KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NHANH TRONG KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM doc

TEST NHANHGIỚI THIỆU CHUNG Test nhanh – Ý nghĩa  Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh  Phát hiện vi khuẩn gây bệnh có số lượng thấp trong quần thể các vi sinh vật không gây bệnh khác

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG

TEST NHANH

GIỚI THIỆU CHUNG Test nhanh – Ý nghĩa

 Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh

 Phát hiện vi khuẩn gây bệnh có số lượng thấp trong quần thể các vi sinh vật không gây bệnh khác

 Kiểm tra, giám sát thực hành vệ sinh trong quá trình sản xuất, chế biến

 Giảm nhân công, do đó tiết kiệm được thời gian và tiền bạc

CÁC LOẠI TEST NHANH

 Phỏng theo và tự động hóa phương pháp cổ truyền

 Biosensor’s

 Phương pháp miễn dịch

 Thử nghiệm dựa trên acid nuclec

 Kỹ thuật lai phân tử

 Kỹ thuật nhân gen (PCR)

 Kỹ thuật chip gen

PHỎNG THEO VÀ TỰ ĐỘNG HÓA PP CỔ TRUYỀN

 Hợp chất chỉ thị sinh học nhạy cảm với nhiệt độ hoặc như đầu dò DNA và RNA

 Phát hiện sản phẩm trao đổi chất, kháng thể, phân tích acid nucleic, phân tích sự tương tác của các tác nhân gây bệnh với tế bào nhân điển hình

 ATP bioluminescence: sử dụng hỗn hợp enzym và coenzym phát hiện ATP, ngưỡng phát hiện: 103 vi khuẩn

PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH

 Là phương pháp gắn kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu

 ELISA: thời gian dài, 16-24h

THỬ NGHIỆM DỰA TRÊN ACID NUCLEIC

 Lai phân tử:

 Sử dụng đầu dò DNA phát hiện sự có mặt của các gen đặc hiệu

 Kỹ thuật nhân gen (PCR):

 Làm tăng số chuỗi DNA đặc hiệu trong mẫu

Test nhanh – Định nghĩa (BYT)

 Test thử nhanh là những test có:

- Thao tác đơn giản

- Thời gian ngắn hơn so với phương pháp thông thường

- Có thể thực hiện ngoài hiện trường

- Không cần đến thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm

Ý NGHĨA

 Phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra ngoài hiện trường

 Có tác dụng sàng lọc nhanh, cho kết quả sơ bộ để nhận định về một mối nguy vệ sinh an toàn thực phẩm có thể có

 Không sử dụng test nhanh trong trường hợp đánh giá về chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của một sản phẩm hoặc trong trường hợp có tranh chấp, khiếu kiện Các trường hợp này cần sử dụng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm

GIỚI THIỆU TEST THỬ NHANH 3M PETRIFILM

 3M petrifilm là một loại đĩa môi trường khô chuẩn bị sẵn để nuôi cấy đếm vi khuẩn và nấm, bao gồm:

 Gel tan và đông đặc nhanh trong nước lạnh

 Các chất dinh dưỡng cần thiết

 Chỉ thị màu

Ưu điểm của 3M petrifilm

 Không phải chuẩn bị môi trường, kỹ thuật ổn định

 Giảm các thiết bị cần thiết như autoclave

water-bath, incubator

 Giảm tiêu hao năng lượng

 Giảm không gian thao tác

 Giảm chi phí xử lý chất thải ra môi trường

 Được coi là phương pháp chính thức áp dụng

 Nâng cao tính hiệu quả – dễ dàng hơn trong sử dụng và đọc kết quả

3M petrifilm

 Cấu tạo

- Gồm một túi đựng các đĩa môi trường

- Dụng cụ dàn mẫu (spreader)

 Các dụng cụ, môi trường kèm theo

- Dung dịch pha loãng mẫu

- Kéo, thìa xúc mẫu vô trùng

- Túi xử lý mẫu

1 Bảo quản các túi chưa sử dụng ở ≤ 8°C Sử dụng trước ngày hết hạn ghi trên túi Để

đạt hiệu quả tốt nhất, cần đưa các túi về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

2 Mở túi theo hướng dẫn

3 Bảo quản các túi còn lại ở chỗ khô ráo, nhiệt độ ≤ 25°C trong vòng một tháng

4 Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 trong túi đồng nhất mẫu vô trùng

5 Sử dụng nước đệm pepton hoặc pepton muối để pha loãng mẫu Không sử dụng nước

đệm có citrat, bisulphite hoặc thiosulphate vì ức chế sự phát triển của vi khuẩn

6 Đồng nhất mẫu, chỉnh pH trong khoảng 6-8 Sử dụng NaOH 1N cho sản phẩm acid,

HCl 1N cho sản phẩm kiềm

7 Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang Nâng màng đậy đĩa lên, dùng pipet man nhỏ nhẹ

nhàng 1ml mẫu vào giữa đĩa

8 Cẩn thận đặt màng phim xuống sao cho không tạo thành bọt khí

9 Nhẹ nhàng đặt spreader lên và dàn đều mẫu trước khi gel đông đặc Không xoắn hoặc

trượt spreader Nhấc spreader ra và để yên 1 phút Chú ý làm tuần tự từng đĩa một

10 Ủ ấm các đĩa đã nuôi cấy ở 24h/37°C ±1°C Mỗi chồng để tối đa 20 đĩa

11 Nếu không có khuẩn lạc nào xuất hiện sau 24 ± 2h, kết quả trả lời (-)

12 Nếu có, đếm các khuẩn lạc điển hình theo đặc trưng của từng loại vi khuẩn

Enterobacteriaceae Count Plate

Bảo quản và thải bỏ:

 Bảo quản các đĩa Petrifilm chưa mở ở ≤ 8°C

 Để tránh làm ẩm các túi đã mở, không để lại vào tủ lạnh

 Giữ các túi đã mở ở nơi khô ráo, mát, chỉ trong vòng một tháng

 Không sử dụng các đĩa đã ngả màu vàng hoặc nâu

 Không sử dụng các đĩa đã lây nhiễm vi khuẩn Việc thải bỏ phải tuân theo hướng

dẫn hiện hành của nhà sản xuất

Giới thiệu chung

 Đây là một loại môi trường nuôi cấy sẵn

 Bao gồm: VRB, Gel (hòa tan trong nước lạnh), Tetrazolium(chỉ thị màu)

 Phạm vi áp dụng: Đếm Enterobacteriaae trong thực phẩm và công nghiệp sữa

 Không áp dụng cho nước, dược phẩm, mỹ phẩm

Dụng cụ và thuốc thử

 Đĩa Petrifilm đếm Enterobacteriaceae

 Spreader nhựa

 Pipet 1-10 ml

 Máy đếm khuẩn lạc

 Dung dịch pha loãng

 Dung dịch natri hydroxyde vô trùng

- Cân vô trùng 11,0g mẫu vào bình hoặc túi đồng nhất mẫu

- Thêm 99ml nước pha loãng

- Đồng nhất mẫu ở 6000- 18000rpm/2 phút

- Chỉnh pH tới 6,5-7,5 with NaOH 1M, khoảng 0,1ml/g mẫu

- Trộn đều bằng cách lắc 25 lần/7 giây với khoảng lắc là 30 cm

Enterobacteriaceae – Đặc điểm

 Trực khuẩn Gram âm

 Lên men glucose

- Dung dịch pepton muối (ISO method 6887)

- Nước đệm pepton (ISO method 6579)

- Nước muối sinh lý

 Nâng màng đậy petrifilm và nhỏ 1ml mẫu thử hoặc dung dịch mẫu thử vào giữa đĩa

 Cẩn thận cuốn và đặt tấm film xuống sao cho không tạo thành bọt khí

 Dàn mẫu trong vùng đường kính 20cm2 bằng spreader

 Đặt nhẹ spreader vào giữa đĩa

 Ấn nhẹ để dàn đều mẫu

 NHấc spreader ra và để ít nhất 1 phút để gel đông đặc

Chú ý: - Phải dàn nhanh mẫu trước khi gel đông đặc

- Không đưa spreader từ bên này sang bên kia đĩa

 Khuẩn lạc Enterobacteriaceae có màu đỏ với vùng màu vàng bao quanh/ hoặc

khuẩn lạc màu đỏ có bòng hơi, có hoặc không có vùng màu vàng bao quanh

 Đường kính vùng phát triển khoảng 20 cm2

 Nếu ước tính trên đĩa có nhiều hơn 100 khuẩn lạc thì đếm một vài ô đại diện rồi tính kết quả trung bình cho một ô

 Nhân số trung bình của một ô với 20 để tính ra số khuẩn lạc trên cả đĩa

Chú ý:

 Không đếm những bóng hơi sinh ra trong quá trình thao tác

 Không đếm nhứng khuẩn lạc trên mép ranh giới của đĩa vì những khuẩn lạc này không chịu tác động ức chế của môi trường nuôi cấy chọn lọc

 Hơi sinh ra do Enterobactericeae có thể phá vỡ các khuẩn lạc, do đó không đếm

những khuẩn lạc nằm ngoài bóng hơi hoặc không có vùng màu vàng

 Đôi khi, trên các đĩa có nhiều hơn 100 khuẩn lạc, khuẩn lạc và bóng hơi có thể không rõ ràng; acid sinh ra sẽ làm thay đổi toàn bộ đĩa thành màu vàng, trường hợp này cần tăng độ pha loãng mẫu và thử lại

 Có thể sử dụng các khuẩn lạc này cho những bước xác định tiếp theo bằng cách nâng tấm film đậy lên và lấy khuẩn lạc trên gel

acid Salmonella sp ATCC

- Lên men lactose sinh hơi và acid ở 37°C : 95% là coliform

- Lên men lactose sinh hơi và acid ở 44°C : 90 % là E.coli

Định nghĩa hiện nay về Coliforms

 Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, sinh acid và hơi khi lên men lactose

(24-48h/36±2°C)

 Thermotolerant (Fecal) coliform : thuộc họ Enterobacteriaceae, có khả năng phát

triển và lên men lactose ở 44,5±2°C bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và

Citrobacter (E.coli sinh Indol từ tryptophan)

Coliforms được coi là nhóm vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh

Coliforms – Phát triển và nơi cư trú

Nhóm coliform: bao gồm vi khuẩn đường ruột & và vi khuẩn sống tự do

Fecal coliform, được giả thiết là sống trong ruột của động vật máu nóng

•E coli ch ỉ phát triển ở ruột

động vật.

Mô tả

 Các đĩa đã sẵn có môi trường Violet Red Bile (VRB)

 Gel có thể hòa tan trong nước lạnh

 Chất chỉ thị cho hoạt tính của Glucuronodase Glucoronidase)

(5-bromo-4chloro-3-indolyl-ß-D- Tetrazolium, chất chỉ thị để đếm khuẩn lac

Phạm vi: thích hợp để đếm E.coli and Coliform trong thực phẩm và công nghiệp sữa

không thanh trùng

Cảnh báo:

 Không sử dụng riêng loại đĩa để phát hiện E.coli O157

 Loại đĩa này không phải là chỉ thị đặc biệt để phát hiện E.coli O157 vì hầu hết các chủng E.coli O157 không điển hình khuẩn lạc không có màu đỏ và sinh hơi

 Không sử dụng đĩa Petrifilm EC plates để chẩn đoán ở người và động vật

Bảo quản và thải bỏ:

 Bảo quản các túi chưa mở ở ≤ 8°C (460 F)

 Để các túi đạt đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

 Cất các đĩa chưa sử dụng vào túi

 Để ngăn ngừa sự hút ẩm, không để lại các túi đã mở vào tủ lạnh

 Bảo quản các túi ở nơi khô ráo, thoáng mát trong vòng một tháng

 Các đĩa nuôi cấy giữ ở >25°C và/hoặc độ ẩm>50% dễ dàng cho việc thực hiện

thao tác

 Không sử dụng cấc đĩa đã ngả màu vàng hoặc màu nâu

 Việc thải bỏ sau khi sử dụng tuân theo quy định hiện hành của nhà sản xuất

Hướng dẫn sử dụng

Chuẩn bị mẫu:

- Sử dụng dung dịch pha loãng vô trùng thích hợp

- Đối với sản phẩm acid, chỉnh pH của mẫu thử tới 6.6 – 7.2 bằng NaOH 1N

- Đối với sản phẩm kiềm, chỉnh pH bằng HCl 1N

- Trộn đều hoặc đồng nhất mẫu

- Đặt đĩa Petrifilm EB lên mặt phẳng ngang

- Nhấc màng film lên và nhỏ 1ml dung dịch mẫu thử vào giữa đĩa

- Từ từ đặt tấm film xuống sao cho không tạo thành bọt khí

- Đặt mặt nhẵn của spreader vào giữa đĩa

- Nhẹ nhàng ấn spreader để dàn đều mẫu Không đưa spreader ngang qua mặt đĩa

- Nhấc spreader ra, để ít nhất một phút cho gel đông đặc

- Mỗi chồng đĩa không để quá 20 đĩa Buồng ủ ấm nên làm ẩm để hạn chế sự bốc hơi mẫu Hơi ẩm từ các đĩa không vượt quá 15% trong 48 h nuôi cấy

Thời gian ủ ấm và nhiệt độ nuôi cấy:

 AOAC method: Ủ ấm đĩa Petrifilm EC 48±2h ở 35±1°C

Giải thích kết quả:

 Đĩa Petrifilm EC có thể đếm trên máy đếm khuẩn lạc hoặc nguồn sáng có kính

phóng đại

 Không đếm các khuẩn lạc trên bờ ranh giới vì không chịu tác động của môi trường chọn lọc

 Không đếm các bóng hơi hình thành do thao tác

 Xấp xỉ 95% E.coli có sinh hơi

 Thông thường, khuẩn lạc E.coli có màu xanh hoặc đỏ xanh, sinh hơi (đường kính khoảng 1 mm)

 Khuẩn lạc Coliform màu đỏ sáng, sinh hơi (đường kính khoảng 1mm)

3M TM Petrifilm TM

E.coli/Coliforms Count Plate

Giải thích kết quả

 Khuẩn lạc có sinh hơi

 Coliform = 7

 Vòng số 1 = Khuẩn lạc không sinh hơi

 Vòng 2 = Bóng hơi do thao tác

 Vòng 3 = Khuẩn lạc sinh hơi

 Số khuẩn lạc Coliformcount = 69

 Vòng 1, 2 và 3 có thể cho thấy sự khác nhau của các kiểu bóng hơi.

E.coli Count Plate

Đếm đĩa Petrifilm

 Đếm các khuẩn lạc màu đỏ

 Phạm vi 25-250 khuẩn lạc

Yeast and Mold Count PlateHướng dẫn bảo quản

 Bảo quản ở 8°C

 Trước khi sử dụng phải để đạt tới nhiệt độ phòng

 Bảo quản nơi khô, mát

Chuẩn bị mẫu

 Chuẩn bị dung dịch pha loãng

 Cân mẫu vào túi

 Đổ một lượng thích hơp dung dịch Butterfield’s phosphate vào túi

 Đồng nhất mẫu

Nuôi cấy

 Đặt đĩa petrifilm trên bề mặt phẳng, nâng tấm phim lên

 Nhẹ nhàng nhỏ 1ml mẫu đã pha loãng vào giữa đĩa

 Hạ tấm phim xuống sao cho không tạo thành bóng hơi

 Không sử dụng nước pha loãng có citrat, thiosulfate, bisulfate vì ức chế sự phát triển

 Để tính cho toàn bộ đĩa, nhân số KL trung bình/cm 2

17/36

Trường hợp 4

 Ước tính số KL nấm men >10 4

 Đĩa này quá nhiều Kl không thể đếm được

 Các Kl nhỏ mầu xanh ở rìa đĩa không được tính

Trường hợp 5

 Ước tính số KL nấm mốc bằng 64

 Đếm số Kl ở ¼ đĩa rồi nhân với 4 để ra tổng số

Trường hợp 6

 Hình 6a và 6 b là của cùng một mẫu

 6a: độ pha loãng 1/10,

số Kl quá nhiều không đếm được

 6b: độ pha loãng 1/100,

số KL quan sát được

<150

6 a 6 b

Trường hợp 7

 Kết quả (-)

 Đĩa petrifilm sử dụng thuốc nhuộm màu phosphate.

 Các SP thực phẩm có chứa phosphate làm cho đĩa có màu xanh tối

 Để làm giảm phản ứng phosphate:

- Cần tăng thêm độ pha loãng

- Xử lý mẫu: trộn đều và

để lắng 3-5 phút trước khi

đổ đĩa để tránh các hạt trong trường hợp 8

- Quan sát sau 24 – 36h

Trường hợp 8

 Điểm xanh sẫm trong trường hợp 8 thường gặp ở các mẫu gia vị, các mẫu hạt xay nhỏ.

Trường hợp 11

 Đôi khi nhìn mắt thường không phân biệt được nấm men, nấm mốc nên cần soi vi thể bằng kính hiển vi

 Nâng tấm film lên, dùng que cấy lấy KL trên lớp gel

 Hòa khuẩn lạc vào giọt nước cất vô trùng trên lam kính, đậy lamen và soi kính

21/36

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NHANH VSATTP

XÉT NGHIỆM NHANH HÓA HỌC

Định nghĩa

• Thao tác đơn giản

• Thời gian ngắn hơn so với phương pháp thông thường

• Có thể thực hiện ngoài hiện trường

• Không cần đến thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm

KIT KIỂM TRA NHANH PHẨM MÀU CT04

• Phẩm màu được sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm

• Trên thị trường có phẩm màu kiềm và phẩm màu acid

• Nhóm phẩm màu kiềm chiết xuất từ than đá không được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm

Nguyên tắc:

- Phẩm màu dẫn xuất từ than đá có tính kiềm, tan được trong nước và trong cồn

- Dung dịch phẩm màu tác dụng với amoniac giải phòng chất màu kiềm, tan được trong ete và nhuộm màu ete

- Khi dung dịch này tác dụng với acid acetic loãng, chất màu chuyển sang và nhuộm màu dung dịch acid

- Phẩm màu acid không có tính chất này

Cấu tạo:

- Hộp 20 bộ thử

- Mỗi bộ thử gồm:túi CT4; ống thuốc thử CT2; ống thuốc thử CT3

- Dụng cụ hỗ trợ: kẹp miệng túi, kim nhọn

- 01 bản hướng dẫn sử dụng

Đặc tính kỹ thuật:

- Kích thước hộp: 120x60x60 mm

- Giới hạn phát hiện: 5mg/kg

- Thời gian phát hiện: 5 phút

- Độ đặc hiệu: 10 loại phẩm màu tổng hợp được phép sử dụng đều cho kết quả âm tính

KẾT QUẢ

4 Brilliant blue FCF Xanh Không màu (-)

KIT KIỂM TRA NHANH PHẨM

KẾT QUẢ

1 Basic Green 4(Malachit Green) Xanh lá cây Xanh lá

cây

(+)

3 Basic Blue 11(VictoriaBlue) Xanh nước

biển

Xanh nước biển

(+)

4 Basic Blue 9 (Methylene Blue) Xanh nước

biển

Xanh nước biển

(+)

HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG KIT KIỂM TRA NHANH PHẨM MÀU CT 04

Xử lý mẫu

23/36

- Mẫu dạng rắn (mứt, ô mai, các loại hạt ): lấy 5g cắt nhỏ thành cỡ hạt

ngô(5x5mm); Các loại hạt nhỏ có thể để nguyên (hạt dưa, hạt bí…)

- Mẫu chất lỏng hoặc dạng kem: lấy khoảng 5 ml

Tiến hành:

- Bước 1: Cắt miệng túi CT04 (sát đường mép dán phía trên), cho 5g mẫu đã cắt nhỏ/(5ml), gấp miệng túi, kẹp chặt bằng kẹp sắt, lắc nhẹ 2 phút để chất màu tan vào dung dịch

- Bước 2: Lấy 1 ống CT2, bẻ đầu, cho hết dung dịch vào túi, gập miệng túi, kẹp chặt bằng kẹp sắt, lắc nhẹ 2 phút, để yên cho phân thành 2 lớp

- Bước 3: Lấy 1 ống CT3, cầm ống theo chiều đứng, dùng kim chọc thủng một lỗ ở góc trên của ống, bóp thân ống giưa hai ngón tay tại vị trí dưới cùng của ống để đuổi không khí trong ống, giữ nguyên tay bóp Mở túi CT04, cắm ngập đầu ống CT3 (đầu có

lỗ vào lớp dung môi phía trên túi), thả lỏng tay để lớp dung môi hút vào ống CT3 Khi dung môi dâng lên khoảng 1cm, lật nhanh ống CT3 ngược lên, lắc nhẹ ống, giữ nguyên

1 phút và đọc kết quả

Đọc kết quả:

- Dương tính: Lớp dung dịch phía dưới ống CT3 có màu

- Âm tính: lớp dung dịch phía dưới ống CT3 không có màu

Chú ý:

- Cần gập kín miệng túi để tránh bay hơi dung môi

- Khi thực hiện bước 3, không được hút lẫn dung dịch phía dưới vào ống CT3 để tránh làm sai lệch kết quả

- Cần thao tác nhanh để hạn chế bay hơi dung môi

- Nên thực hiện ở chỗ thoáng gió, không nên thực hiện trong phòng kín

KIT KIỂM TRA NHANH SALICYLIC ST 04

• Acid salicylic được sử dụng sản xuất thuốc chống nấm ngoài da cho người và đông vật

• Cấm sử dụng trong bảo quản và chế biến thực phẩm

Nguyên tắc: acid salicylic và các salicylat trong môi trường acid sẽ phản ứng với ion

Fe3+ để tạo thành phức hợp có màu tím