồi thường chiếm khoảng 40-75% để đảm bảo liên kết gắn mồi với khuôn bền vững Tuy nhiên trình tự GC không lặp lại quá nhiều lần trong một mồi Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại.Trình tự DNA cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai mồi không quá lớn 1kb Sợi ADN được tổng hợp khi đầu 3’ của mồi đã liên kết với khuôn mặc dầu đầu 5’ có thể tự do Do đó đầu 5’ của mồi có thể được gắn thêm đoạn nucleotide điều khiển (promoter) Thể tích mồi khoảng 0,1mM đến 0,5mM Thể tích mồi thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260nm (Võ Thị Thương Lan, 2006)

c Enzyme

DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để Tùy các đặc tính của DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau

Nồng độ Taq polymerase thích hợp cho phản ứng là từ 1-2,5 đơn vị (u) cho

100 µl dung dịch phản ứng Thông thường có thể sử dụng 0,5 u/25µl Nếu nồng độ Taq polymerase quá cao, có thể dẫn tới các sản phẩm PCR không đặc hiệu và làm sai lệch kết quả Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp, sẽ không đủ lượng enzyme

để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR mong muốn

Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Tth polymerase, một enzyme tách chiết

từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược

khi có mặt RNA khuôn và ion Mn2+ ; nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg2+, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

d Nồng độ các dNTP (deoxynucleotide triphostphate)

Nồng độ các dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) thường được sử dụng là

20-200 µM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh’’ Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Mất cân bằng trong thành phần các dNTP làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Khuất Hữu Thanh, 2003)

e Nồng độ MgCl 2

Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, là cofactor cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ hoạt động kém và hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg2+cao làm tăng hiện tượng bắt cặp giả và cho ra những sản phẩm không đặc hiệu Chính vì vậy phải có nồng độ tối ưu cho từng phản ứng Thông thường, Mg2+ được

sử dụng ở nồng độ từ 1,5 – 4 mM (Nguyễn Thị Xô và Nguyễn Thị Loan, 2005)

xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng và do các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau

1.3.5 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase linked to Polymerase Chain Reaction)

Cùng với kĩ thuật PCR, RT- PCR cũng đã trở thành một kỹ thuật được áp dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh y, RT-PCR đã tạo ra nhiều cơ hội trong chẩn đoán, cho phép phát hiện các virus RNA

 Nguyên tắc của phương pháp:

Phương pháp này cơ bản dựa vào phản ứng khuếch đại phân tử (PCR) nhưng có

sử dụng enzyme phiên mã ngược, với nguyên liệu ban đầu là phân tử mRNA Phương pháp được minh họa qua hình 1.11 Do Taq polymerase không hoạt động trên mRNA nên người ta dùng phối hợp enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) với taq polymerase gọi là RT-PCR Trước hết RNA được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi sử dụng cho giai đoạn này có thể là mồi ngược của PCR giai đoạn sau, có thể là đoạn nucleotide oligo T (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), mà cũng có thể là các hexannucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên mRNA Ngoài ra còn có RNAse H để cắt bỏ RNA bị bắt cặp vào cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ Taq Polymerase Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng thấp (Hồ Huỳnh Thùy Dương , 2003)

Hình 1.11: Sơ đồ minh họa một quy trình RT- PCR.(Nguồn:

http://www.gene-quantification.de/poster-main.html)

1.4 TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1 Tính cấp thiết

Dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Dịch bệnh trên tôm nuôi, đặc biệt là dịch bệnh do virus gây ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế quốc gia Hiện nay các loại giáp xác biển được biết rằng có thể đồng thời bị nhiễm nhiều hơn một loại virus (Flegel và cộng sự, 2004) Có khoảng 20 loại virus được tìm thấy ở tôm sú (Lightner và cộng sự, 1996) và thường bệnh do virus gây ra không có dấu hiệu đặc trưng của bệnh, đặc biệt bệnh xảy ra trong môi trường tự nhiên

Tôm sú nhiễm bệnh Laem singh virus nhưng thường không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi Đây là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp (Kanokporn và cộng sự, 2004; Anantasomboon, 2006)

LSNV có mặt ở tất cả các giai đoạn sản xuất từ tôm sú bố mẹ, tôm giống và tôm nuôi thương phẩm Tỷ lệ nhiễm virus LSNV trên các mẫu tôm sú có biểu hiện chậm lớn (63%), mẫu tôm thu ngẫu nhiên (10,6%) và tôm sú giống (1%) (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011) Tỷ lệ trên cho thấy tình hình nhiễm virus LSNV ở Việt Nam là vấn đề rất cần được quan tâm Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Vì vậy, phương pháp PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử giúp người nuôi phát hiện b ệ n h kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất tôm nuôi

1.4.2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài được tiến hành với các mục tiêu sau:

- Chuẩn hóa quy trình PCR để phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ngờ nhiễm bệnh

- Khảo sát sự hiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú tỉnh Khánh Hòa

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Mẫu thí nghiệm

Mẫu chứng dương LSNV được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 (Research Institute for Aquaculture No.2 - RIA2)

Mẫu tôm sú (P monodon) được thu mua tại các chợ thành phố Nha Trang, các

trại nuôi ở khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa và Cam Ranh – tỉnh Khánh Hòa, thu từ tháng 11 năm 2011 tới tháng 5 năm 2012

Thu 80 mẫu tôm sú gồm: 25 mẫu tôm giống, 30 mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn (MSGS) và 25 mẫu tôm sú bình thường

Bảng 2.1 Các mẫu thu ở các khu vực tỉnh Khánh Hòa Loại mẫu

Địa điểm

Tôm giống (con)

Tôm MSGS (con)

Tôm bình thường (con)

Độ dài sản phẩm khuếch đại (bp)

Nhiệt độ biến tính (Tm, oC)

20AF 5’- TTGCCTTCTCCCGAGTGGTC -3’ 20 197 65.7

20AR 5’- CCGGCTGAGGTAGCTGCTTG -3’ 20 66.6

2.1.3 Hóa chất

a Hóa chất tách chiết RNA

 Bộ kit tách chiết RNA tổng số (Invitrogen)

- Dung dịch RNAzol (phenol, guanidine thiocyanate)

 Hỗn hợp phản ứng tổng hợp PCR hai bước bao gồm:

 Tổng hợp cDNA (NKRT mix, Nam Khoa - Việt Nam):

- Reverse transcriptase 1X

- RNAsin (RNase inhibitor) 1u/µl

- Các dNTP 0,2 mM

- Oligo dT

- Mồi ngẫu nhiên (random hexamer)

 Khuếch đại DNA trong phản ứng PCR (NKRT mix, Nam Khoa - Việt

- Gotaq® Hotstart Polymerase 5 u/µl (Promega)

- AMV Reverse trancriptase 5U (Promega)

- Cặp mồi LSNV 20AF/AR (Integrated DNA Technologies - IDT, Mỹ)