NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật và THÀNH PHẦN hóa học của lá XOÀI TRÒN yên CHÂU, sơn LA

Xoài tròn (Mangifera indica L.) là một đặc sản của tỉnh Sơn La, nổi tiếng trên cả nước. Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ khai thác quả xoài tròn, còn cành, lá cây xoài tròn thông qua việc tỉa cành hàng năm đều không được sử dụng. Để có thể làm tăng giá trị sử dụng nguồn nguyên liệu lớn, lá xoài tròn (Mangifera indica L.) của huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La, góp phần xóa đói, giảm nghèo ở các tỉnh vùng sâu, vùng xa, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá Xoài tròn Yên Châu, Sơn La” với 2 mục tiêu chính: một là giám định được tên khoa học của cây Xoài tròn Yên Châu dựa trên các nghiên cứu về đặc điểm hình thái và vi học; hai là xác định được sự có mặt và hàm lượng của mangiferin trong lá xoài. Sau một thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả sau:  Về thực vật Đã mô tả đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học cho cây xoài tròn thu hái tại huyện Yên Châu, Sơn La là loài Mangifera indica L., họ Anacardiaceae. Mô tả chi tiết đặc điểm vi phẫu gân lá, cuống lá và đặc điểm bột lá của cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La góp phần làm cơ sở cho việc kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu sau này.  Về hóa học Bằng phản ứng hóa học đã xác định được trong lá xoài tròn Yên Châu có các thành phần: flavonoid, tanin, carotenoid, steroidtriterpen, đường khử. Kết quả định tính bằng sắc kí lớp mỏng có so sánh với mangiferin chuẩn, khai triển hệ dung môi EtOAcHCOOHH2O 10:1,5:1 cho thấy trong lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La có mangiferin. Đã khảo sát khả năng chiết xuất mangiferin của hỗn hợp dung môi EtOHH2O bằng SKLM và HPLC, nhận thấy EtOH 70o là dung môi có khả năng chiết mangiferin tốt nhất. Bằng phương pháp HPLC, đã khảo sát hàm lượng mangiferin trong lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La: lá bánh tẻ có hàm lượng mangiferin cao nhất (7,39%), tiếp đến là lá xoài non (6,78%) và lá xoài già (6,47%). Đã tiến hành chiết xuất, tinh chế và xác định được cấu trúc của mangiferin từ lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La.

tạo điều kiện của ban giám hiệu Trường Đại học dược Hà Nội và bộ mônDược liệu cùng rất nhiêu bộ môn khác trong trường.

Dầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc của mình đến

TS Đỗ Quyên là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luậnnày

Cũng nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS NguyễnQuốc Huy đã hướng dẫn tôi nghiên cứu về các đặc điểm hình thái cây xoàitròn Yên Châu, Sơn La

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo cùng các anh chị kĩthuật viên khác tại Bộ môn Dược Liệu, Bộ môn Thực Vật và các bộ môn kháctrong trường đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt qúa trìnhhọc tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngần

DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương I: TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật chi Mangifera L 2

1.1.1.Vị trí phân loại chi Mangifera L 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của của chi Mangifera L 2

1.3.3 Khóa phân loại của chi Mangifera L 2

1.3.4 Chi Mangifera L ở Việt Nam 5

1.2 Thành phần hóa học của chi Mangifera L 6

1.2.1 Nhóm các hợp chất của phenol và acid benzoic 6

1.2.2 Coumarin 6

1.2.3 Flavonoid 7

1.2.4 Xanthon 7

1.2.5 Tinh dầu và các hợp chất thơm 8

1.2.6 Triterpen 9

1.2.7 Steroid 10

1.3 Công dụng và ứng dụng của các loài thuộc chi Mangifera L trong Y học cổ truyền và Y học hiện đại 11

1.3.1 Trong lĩnh vực Y học cổ truyền 11

1.3.2 Trong Y học hiện đại 12

1.4 Các nghiên cứu về chiết xuất và định lượng mangiferin 12

1.4.1 Tính chất của mangiferin 12

1.4.2 Một số qui trình chiết xuất mangiferin 13

1.4.3 Một số phương pháp định lượng Mangiferin 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 17

2.2.1 Nguyên vật liệu 17

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 18

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Nghiên cứu thực vật 18

2.4.2 Nghiên cứu về hóa học 19

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 21

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 21

3.1.1 Đặc điểm hình thái của cây xoài tròn huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La 21

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá xoài tròn 24

3.1.3 Đặc điểm bột lá xoài tròn 27

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học 28

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 28

3.2.2 Định tính dịch chiết lá xoài tròn bằng sắc kí lớp mỏng 32

3.2.3 Khảo sát khả năng chiết xuất mangiferin của EtOH bằng sắc ký lớp mỏng 34

3.2.4 Định lượng mangiferin trong lá xoài tròn bằng phương pháp HPLC 35

3.2.5 Chiết xuất mangiferin từ lá xoài tròn 37

3.3 Bàn luận 41

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Đề xuất 44

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học và phiếu chứng nhận mã số tiêu bản của

cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La

Phụ lục 2: Pic sắc kí của và phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch mangiferin chuẩn

1ppm

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

SKLM: Sắc kí lớp mỏng.

TT: Thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG

với hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1].

Bảng 3.2: Diện tích pic của dãy dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau

Bảng 3.3: Kết quả định lượng mangiferin trong lá xoài tròn khi chiết bằng dung môi

EtOH 90o, 70o và 50o

Bảng 3.4: Kết quả định lượng mangiferin trong các mẫu M4, M5.

Bảng 3.5: Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc kí đồ của chất M và mangiferin

chuẩn khai triển hệ dung môi ở các điều kiện khác nhau

Bảng 3.6: Kết quả định tính chất M bẳng phản ứng hóa học

Bảng 3.7: Phổ 1H, 13C-NMR của M và mangiferin

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.3: Một số hơp chất nhóm flavonoid phân lập từ chi Mangifera L.

Hình1.4: Các hợp chất nhóm xanthon phân phân lập từ chi Mangifera L.

Hình 1.5: Một số hợp chất monoterpen có trong chi Mangifera L.

Hình 1.6: Một số hợp chất sesquiterpen có trong Mangifera L.

Hình 1.7: Cấu trúc một số dẫn chất cycloartan phân lập từ chi Mangifera L.

Hình 1.8: Các hợp chất triterpenoid tetracyclic nhóm damaran được phân lập từ chi

Mangifera L.

Hình 1.9: Khung pregnan, pregnenolon, progesterol

Hình 1.10: Khung stigmastan và một số dẫn chất stigmastan trong xoài

Hình 1.11: Công thức của mangiferin

Hình 3.1: Hình ảnh cây và hoa xoài tròn Yên Châu-Sơn La

Hình 3.2: Ảnh chụp các bộ phận của hoa, quả, lá xoài tròn

Hình 3.3: Vi phẫu gân chính và phiến lá xoài tròn

Hình 3.4: Một góc của vi phẫu gân chính lá xoài tròn

Hình 3.5: Vi phẫu phiến lá xoài tròn

Hình 3.6: Vi phẫu cuống lá xoài tròn

Hình 3.7: Một góc của vi phẫu cuống lá xoài tròn

Hình 3.8: Các đặc điểm của bột lá xoài tròn

Hình 3.10: Đồ thị đường chuẩn mangiferin.

Hình 3.11: Hình ảnh sắc kí đồ chất M so sánh với mangiferin chuẩn, khai triển hệ

dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [2:0,3:0,2]

Hình 3.12: Tinh thể chất M

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, thuốc phòng và điềutrị bệnh ngày càng phong phú, bao gồm thuốc có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp.Trong đó nguồn nguyên liệu tự nhiên là nguồn quan trọng để nghiên cứu phát triểnthuốc mới và sản xuất trong công nghiệp dược đối với thuốc có nguồn gốc thảodược

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, mưa nhiều, địa hình đadạng rất thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển nhiều loại cây thuốc quý Cùngvới kinh nghiệm dân gian sử dụng cây thuốc để phòng và chữa bệnh, rất nhiều câythuốc quý được sử dụng trong công nghiệp dược làm thuốc

Một trong những tỉnh miền núi phía Bắc nước ta có sự đa dạng sinh học cao

đó là tỉnh Sơn La Sơn La là tỉnh miền núi cao nằm ở phía tây bắc Việt Nam, có khíhậu nhiệt đới gió mùa, mùa đông lạnh khô, mùa hè nóng ẩm, mưa nhiều Do địahình bị chia cắt sâu và mạnh nên hình thành nhiều tiểu vùng khí hậu, cho phép pháttriển một nền sản xuất nông - lâm nghiệp phong phú Vùng cao nguyên Mộc Châuphù hợp với cây trồng và vật nuôi vùng ôn đới Vùng dọc sông Đà phù hợp với câyrừng nhiệt đới xanh quanh năm Trong tổng số diện tích đất sản xuất nông nghiệp(247.684 ha), diện tích trồng cây ăn quả chiếm gần 10% (24.016 ha) Trong đó, xoài

tròn (Mangifera indica L.) là một đặc sản của tỉnh Sơn La, nổi tiếng trên cả nước.

Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ khai thác quả xoài tròn, còn cành, lá cây xoài trònthông qua việc tỉa cành hàng năm đều không được sử dụng Để có thể làm tăng giá

trị sử dụng nguồn nguyên liệu lớn, lá xoài tròn (Mangifera indica L.) của huyện

Yên Châu, tỉnh Sơn La, góp phần xóa đói, giảm nghèo ở các tỉnh vùng sâu, vùng xa,

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá Xoài tròn Yên Châu, Sơn La” với 2 mục tiêu chính: một là giám định được

tên khoa học của cây Xoài tròn Yên Châu dựa trên các nghiên cứu về đặc điểm hìnhthái và vi học; hai là xác định được sự có mặt và hàm lượng của mangiferin trong láxoài

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm thực vật chi Mangifera L.

1.1.1.Vị trí phân loại chi Mangifera L.

Theo hệ thống phân loại của Takhatajan (1987, 2009) [6], [46], họ Đào lộn

hột và chi Mangifera L có vị trí như sau :

Ngành Ngọc lan (Mangiphylata)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Liên bộ Cam (Rutanae)

Bộ Cam (Rutales)

Họ Đào lộn hột (Anacardiaceae Lindl 1830)

Phân họ Anacardioideae (Anacardioideae)

Chi Mangifera (Mangifera Linnaeus, 1753)

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của của chi Mangifera L.

Đặc điểm hình thái chung của chi Mangifera L.: Cây gỗ thường xanh, có

kích thước lớn Lá đơn mọc so le, có cuống, phiến lá nguyên, dai Cụm hoa hìnhchùy ở ngọn cành Hoa nhỏ, mẫu 4 hay mẫu 5, tiền khai hoa lợp Cánh hoa đôi khihàn liền ở gốc Cánh hoa có 1-5 sống nổi bật 5 nhị hoa rời hoặc dính liền với đĩamật, thường có 1 hoặc 2 nhị lớn hơn Đĩa mật tạo thành từ 5 tuyến riêng biệt ởngoài nhị Bầu nhẵn một ô, 1 noãn, 1 vòi nhụy ở đỉnh bầu Quả có hột cứng, vỏ quảgiữa có xơ, vỏ quả trong dày, cứng, chắc Hạt có 1 hoặc đa phôi [28]

Theo Koster mans và Bompard 1993, chi Mangifera L gồm 69 loài phân bố

chủ yếu ở các vùng nhiệt đới của châu Á như: Ấn Độ, Miến Điện, Sri Lanka, Thái

Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia, Nam Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Papua

New Guinea, Philippin, quần đảo Solomon, một vài loài trong quần đảo Thái BìnhDương (Hawai)… [37]

1.3.3 Khóa phân loại của chi Mangifera L.

Chi Mangifera Linnaeus, 1753 gồm 69 loài Hooker (1862) là người đầu tiên phân chia chi Mangifera L thành hai phân chi dựa trên đặc điểm và kích thước của

đĩa mật Sau ông, rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra hệ thống phân

loại cho chi Mangifera L với rất nhiều quan điểm khác nhau Trong đó, hệ thống

của Kostermans và Bompard 1993 là phổ biến nhất Trong hệ thống này tác giả đã

dựa trên quan điểm của Hooker chia các loài trong chi Mangifera L thành hai phân chi: phân chi Lumus (Marchand) Kosterm (có đĩa mật giống cuống hoa hoặc không

có đĩa mật) và phân chi Mangifera (đĩa mật lớn rộng hơn và nằm phía ngoài bầu nhụy) Sau đó ông dựa vào 14 đặc điểm khác để phân chi tiếp thành các nhóm nhỏ hơn và các loài Phân chi Limus có gần 10 loài trong đó có 2 loài M odorata và M.

foetida tìm thấy ở Việt Nam Phân chi Mangifera được phân chia tiếp thành nhóm :

 Nhóm Marcbandora Pierre: nhóm này có một loài duy nhất M gedebe Miq.

Theo 2 tác giả này đây chính là hai loài M Camptosperma và M reba đã

được Phạm Hoàng Hộ mô tả tại Việt Nam

 Nhóm Euantberae Pierre: nhóm này có 3 loài trong đó có hai loài M.

cochinchinensis và M caloneura (hay M dupperreana Pierre) đã được Phạm

Hoàng Hộ mô tả có mặt ở Việt Nam

 Nhóm Rawa Kosterm: nhóm này có 9 loài trong đó có loài M minutifolia có

ở Việt Nam

 Nhóm Mangifera: nhóm này được phân chia tiếp thành 3 phân nhóm nhỏ

hơn:

 Phân nhóm hoa mẫu 4: có 15 loài

 Phân nhóm hoa mẫu 4-5: có 5 loài trong đó có hai loài M indica và

M dongnaiensis có mặt ở Việt Nam.

 Phân nhóm hoa mẫu 5: có 15 loài trong đó có các loài M indica; M.

laurina (hay M longipes Griff.) và M Flava có ở Việt Nam.

Loài M indica có mặt ở cả hai phân nhóm hoa mẫu 4-5 và hoa mẫu 5 Trong

69 loài, ngoài các loài đã được phân loại trên còn có 12 loài không có vị trí phânloại chính xác vì không có đủ chứng cứ

Các đặc điểm mà Kostermans và Bompard (1993) dựa vào để phân loại chi

Mangifera L gồm có:

(1) Hình dạng đĩa hoa.

(2) Số nhị hoa hữu thụ

(3) Hạt có phức tạp không

(4) Hình dạng của các nhánh thứ cấp trong cụm hoa

(5) Lông tơ trên chùm hoa

(6) Hình dạng, số lượng và đặc điểm gân lá

(14) Màu sắc và độ mịn của quả

(15) Số lượng kích thước các sợi xơ ở hạt

Các đặc điểm được xắp xếp theo theo trình tự mức độ quan trọng trong việcđịnh loài [37]

Theo Thực vật chí Đông Dương, H Lecomte đã phân loại chi Mangifera L gồm 11 loài trong đó có 9 loài có vị trí phân loại rõ ràng và 2 loài M reba; M.

camptosperma không có vị trí phân loại xác định [62] Sau đó 2 loài M reba và M camptosperma được hai tác giả Koster mans và Bompard (1993) xếp vào cùng với

loài M gedebe, loài M duperreana tương ứng được gọi dưới một tên khác là M.

caloneura [50].

Theo thực vật chí ba nước Campuchia, Lào, Việt Nam (1962) đã liệt kê vàphân loại 12 loài giống như các loài mà Phạm Hoàng Hộ đã mô tả, trong đó xâydựng khóa phân loại cho 9 loài, một loài chưa được biết đầy đủ là M minutifolia và

2 loài không tìm thấy là M macrocarpa Bl., M odorata Griff [49]

Do đặc trưng về vị trí địa lí và khí hậu nên số lượng các loài thuộc chi

Mangifera tại Trung Quốc không phong phú như tại Thái Lan, Việt Nam và các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới khác Theo thực vật chí Trung Quốc chi Mangifera L.

chỉ có 5 loài là: M indica, M siamensis, M persiciforma, M laurina và M sylvatica [28]

1.3.4 Chi Mangifera L ở Việt Nam

Theo Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam có 12 loài thuộc chi Mangifera L [8] Tuy nhiên hai loài M camptosperma Pierre, và M reba Pierre được Kosterman và Bompard (1993) xếp vào một loài chung là M gedebe Miq [37]

Theo Võ Văn Chi và Nguyễn Tiến Bân ở Việt Nam có 11 loài (bảng 1.1)

gồm các loài như Phạm Hoàng Hộ đã mô tả trừ loài M cassia [1], [6]

Bảng 1.1 : Một số loài thuộc chi Mangifera L và phân bố tại Việt Nam.

1 M indica L. Xoài Trung và Nam bộ

2 M odorata Griff. Xoài thơm Miền Nam

3 M cochinchinensis Engel. Xoài nụt Bình Dương, Đồng Nai

4 M camptosperma Pierre. Xoài bùi Bình phước, Bình Dương,

Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh

5 M dongnaiense Pierre. Xoài Đồng Nai Lâm Đồng, Đà Lạt, Bình

Dương, Đồng Nai

6 M duperreana Pierre. Quéo

Lâm Đồng, Ninh Thuận, Tây Ninh, Bình Dương, Tp

Hồ Chí Minh, Kiên Giang

7 M reba Pierre. Quéo Đồng Nai

8 M foetida Lour. Xoài hôi, muỗm,

1.2 Thành phần hóa học của chi Mangifera L.

Cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài

thuộc chi Mangifera L Trong đó loài M indica L là loài phổ biến và được nghiên

cứu nhiều nhất Thành phần hóa học đáng chú ý gồm có: Các hợp chất phenol vàacid benzoic, coumarin, flavonoid, xanthonoid, tinh dầu (monoterpen,sesquiterpen), steroid, triterpen và vitamin Đặc biệt mangiferin, một xanthonglycoside được nghiên cứu nhiều nhất và là thành phần có nhiều hoạt tính sinh học

1.2.1 Nhóm các hợp chất của phenol và acid benzoic

Các hợp chất thuộc nhóm này gồm có: acid gallic [40], [43], và các dẫn chấtcủa nó : methyl galate, n-propylga late [43] Chúng chủ yếu được tìm thấy ở hoa, lá

và vỏ thân của các loài thuộc chi Mangifera L.

Hình 1.1: Acid gallic và các dẫn chất của nó phân lập từ chi Mangifera L.

Ngoài ra còn có các dẫn chất acid benzoic và acid 3,4-dihydroxy benzoic,

propyl benzoate [43], 5-[2(Z)-heptadecyl] resorcinol [24], 5-(12Cis- heptadecencyl)

resorcinol và 5-pentadecyl resorcinol được tìm thấy trong vỏ thân xoài [26]

1.2.2 Coumarin

Hai hợp chất thuộc nhóm coumarin đã được tìm thấy vỏ thân, vỏ rễ của loài

M indica: acid ellagic (I) [40], mangcoumarin (II) [39].

O MeO

Flavonoid là một trong những thành phần hóa học chính của chi Mangifera

L., chúng được tìm thấy trong lá, quả và hạt của cây Các flavonoid được tìm thấy

trong các loài của chi Mangifera L chủ yếu thuộc các nhóm: methylcyanidin 3-O-β -D-galactopyranoside, 7-O- methylcyanidin [25]; Flavan-3-

Anthocyanidin:]7-O-ol : catechin, epicatechin [43]; FlavonAnthocyanidin:]7-O-ol có quercetin, [16], [30], quercetin

diglycosid, quercetin galactosid, quercetin glucoside, quercetin xyloside, quercetin 3-O- arabinopyranoside, quercetin 3-O- arabinofuranosid, quercetin 3-O- rhamnoside, kemferol-3- glucoside [16], myrcetin [30]; Biflavon có:

3-O-I-4’, I3-O-I-4’, I-5, I-5, I-7, II-7-hexahydroxy-[I-3’,II-8]-biflavon [34]

O

OH OH HO

O-glactoside OH

OMe OH

Cl

Biflavon Anthocyanidin (paeonidin-3-galactoside)

Hình 1.3: Một số chất thuộc nhóm flavonoid phân lập từ Mangifera L.

1.2.4 Xanthon

Đây là nhóm hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Mangifera L Cấu trúc

hóa học chung của nhóm là một bộ khung xanthon có gắn nhiều nhóm OH, nhóm

OH có thể được thay bằng liên kết O-glycosid hoặc C-glycosid với 1 phân tửđường Các hợp chất thuộc nhóm này gồm có: mangiferin [16], [30], [32], [33],homomangiferin [32]; euxanthon; 1,3,5,6,7-pentamethoxyxanthon; 1,3,6,7,8-penta

hydroxyxanthon [30], mangiferin-6’-O-galate [16] Trong đó mangiferin là hoạt

chất có hàm lượng khá cao và cũng là chất có nhiều tác dụng sinh học: kháng virut,đái tháo đường, chống viêm, điều hòa miễn dịch

OH Glu OH

Công thức chung của các hợp chất xanthon Mangiferin

Hình 1.4: Các hợp chất nhóm xanthon phân lập từ chi Mangifera L.

1.2.5 Tinh dầu và các hợp chất thơm

Các hợp chất monoterpen và sesquitecpen chính là các thành phần tạo nên

mùi thơm đặc trưng chi Mangifera L Các thành phần này chủ yếu được tìm thấy

trong hoa, vỏ quả, một số được tìm thấy ở lá cây

Monoterpen

Camphren ∆2-Caren ∆3-Caren α-Pinen

β-Pinen β- Myrecen Carveol

ρ-Cymene ρ-Geranial Linalol

Hình 1.5: Một số hợp chất monoterpen có trong chi Mangifera L.

Các monoterpen tìm thấy trong các loài của chi này chủ yếu thuộc nhóm cácdẫn chất không chứa oxy như: ∆2- và∆3-caren, camphren, limonen, β-myrecen, α-

và β-phellandren, α- và β-pinen, β-ocimen, Cis-ocimen caryophylen, α-terpinolen,

α- và γ-terpinen, α-thujen,… Ngoài ra, còn có các dẫn chất chứa oxy gồm có: cymen, carveol, ρ-linalol ,…[14], [38], [39], [44], [47]

p-Theo một nghiên cứu về tinh dầu chiết xuất từ vỏ quả xoài M indica L ở

Nigeria, cho thấy hàm lượng các monoterpen cao (83,2%) trong đó thành phần chủyếu là: ∆3-caren (58,2%), α-pinen (13,0%) [15]

Sesquiterpen

Các hợp chất sesquiterpen đã tìm thấy ở chi Mangifera L đều là các hợp chất

có cấu tạo hai vòng như: δ-cadinen, α-cubeben, caryophyllen, bulnesen, elemene, γ-gurjunen, α-guainen, α-humulen, γ-murolene, β-selinen, valenecen,….hoặc ba vòng như α-copaen [14], [38], [39], [47]

β-i - Pr

δ-Cadinen β- Caryophyllen α- Guainen

i - PR

α- Copaene β-Bulnesen Cadalene

Hình 1.6: Một số hợp chất sesquiterpen từ chi Mangifera L

Các hợp chất khác

Trong thành phần của tinh dầu xoài còn có các hợp chất khác như:acetaldehyde, 2-hexenal, nonanal, 2-nonenal, ethyl butanolate, hexenol, methylhexanooate, methyl beoate, [14, [39], [44], [47]

1.2.6 Triterpen

Cho đến nay đã tìm thấy khoảng 60 hợp chất triterpen từ các loài thuộc chi

Mangifera L bao gồm các triterpen pentacyclic và triterpen tetracyclic Các hơp

chất triterpen pentacyclic gồm có các nhóm như: olean, ursan, [17], [20], [22], [36],fridelan [17], [18], [22], [29], [30]; lupan [19], [35], [36]; hopan [31]; taraxastan[20], [21], [22], [23] và cycloartan [17], [18], [19], [20], [21], [22], [27] Trong đónhóm cycloartan chiếm số lượng lớn nhất Công thức chung của nhóm bao gồm bộkhung cycloartan với một nối đôi ở các vị trí khác nhau (vị trí C số 23, 24, 25) trênmạch nhánh, các nhóm thế gồm có: một nhóm OH hoặc O gắn vào các vị trí C số 3,một nhóm OH gắn vào một trong các vị trí 22, 24, 25; nguyên tử carbon số 26, 27

có thể bị oxy hóa thành COOH hoặc CHO, CH2OH Các hợp chất này chủ yếu đượctìm thấy ở vỏ cây

OH OH

Acid hydroxy mangiferolic 3β,24,25-Triol-cycloartane

Hình 1.7: Cấu trúc một số dẫn chất cycloartan phân lập từ chi Mangifera L.

Anjaneyulu và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất teriterpen tetracyclicnhóm damaran là 3β,20(S)-diol-dermar-24-en (III) [17] [19] và 3-oxo-dammar-24-

en-20S,26a-diol (IV) [20] từ một số thứ của loài M indica L của Ấn Độ.

R2HO

R1

Hình 1.8: Các hợp chất triterpenoid tetracyclic nhóm damaran được phân lập

từ M indica L.

1.2.7 Steroid

Cho đến nay đã tìm thấy khoảng 9 steroid có trong các loài M indica, M.

persiciformis, M sylvatica Các steroid đã được tìm thấy thuộc hai nhóm khung cơ

Khung Pregnan Pregnenolon Progesteron

Hình 1.9: Khung pregnan, pregnenolon, progesteron.

Nhóm stigmastan gồm có: β-sitosterol [20], [23], [29], [32], stigmasterol,stigmas-7en-3β-ol [29], daucosterol, 6β-hydroxy stigmast-4-en-3one [23],

R1 R2(III) -OH CH3(IV) =O CH2-OH

mangdesisterol Trong đó β-sitosterol được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận củacây Xoài Các hợp chất còn lại chủ yếu được tìm thấy trong hoa, quả và hạt

Stigmastan β-Sitosterol Stigmasterol

Hình 1.10: Khung stigmastan và một số dẫn chất stigmastan trong xoài.

1.3 Công dụng và ứng dụng của các loài thuộc chi Mangifera L trong Y học cổ

truyền và Y học hiện đại

1.3.1 Trong lĩnh vực Y học cổ truyền

Xoài thường được trồng để lấy quả ăn, đóng hộp xuất khẩu Quả xoài ngon,

bổ dưỡng, có tác dụng nhuận tràng lợi tiểu, ra mồ hôi, giải nhiệt, trị bệnh loạn huyết

và loạn óc, tiêu hóa kém [11] Xoài thái miếng mỏng ngâm rượu vang với đường,thêm một ít quế thơm hoặc thái miếng sấy khô làm nguồn vitamin C tự nhiên [13]

Vỏ quả xoài dùng để cầm máu, chống xuất huyết, rong kinh, bạch đới, kháihuyết, chảy máu ruột dưới với liều 20-40g/ngày, sắc uống hoặc dùng dưới dạng caolỏng, 10g cao lỏng pha vào 120ml nước, cách 1-2h cho uống một thìa cà phê [11],[13]

Hạch quả dùng để trị giun, kiết lỵ, trĩ, xuất huyết với liều 5-10g/ngày, sắcuống [1] Nhân xoài sấy khô tán bột được người dân Ấn Độ, Braxin dùng làm thuốctảy giun với liều 1,5-2g Philipin dùng nước sắc nhân xoài để điều trị tiêu chảy [11]

Vỏ thân xoài có thể dùng tươi hoặc dùng khô Vỏ tươi đem giã vắt lấy nướcdùng như vỏ quả xoài Vỏ khô dùng dưới dạng thuốc sắc Ở Campuchia dùng vỏthân xoài để chữa thấp khớp (đắp nóng bên ngoài) hoặc rửa để chữa khí hư, bạchđới ở phụ nữ

Nhựa vỏ cây xoài màu nâu đen, không mùi, vị đắng hắc, tiếp xúc không khíthì đặc lại, khi hòa vào nước có thể dùng để bôi ghẻ [11]

Lá xoài được dùng để trị các bệnh đường hô hấp trên như ho, viêm phế quản,tiêu chảy kiết lỵ, viêm ngứa ngoài da Liều 20-30g/ngày, sắc uống [13].

1.3.2 Trong Y học hiện đại

Vỏ thân, vỏ cành, lá xoài dùng để chiết xuất dịch chiết toàn phần hoặc chiếtmangiferin tinh khiết làm thuốc Trên thị trường Cuba hiện có chế phẩm Vimang®(dịch chiết toàn phần từ vỏ thân, lá xoài) được sử dụng như một thực phẩm chứcnăng để hỗ trợ điều trị một số bệnh miễn dịch, dị ứng, chống oxy hóa, hỗ trợ trongđiều trị HIV Trên thị trường Việt Nam hiện nay cũng có rất nhiều sản phẩm vớithành phần chính là Mangiferin chủ yếu dùng để chữa bệnh do virus herpes như:Viên nang cứng Mangoherpin 100mg, kem Mangoherpin 5%,… và diệt khuẩn nhưdung dịch Manginovim 60ml

1.4 Các nghiên cứu về chiết xuất và định lượng mangiferin

1.4.1 Tính chất của mangiferin

Mangiferin là một xanthonoid có công thức hóa học là: C19H18O11 (M=

442,35), được Wiechowski (1923) phân lập từ vỏ cây Mangifera indica L Iseda

(1957) đã xây dựng cấu trúc mangiferin Sau đó Ramanahan và Sechadi (1960) đãnghiên cứu điều chỉnh lại cấu trúc Cấu trúc được thừa nhận hiện nay là mộtglycoside có phần aglycon có bộ khung xanthon với 4 nhóm hydroxyl và một phân

tử glucose đính vào C số 2

O

O HO

HO

OH Glu OH

Hình 1.11: Công thức của mangiferin

Mangiferin có dạng tinh thể hình kim, phiến hay vảy mỏng, màu vàng nhạt,

ít tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, aceton nóng Dễ tan hơn trong hỗnhợp các dung môi trên với nước Nhiệt độ nóng chảy: 269 – 270oC [10], [12]

1.4.2 Một số qui trình chiết xuất mangiferin

Do đặc tính của mangiferin tan được trong methanol, ethanol nóng nên cácqui trình chiết xuất chủ yếu sử dụng hai loại dung môi này làm dung môi chiết xuất

Để tinh chế mangiferin có khá nhiều phương pháp nhưng phương pháp được sử

dụng nhiều nhất là kết tinh lại nhiều lần trong dung môi thích hợp Dưới đây là một

số qui trình chiết xuất magiferin từ vỏ và lá xoài

Phạm Xuân sinh và Phạm Gia Khôi (1991) đã chiết mangiferin từ vỏ và láxoài theo qui trình sau: vỏ hoặc lá sau khi làm sạch sấy khô được chiết ba lần vớimethanol, đun sôi cách thủy 1-1,5h Lọc nóng Gộp dịch chiết lại để nguội đến nhiệt

độ phòng Flavonoid thô tủa xuống, lọc lấy tủa Cho tủa vào một lượng methanol,đun nóng, thêm một lượng than hoạt, hòa cho tan hết tủa Lọc nóng Để nguội, lọcthu lấy tủa có màu vàng đậm hơn Làm lại vài lần sẽ thu được mangiferin tinh khiếthơn Hiệu suất chiết của vỏ thân là 3%, của lá khô là 1,6% [9]

Shashi Kant Singh và cộng sự chiết mangiferin từ vỏ thân của M Indica L.

bằng ethanol sau đó tách và tinh chế mangiferin bằng phương pháp sắc kí hấp phụtheo qui trình: dược liệu sau khi loại chất béo bằng cách chiết kiệt với ether dầu hỏatrong bình Soxhlet (60-80oC, 56h) được chiết kiệt với ethanol 95% (56h) Dịch chiếtthu được cô dưới áp xuất giảm thu được bột vô định hình màu vàng Bột thu đượcđược hấp phụ lên cột silicagel (60-120mesh), nhồi cột bằng ether dầu hỏa, rửa rảibằng hỗn hợp dung môi CHCl3/MeOH (1:1) thu được mangiferin màu vàng nhạtdạng vô đinh hình Kết tinh lại bằng methanol thu được tinh thể mangiferin hìnhkim màu vàng nhạt [45]

S Muruganandan và cộng sự cũng chiết mangiferin bằng ethanol theo quitrình tương tự nhưng tinh chế bằng phương pháp kết tinh Dịch chiết ethanol thuđược đem cô dưới áp xuất giảm đến cắn, loại chất béo nhiều lần rồi hòa tan vàoethanol Để 2 tuần ở nhiệt độ phòng thu được bột màu trắng ở dạng vô định hình.Kết tinh lại nhiều lần trong hỗn hợp dung môi H2O-EtOAc thu được mangiferin tinhthể màu vàng, hình kim Độ tinh khiết được xác định bằng HPLC đạt 95,56% [41]

Để đánh giá khả năng chiết xuất của một số dung môi và hàm lượng

mangiferin từ lá của ba thứ xoài thuộc loài M indica L., Aranya Jutiviboonsuk và

Chanchai Sardsaengjun đã khảo sát ba dung môi methanol, ethanol và acetone 70%

để chiết xuất mangiferin Ngâm lạnh 100g bột lá mỗi thứ xoài với mỗi dung môichiết xuất ở nhiệt độ phòng, sau một tuần rút dịch chiết và thêm dung môi mới, làm

3 lần Dịch chiết đem lọc, bốc hơi chân không ở 40oC đến cắn Phân tán cắn vào50ml hỗn hợp dung môi gồm dung môi chiết xuất và nước (tỷ lệ 1:1, tt/tt) Sau đóchiết với 100ml dichlomethan x 4 lần Gạn lấy lớp dung môi-nước đem thủy phântrong bình hồi lưu với acid sulfuric ở pH=3 trong 1h, khuấy trộn liên tục Làm lạnhđến nhiệt độ phòng, lắc với 100ml ethylacetat x 3 lần Gạn lấy lớp ethylacetat đem

methanol 70% và để tủ lạnh qua đêm (4-8oC) Lọc, rửa tinh thể, sấy khô Kết quảcho thấy sử dụng methanol chiết theo qui trình trên cho khối lượng mangiferin caonhất, và sử dụng aceton cho khối lượng mangiferin thấp nhất [33]

1.4.3 Một số phương pháp định lượng Mangiferin

Dựa vào các đặc tính của mangiferin người ta đã nghiên cứu xây dựng nhiềuphương pháp định lượng hoạt chất này như: phương pháp cân, phương pháp tạpphức, phương pháp đo phổ tử ngoại, phương pháp sắc kí…

1.4.3.1 Phương pháp cân

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 10,00g dược liệu lá đã làm nhỏ và xácđịnh độ ẩm Chiết bằng chloroform trong bình soxhlet tới khi dịch chiết không màu.Chiết bằng methanol đến khi dịch chiết trong bình soxhlet nhỏ lên giấy lọc khôngcho màu vàng khi hơ trên hơi NH4OH Bốc hơi cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằnghỗn hợp dung môi aceton : nước (1:1), lọc qua giấy lọc Cất thu hồi dung môi, côđến cắn Hòa cắn vào methanol nóng để 24h, để mangiferin kết tinh Lọc, rửa tinhthể, sấy ở 60o đến khối lượng không đổi Cân và tính ra hàm lượng Đây là mộtphương pháp đơn giản, dễ thực hiện nhưng độ chính xác không cao nên hiện nay ítđược sử dụng [12]

1.4.3.2 Phương pháp đo độ hấp thụ

Mangiferin có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, cực đại hấp thụ ở bướcsóng 369nm Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,001-0,01% Trong khoảng hàm lượngnày, độ hấp thụ tuân theo định luật Lambert-beer tỷ lệ thuận với nồng độ Do đó cóthể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ tử ngoại để định lượng mangiferin

Cân chính xác 1,00g dược liệu đã xác định độ ẩm Chiết với chloroformtrong bình Soxhlet đến khi dịch chiết không màu Chiết tiếp với methanol cho tớikhi hết mangiferin Cho dịch chiết methanol vào bình định mức 100ml, tráng bìnhchiết 3lần bằng methanol Thêm methanol đủ thể tích, lắc đều Hút chính xác 5mlcho vào bình định mức 100ml thứ 2, bổ sung đủ thể tích Dung dịch trong bình địnhmức 2 đem đo quang ở bước sóng 369nm, đo 3 lần, lấy kết quả trung bình, mẫutrắng là methanol Xây dựng đường chuẩn bằng cách chuẩn bị dãy dung dịch cónồng độ: 0,0075%; 0,0025%; 0,002%; 0,001% trong methanol Đo quang ở bướcsóng 369nm với mẫu trắng là methanol.

Đo độ hấp thụ là một phương pháp khá đơn giản có thể thực hiện ở nhiềuphòng thí nghiệm và độ chính xác cao nên có thể dùng để kiểm nghiệm dược liệu[10]

1.4.3.3 Phương pháp sắc kí sử dụng sắc kí lỏng cao áp (HPLC)

Tác giả Bùi Thị Hằng đã nghiên cứu xây dựng phương pháp sắc kí lỏng cao

áp để định lượng mangiferin Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị như sau: cân 1,00gdược liệu xay nhỏ đã xác định hàm ẩm Chiết bằng methanol cho đến khi hếtmangiferin trong bình Soxhlet Cô cạn dịch chiết đến 80ml, chuyển sang bình địnhmức 100ml, thêm methanol đến vạch chuẩn Dung dịch mangiferin chuẩn có nồng

độ 0,02% trong methanol Điều kiện sắc kí: pha tĩnh: Hitachi gel 3050, pha động:methanol, cột: 2,5 x 500mm, detector tử ngoại ở bước sóng 369nm, tốc độ dòng:1ml/phút [7]

Jeping Quen đã xây dựng qui trình định lượng mangiferin như sau: Lá xoàisau khi làm nhỏ sấy khô, được chiết với methanol 40% trong bình nón, cân và ghilại khối lượng của bình Lắc nhẹ, ngâm 30 phút, siêu âm 40 phút ở nhiệt độ phòng.Làm lạnh và thêm methanol đủ khối lượng ban đầu Lọc dịch chiết qua màng lọc0,45µm - 5µl, sử dụng để tiêm mẫu sắc kí Điều kiện sắc kí: cột C18, dài 250mm x4,6mm, đường kính hạt nhồi cột 5µm Pha động: dung dịch phosphoric acid 0,1%(tt/tt) (dung môi A) và acetonitrile (dung môi B) Chương trình dùng môi: 0 phút:10% B; 15 phút: 12% B; 20 phút: 15% B; 30 phút : 45% B; 35 phút: 10% B; thời

gian cân bằng sau quá trình rửa rải là 10 phút Tốc độ dòng 1.0 mL /phút Detector

UV ở 258nm Duy trì nhiệt độ 30oC Độ hồi phục trung bình của phương pháp này

ở ba nồng độ là 98,7-101,5%, độ tuyến tính cao (r = 0,9998) đối với cả hai chất trênmột khoảng rộng nồng độ [32]

1.4.3.4 Phương pháp điện di mao quản

Sau khi nghiên cứu các điều kiện tiến hành của phương pháp điện di maoquản, Chaozan Nong và cộng sự đã đưa ra các thông số của phương pháp này nhưsau: hỗn hợp dung môi gồm: dung dịch đệm borat 0,5M (pH = 7,4) và methanol (tỷ

lệ 1:0,3 tính theo tt/tt) điện áp sử dụng là 20kV, bộ phận phát hiện detector UV-VISvới bước sóng là 254nm Phạm vi tuyến tính của phương pháp này là 5-1000µg,giới hạn phát hiện 1,5µg Độ đúng của phương pháp ở ba nồng độ định lượng (10,500,1000µg) đều lớn hơn 99% (99,00; 99,38 và 99,14%) Độ lệch chuẩn tương đốidưới 3% Điện di mao quản là một phương pháp đơn giản và đáng tin cậy có thể sửdụng để phát hiện và định lượng mangiferin trong nhiều lĩnh vực có liên quan [42]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La

Địa điểm thu mẫu: bản Poong, xã Chiềng Pằn, huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La

Thời gian thu mẫu: tháng 3 năm 2012 và tháng 1 năm 2013

Mẫu nghiên cứu gồm có lá già, lá bánh tẻ và lá non

2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Nguyên vật liệu

Mẫu nghiên cứu thực vật:

 Lá tươi sau khi thu hái được ngâm trong cồn 50o để nghiên cứu đặc điểm viphẫu.

 Lá sau khi thu hái được sấy khô, tán thành bột mịn để nghiên cứu đặc điểmbột

 Cành mang hoa tươi và lá sau khi thu hái một phần được ngâm với EtOH 50o,một phần được ép tiêu bản khô để nghiên cứu đặc điểm hình thái

Mẫu nghiên cứu hóa học: các mẫu lá cây xoài tròn huyện Yên Châu, tỉnh Sơn Lasau khi thu hái được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, nghiền thành bột thô, bảoquản trong túi nilon kín, ở nơi khô ráo

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của cây xoài tròn thu hái

ở huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La

 Mô tả đặc điểm vi phẫu cuống lá và gân lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La

 Mô tả đặc điểm bột lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

 Định tính các nhóm chất chính trong lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La bằng

phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.

 Xây dựng đường chuẩn mangiferin bằng phương pháp HPLC

 Khảo sát hàm lượng mangiferin trong lá xoài tròn bằng phương pháp HPLC

 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng mangiferin từ lá xoài tròn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu thực vật

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái: Mô tả phân tích đặc điểm hình thái theo

phương pháp mô tả phân tích cây thuốc [4], [5] Làm tiêu bản khô và lưu mẫu tiêubản tại Phòng tiêu bản thực vật, bộ môn thực vật trường Đại học Dược Hà Nội Dựatrên cơ sở các kết quả phân tích đặc điểm thực vật kết hợp với các tài liệu để xácđịnh tên khoa học của cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu lá xoài tròn: Tiêu bản vi phẫu lá và cuống lá

được làm theo phương pháp cắt tẩy và nhuộm kép Tiêu bản được chụp trên kínhhiển vi Các đặc điểm giải phẫu lá và cuống lá được phân tích theo nguyên tắcnghiên cứu tiêu bản vi phẫu [5]

- Nghiên cứu đặc điểm bột lá xoài tròn: Dược liệu sau khi làm sạch, cắt

nhỏ, sấy khô được đem tán nhỏ, làm tiêu bản soi bột [4] Các đặc điểm được mô tảtheo phương pháp môt tả bột dược liệu [3]

2.4.2 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học: Các phản ứng

hóa học được tiến hành theo nguyên tắc chiết xuất và định tính các hợp chất hữu cơ

có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3]

- Định tính bằng sắc kí lớp mỏng

Bản mỏng GF254 đã hoạt hóa ở 110oC trong 1h

Dịch chấm sắc kí được chiết bằng dung môi MeOH

Hệ dung môi khảo sát: (1) CHCl3- EtOAc-HCOOH [4 : 8 : 1,5]

(2) EtOAc-HCOOH-H2O [10 : 1,5 : 1]

Phương pháp phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng thường, UV 254, UV 365,hiện màu bằng hơi ammoniac dưới ánh sáng thường [48].

- Chiết xuất và tinh chế mangiferin từ lá xoài

Chiết xuất: Sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi EtOH 70o.Tinh chế: Loại tạp nhiều lần bằng n-hexan và chloroform, sau đó sử dụngphương pháp kết tinh trong EtOH

- Nhận dạng chất phân lập: được dựa trên tính chất hóa lý và phổ 1NMR và phổ 13C-NMR

H Khảo sát hàm lượng mangiferin trong lá xoài bằng phương pháp HPLC

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1,00g bột lá xoài đã xác định độ ẩm cho

vào bình chiết hồi lưu 2h với 20ml ethanol 90o, lọc nóng thu dịch chiết lần 1 Thêmtiếp 20ml EtOH 90o, tiếp tục chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2.Tiến hành tương tự chiết lần thứ 3 Gộp dịch chiết 3 lần vào bình định mức 100ml

bổ sung bằng dung môi chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 1) Sau đó lấy 1mldịch chiết cho vào bình định mức dung tích 50ml bổ sung bằng dung mối chiết xuấtcho đủ thể tích (dung dịch 2) Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào bình định mức dungtích 10ml, thêm pha động đến vạch (dung dịch 3) Dung dịch 3 được phân tích bằngHPLC

Điều kiện sắc kí: Cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động:

Acetonitril - Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lưu lượng dòng 1,0ml/phút; Bộphân phát hiện: Detector UV- VIS Bước sóng: 257nm Thể tích tiêm mẫu 20µl

Phương pháp xử lí số liệu: Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm

Microsoft Ofice Excel 2007:

 Dựng đường chuẩn mangiferin

Với: h2: độ pha loãng từ dung dịch 1 thành dung dịch 2

h3: độ pha loãng từ dung dịch 2 thành dung dịch 3

Hàm lượng Mangiferin được tính theo công thức:

6

.100.10

.100 (1 )

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái của cây xoài tròn huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La

Cây thân gỗ, cao, sống lâu năm

Lá đơn, nguyên, mọc so le, có cuống Cuống lá dài 2,5-3,5cm có thể dài tới5-6cm Phiến lá nguyên hình mũi mác, dài 24-27cm có thể dài tới 35cm, rộng 5,5-6,5cm Gốc lá thuôn nhọn Ngọn lá nhọn hoắt, phần cuối kéo dài bóp nhọn tạothành đuôi dài khoảng 1-1,5cm Gân lá hình lông chim, có khoảng 21-23 đôi gânphụ Mặt trên lá màu xanh đậm, bóng Mặt dưới màu xanh nhạt Mạng lưới gân dày,nhìn thấy rõ ở cả hai mặt Cành non mập

Hình 3.1: Hình ảnh cây và hoa xoài tròn Yên Châu, Sơn La.

Cụm hoa dạng chùm kép 3-4 lần, hình chùy hoặc hình tháp, dài đến 30-35

cm, phủ lông mịn, trục chính có màu hồng tím hoặc hồng phớt Lá bắc con hình tamgiác, phủ lông mịn, dài khoảng 1,5-2mm, màu xanh, rụng sớm Trên chùm hoa có 2loại hoa: hoa lưỡng tính và hoa đực Hoa nhỏ, đều, rất thơm Cuống hoa có khớp,dài khoảng 2-3mm, phủ lông mịn Hoa mẫu 5 (có khi là 4 hoặc 6), 5 (có khi 4 hoặc

6) lá đài rời dài khoảng 2 mm màu xanh nhạt, phủ lông mịn; 5 (4 hoặc 6) cánh hoarời, thường nhẵn, dài khoảng 3,5-4mm Trên cánh có 5 sống nổi rõ màu vàng hoặchoặc hồng tím, phần gốc dính liền, phần đỉnh sống không tách khỏi bề mặt cánh.Cánh hoa mới nở có màu vàng nhạt sau chuyển sang màu hồng tím, cong ngược vềphía sau Tiền khai hoa dạng van Đĩa mật giống cái đệm, do 4-5 bộ phận hợpthành, cao 1-1,5mm, nằm ngoài bao lấy nhị và bầu nhụy Bộ nhị chỉ có 1 nhị hữuthụ có kích thước lớn hơn, chỉ nhị hữu thụ dài khoảng 2mm; có thể có 1 nhị bất thụ,nhị bất thụ nếu có dài khoảng 0,5- 0,7mm, thiếu bao phấn hoặc bao phấn lép Baophấn đính lưng, 4 ô Hoa lưỡng tính có bộ nhụy do 1 lá noãn hợp thành bầu thượng,màu xanh nhạt, đường kính 1-1,5mm, bầu 1 ô với 1 noãn, đính noãn bên Vòi nhụyđính lệch sang bên phía đối diện với nhị hữu thụ, dài 1,5-2mm Hoa đực có bầunhụy tiêu biến hoàn toàn hoặc rất nhỏ, vòi nhụy vẫn còn hoặc tiêu biến.

Công thức hoa *♀ K5 C5 A1 hoặc 2 G(1) và*♂ K5C5A1 hoặc 2

Quả có hạch, hình xoài, có mũi lệch, tù Vỏ giữa có xơ, vỏ qủa trong dàycứng chắc

Hình 3.2: Ảnh chụp các bộ phận của hoa, quả, lá xoài tròn

Chú thích: (1a), (1b): Hoa cái nguyên vẹn có hoặc không có nhị bất thụ, (1c): Hoa đực, (2a)-(2b): Hoa cắt dọc, (3a)-(3b): Lá bắc cấp 1-cấp 2, (4): Đài hoa, (5a)-(5b:) Cánh hoa, (6:) Đĩa mật, (7a): Nhị bất thụ, (7b): Nhị hữu thụ, (7c): Bao phấn, (8a): Bầu nhụy, (8b): Bầu cắt dọc, (8c): Bầu cắt ngang, (9): Các bộ phân của hoa khi xếp trên một mặt phẳng, (10): Lá, (11): Quả xoài, (12a)-(12b): Lát cắt dọc và cắt ngang quả xoài, (13): Hạt, (14): Nội nhũ.

(12a)

Dựa trên bản mô tả đặc điểm hình thái cây xoài tròn được thu hái ở huyệnYên Châu, tỉnh Sơn La; căn cứ vào các tài liệu phân loại và khóa phân loại hiện có

như Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Thực vật chí Trung Quốc, Thực vật chí

Đông Dương, Thực vật chí Campuchia-Lào-Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của TS.

Nguyễn Quốc Huy, chúng tôi đã giám định mẫu xoài tròn Yên Châu, Sơn La

(HNIP/1782/13) là loài: Mangifera indica L, họ Anacardiaceae.

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá xoài tròn

Vi phẫu gân chính và phiến lá

Gân chính:

Gân chính có lát cắt ngang lồi cả hai mặt Lớp biểu bì gồm một hàng các tếbào hình chữ nhật xếp đều đặn Phủ ngoài lớp biểu bì là một lớp cutin mỏng Dướilớp biểu bì là lớp mô dày tròn với các tế bào hình bầu dục hoặc hình tròn Tinh thểcalci oxalat nằm rải rác trong các tế bào mô dày và mô mềm Xen kẽ trong lớp môdày là các tế bào cứng và sợi, lá càng già thì số lượng càng nhiều có khi tạo thànhmột lớp gần như liên tục ngay dưới lớp biểu bì Ở mặt dưới, các tế bào cứng và sợinằm ngay sát lớp biểu bì tạo thành một vòng liên tục ngay sát lớp biểu bì Lớp tếbào mô mềm với tế bào hình tròn hoặc hình bầu dục, thành mỏng Các bó libe- gỗcấu tạo cấp 2 có kích thước không đều xếp thành vòng tròn Đỉnh các bó libe- gỗ cócác đám tế bào mô cứng ôm lấy bó libe, tạo thành một vành ở bên ngoài lớp libe.Phần libe thường có hình gần tròn hoặc bầu dục, rỗng ở giữa Dưới lớp gỗ cấp 2 là

mô mềm ruột với các tế bào hình tròn có kích thước không đều thành mỏng

Phiến lá:

Bên ngoài là lớp biểu bì gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn,biểu bì mặt trên dày hơn mặt dưới Bên dưới lớp biểu bì là các tế bào mô giậu hìnhchữ nhật dài xếp vuông góc với lớp biểu bì Tiếp đó là lớp mô mềm hình bầu dụchoặc hình đa giác thành mỏng Tinh thể calci oxalat nằm rải rác trong các tế bào mômềm

Chú thích: (1): Lớp Cutin, (2): Biểu bì, (3): Mô dày, (4): Tế bào mô cứng và sợi., (5): Mô

mềm, (6): Mô cứng bao ngoài libe, (7): Libe cấp 2, (8): Gỗ cấp 2, (9:) Mô mềm ruột, (10):

Mô dậu, (11): Tinh thể calci oxalat.

Vi phẫu cuống lá

Lát cắt cuống lá có hình gần giống hình tròn Ngoài cùng là lớp cutin mỏng

bao ngoài, tiếp đến là lớp biểu bì gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn

Lớp tế bào mô dày hình tròn, hình bầu dục, vách tế bào dày đều (mô dày tròn) Xen

2

19

11

giữa lớp mô dày là các tế bào cứng và sợi xếp thành vòng gần như liên tục, lá cànggià thì các tế bào sợi càng nhiều, vòng càng liên tục Dưới lớp mô dày là 1-2 hàng tếbào mô mềm hình tròn hoặc bầu dục thành mỏng Có nhiều tinh thể calci oxalatnằm rải rác trong các tế bào Các bó libe-gỗ kích thước khác nhau, xếp thành vòngtròn Đỉnh các bó libe-gỗ cũng có vòng tế bào cứng ôm lấy bó libe như ở gân chínhcủa lá Libe cấp 2 hình tròn hoặc bầu dục rỗng ở giữa Trong cùng là mô mềm ruột.

Hình 3.6: Vi phẫu cuống lá Xoài tròn.

Hình 3.7: Một góc của vi phẫu cuống lá xoài tròn.

Chú thích: (1): Cutin, (2): Biểu bì, (3): Mô dày, (4): Mô cứng và sợi, (5): Mô mềm, (6): Libe, (7): Gỗ, (8): Mô mềm ruột, (9): Tế bào cứng ôm lấy bó libe-gỗ, (10): Tinh thể calci oxalat .

24563

3.1.3 Đặc điểm bột lá xoài tròn

Bột màu xanh lục, mùi thơm nhẹ, vị chát Soi dưới kính hiển vi nhìn thấy:Mảnh mô mềm gồm các tế bào hình bầu dục, hình tròn, thành mỏng (1); mảnh mômềm có mang theo tinh thể calci oxalat (2) Mảnh mạch chủ yếu là mạch điểm (3),mạch vạch (4) Các mảnh mang màu nâu đỏ nằm rải rác (5) Sợi gồm các tế bào dài,thành dày khoang hẹp thường tập trung thành từng bó (6) Các tế bào cứng thànhdày, khoang hẹp (7) Rất nhiều tinh thể calci oxalat hình khối kích thước khác nhaunằm rải rác (8), hoặc thành từng đám (9) Mảnh biểu bì (10) và mảnh biểu bì cómang lỗ khí (11), lỗ khí (12)

Hình 3.8: Các đặc điểm của bột lá xoài tròn.

Chú thích: (1): Mảnh mô mềm, (2): Mảnh mô mềm mang tinh thể calci oxalat, (3): Mạch điểm, (4): Mạch vạch, (5): Mảnh mang màu, (6): Bó sợi, (7): Tế bào cứng, (8): Tinh thể calci oxalat hình khối, (9): Đám tinh thể calci oxalat, (10): Mảnh biểu bì, (11): Mảnh biểu

bì có mang lỗ khí, (12): Lỗ khí.

(6)(2)

(9)(5)

(11)

(7)(12)

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

3.2.1.1 Flavonoid

Cân 0,5g dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 15ml cồn 90o đun trực tiếp

10 phút Lọc nóng qua bông, dịch lọc thu được dùng để làm các phản ứng

- Phản ứng với NH 4 OH

Nhỏ một 2 giọt dịch chiết cồn lên 2 tờ giấy lọc, sấy khô, đem một tờ giấy lọc

hơ trên miệng lọ NH4OH đặc thấy màu vàng của vết dịch chiết đậm và sáng hơnhẳn so với vết dịch chiết trên tờ giấy lọc còn lại (Phản ứng dương tính)

Cân 10g dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90, đun trực tiếp

10 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc thu được dùng để làm phản ứng

- Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết Thêm vào ống 1 0,5mldung dịch NaOH 10% Ống 2 để nguyên Sau khi thêm kiềm, ống 1 xuất hiện tủavàng

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi Để nguội Ống 1 có tủa vàng Ống 2 trongThêm vào cả hai ống mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều Ống 1 có tủa đục Ống

2 trong suốt