Kết quả và biện luận Hypericin và khảo sát các giá trị PKa bằng phương pháp phổ hấp thụ UV-VIS

Kết quả và biện luận Hypericin và khảo sát các giá trị PKa bằng phương pháp phổ hấp thụ UV-VIS

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUÁ VÀ BIỆN LUẬN

4.1 TONG HOP HYPERICIN VA KET QUA DO pK, CUA HYPERICIN:

4.1.1 PHUONG PHAP CO LAP-

-Một số tác giả đã tổng hợp được hypericin, nhưng việc tình chế hypericin

thường rất phức tạp phải sắc ký cột nhiều lần, sử dụng pha tĩnh sephadex khá đắt

tiên; pha động là DMSO/MeOH khá độc và khó loại

-Ở đây chúng tôi đã tìm ra được một phương pháp cô lập đơn giản và kinh tế hơn

Đo dựa vào tính chất của hypericin trong dụng dịch; tầy thuộc vào pH mà nó sẽ tôn tại ở dạng Hyp, Hyp hoặc Hyp”; dang Hyp thường khó tan con dang Hyp hoặc Hyp” dễ tan,

Vì vậy: * Để loại các tạp chat dé tan thì môi trường dung môi rửa hypericin phải

thật acid (pH < 2) để hypericin kết tủa đạng Hyp và tạp chất tan vào dung môi,

* Để loại các tạp chất khó tan thì dùng môi trường dung mdi hdi baz

(pH~ 8), hic dé hypericin 6 dang Hyp’ rat dé tan trong dung mdi vA tap chat khé

tan sẽ tách ra Acid hóa dung dich Hyp’ sé thu được hypericm,

- Bằng cách trên chúng tôi đã thu được hypericin với hiệu suất 60% và độ tỉnh khiết cao

32

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUÁ VÀ BIỆN LUẬN

4.12 NHẬN DANH HYPERICIN:

Trong sơ đồ tổng hợp hypericin ở mục 3.2 gồm các bước:

-Bước 1: tổng hợp emodin anthron

* So sánh phổ !H và '?C của emodin anthron tổng hợp được với phổ 'H và ''C của emodin ban đâu Chúng tôi nhận thấy ở phổ 'H của emodin anthron có xuất hiện mũi đơn, 2H, ở vùng 4.27ppm tương ứng với nhóm methylen (-CH;-) còn phổ 'H của emodin không có mỗi ở vùng này

M0106748 ANTHRONE (DHSO-DE: 298K)

10 10.0 39.0 8.0 1 5

—31—— tose

PPM

Hình 4: Phổ 'H NMR cua emodin anthron trong dung môi DMSO

33

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUA VA BIỆN LUẬN

Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả phổ '°C , nhóm carbonyl (C=O) ở

vị trí C10 bị khử thành nhóm methylen (Ar- CH;- Ar) nên trong phổ °C của emodin anthron xuất hiện mũi ở vùng 32.2ppm (Ar- CHạ- Ar) và chỉ có một mũi

C=O ở 191 ppm

* MÔ106748 ARTHRÔNE (DMS0-D6: 288K) #

i#ii

Hình 5: Phổ !°C NMR của emodin anthron trong dung môi DMSO

34

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

-Bước 2: tổng hợp hypericin

-Trong phổ 'H của hypericin về lý thuyết phải xuất hiện mũi ở vùng khoảng

18ppm tương ứng với các proton của -OH3 và -OH4 Thực tế, trên phổ không có

xuất hiện mũi ở vùng này Theo một số nghiên cứu trước đây mũi cộng hưởng

của hai proton -OH3 và -OH4 rất khó phát hiện Để chứng minh có sự hiện hữu của -OH3 và -OH4 chúng tôi sẽ làm sáng tỏ ở phần tổng hợp các dẫn xuất của hypericin

Hình 6: Phổ !H của hypericin trong dung môi DMSO

35

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KET QUA VA BIEN LUAN

A213 so 2 a 2 `

- Phố ˆC của hypericin tổng hợp có vị trí xuất hiện các mũi cộng hưởng phù hợp

với kết quả của các tác giả trước day [17]

40102163 HYPERICIN (0HS0-D6 290K)

IHÌ 1 ÑWf

T T

Hinh 7: Phé '3C NMR cia hypericin trong dung méi DMSO

36

LUẬN ÂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUÁ VÀ BIỆN LUẬN

4.1.3 KET QUA XAC BINH pKa CUA HYPERICIN:

Hypericin mang hai loai nhém -OH kiểu phenol khác nhau:

* Nhóm -OH ở vị trí 3,4 gọi là bay

* Nhóm -OH ở vị trí 1,6,8,12 goi 1a peri

Nên có thể xem hypericm như một acid nhị chức:

* Chức thứ nhất ứng với sự khử proton hóa -OH ở vị trí bay

* Chức thứ hai ứng với sự khử proton hóa -OH ở vị trí peri

-Kết quả khảo sát pK, của hypericin (phụ lục 14 đến phụ lục 24) được tóm tất trong bang 1

Bang 1: Độ hấp thu ở các bước sông đặc trưng trong phổ UV-VIS của hụpericin

khi thay đổi pH

Stt PH Độ hấp thu SA max (nm)

547 580 (Hyp) | 590 (Hyp)

Trong đó: - À mạ„= 580 nm là À mạ„ đặc trưng của dạng Hyp

“Â mạ„= 390 nm là À, mạ„ đặc trưng cia dang Hyp

Chúng tôi nhận thấy tại pH = 1.61 thì độ hấp thu ổ bước sóng À mạ„= 5§0 nm và

À mạ„= 590nm là tương đương nhau, lúc đó trong dụng dịch đồng thời tổn tại hai

đạng Hyp và Hyp có nông độ tương đương

LUẬN AN THAC ST KHOA HOC HOA HOC KET QUA VA BIEN LUAN

WAVELEN

BNGTH SCAN Phé UV-VIS cia Hypericin

pil = 1.61

\ : :

Hinh 8: Phé UV-VIS ctia dung dịch hypericin ở pH= 1.61

- Chọn bước sóng 547 nm để tính

«6 pH = 0.70 tương ứng với dung dịch chỉ chứa dạng Hyp; độ hấp thu ở bước séng A547 = 0.2999

*Ở pH =6.8I tương ứng với dung dịch chỉ chứa dạng Hyp; độ hấp thu ở

bước sóng Asq7 = 0.4726

Theo công thức tính:

A-Ay

= lg ——

pK, = pH + eA A

0.3904 - 0.2999

PK, = pH + lế 7 2-0.3904

38

LUẬN AN THAC ST KHOA HOC HOA HOC KET QUA VA BIEN LUAN

- Việc xác định pK,; của hypericin rất khó đo trong cấu trúc của hypericin có bốn nhóm -OH (1,3,6,8) ở vị trí peri có khả năng kiểm nối (hình 9) nên sự khử proton không có tính chọn lọc, có khả năng tạo cả bốn muối diphenolat đồng phân (hình 10) Qua kết quả đo phổ hấp thu cho thấy trong khoảng pH từ 12.6 -

13.2 có sự dịch chuyển từ đạng Hyp' (À„¿„ dic trung 12 590 nm) sang dang Hyp”

max Gc trung 14 610 nm)

Vậy giá trị pK,; có thể dự đoán nằm trong khoảng 12.6 - 13.2

Hình 9: Các H kiểm nối ở vị trí peri

tạo liên kết nội phân tử với C=O

Hình 10: Đồng phân muối diphenolat

của hypericin

39

LUAN AN THAG SI KHOA HOC HOA HOC KET QUA VA BIEN LUAN

4.2 TONG HOP CAC DAN XUAT CUA HYPERICIN VA KET QUA BO

pK, CUA CAC DAN XUAT:

Với mục đích khóa chọn lọc lần lượt các nhóm -OH ở vị trí bay trong phần tử hypericin Chúng tôi đã thực hiện phẩn ứng methyl hóa bằng các tác nhân

(CH;);SO,, CHạI Kết quả cho thấy phân ứng không có tính chọn lọc, thu được một hỗn hợp các sản phẩm methyl hóa Điều này có thể lý giải như sau

(CH:b;ŠSO¿ và CHạI là các tác nhân alkyl hóa rất mạnh, hơn nữa -CHạ có kích

thước bé nên tác kích vào các nhóm -OH dễ đàng và không chọn lọc

Sau đó, chúng tôi đã dùng bromur benzyl để khóa các nhóm -OH ở vị trí bay,

Kết quả cho thay phan ứng có tính chọn lọc rất cao, chỉ thu được 3-O-benzyl

hypericin hoặc 3,4-O-dibenzylhypericin (tùy thuộc vào tỷ lệ hypericin/ bromur benzyl ban đầu) Điều này có thể giải thích là do gốc benzyl có kích thước khá lớn, độ phần ứng cũng thấp nên chỉ tác kích vào các nhóm -OH có tính acid cao (-OH ở vị trí bay)

Kết quả chúng tôi đã tổng hợp được hai dẫn xuất: 3-O-benzylhypericin và 3,4-O- dibenzythypericin

4.2.1 ĐẪN XUẤT 3-O-BENZYLHYPERICIN:

4.2.1.1 Nhéa danh 3-O-benzylhypericin:

-Phổ 'H của dẫn xuất 3-O-benzylhypericin so sánh với phổ 'H của hypericin :

* Trong phổ proton của hypericin không có xuất hiện mũi ở vùng khoảng i8ppm

40

LUAN AN THAC SI KHOA HOC HOA HOC KET QUA VA BIEN LUAN

ứng với hai nhóm -OH vi trí bay; nhưng xuất hiện hai mũi đơn, vùng khoảng 14 -

13 ppm tương ứng với bốn nhóm -OH ở vị trí peri

* Trong phổ proton của dẫn xuất mono vẫn có bốn mũi đơn, vùng 12 - 14ppm tương ứng với bốn nhóm -OH ở vị trí peri, điều này chứng tỏ các nhóm -

OH vị trí peri không tham gia phắn ứng O-alky] hóa và hypericin tổng hợp ban đầu có bốn nhóm -OH vị trí peri Mặt khác, phổ proton của dẫn xuất 3-O

benzylhypericin xuất hiện thêm:

+ một mũi đơn, vùng 9.21ppm ứng với một nhóm -OH còn lại ở vị trí bay;

+ mũi đôi của đôi, vùng 5.33 - 5.59ppm ứng với proton của nhóm -O-CH;-Ph

Việc xuất hiện mũi đôi của đôi này là do hai proton của -CH; - không tương đương và ghép spin với nhau

3-0-benz ;l *hypertcin in CDCI

KH ĐH BE BỘ Hết tố KỆ NI TS Bề Hỗ E969 K1 mm By nna nae!

” “ i fy ” : ‹ 7 ?

-

Hình 11: Phổ !H của 3-O-benzylhypericin trong dung môi CDC];

41

LUẬN AN THẠC SI KHOA HỌC HÓA HỌC KET QUA VA BIEN LUAN

4.2.12 Két qué do pK, cia din xudt 3-O-benzylhypericin:

Phần tử 3-O-benzylhypericin cũng mang hai loại -OH kiểu phenol khác nhau:

- ! nhóm -OH bay ở vị trí 3,

- 4 nhóm -OH peri ở vị trí 1,6,8,13

Cũng có thể dự đoán rằng sự khử proton đầu tiên sẽ xây ra ở -OH bay vị trí 3, và

kế tiếp mới là sự khử proton ở các -OH peri,

Kết quả khảo sát pK; dẫn xuất 3-O-benzylhypericin (phụ lục 25 đến 32) được

tóm tắt trong bảng 2

Bảng 2: Độ hấp thu ở các buộc sóng đặc trưng trong phổ UV-VIS của dẫn xuất

3-O-benzylhypericin khi thay déi pH:

Stt pH Độ hấp thud 2 nx (nm)

540 580 (Hyp) | 610 (Hyp)

Trong đó: - À mạx= 5680 nm là Â max dang Hyp

- Â may = 610 nm là À max dang Hyp

Chúng tôi nhận thấy tại pH = 8.70 thì độ thu ở bước sóng  mạ„ = 560 nm Và ^ mạx

= 610 nm là tương đương nhau, tương ứng với dụng dịch đồng thời tổn tại hai dạng Hyp và Hyp có nồng độ tương đương

LUẬN ÁN THẠC ST KHOA HOC HOA HOC KET QUA VA BIEN LUAN

Phổ UV-VIS của 3-O-benzy]hypericin

pH= 8.70

TITLE: HEFD SCAN SPEEDS 668.8 nn⁄mỉn RESPONSES SLOU BANDPASS: 2 88nn

5 439.2 nm ñ.XX2A Rh« XÂÄI Á mm A 4100 abe

Hình 12: Phổ UV-VIS của dẫn xuất 3-O-benzylhypericin ở pH = 8.70

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KET QUA VA BIEN LUAN

Chon bước sóng 540 nm để tính:

- Ở pH =8.70 ; độ hấp thu ở bước sóng À sao= 0.2174

- Ở pH = 1.24 ; tương ứng với dung dịch chỉ chứa dạng Hyp, độ hấp thu ở bước

sóng A 549 = 0.2524

- Ở pH = 10.40; tương ứng với dung dịch chỉ chứa dạng Hyp, độ hấp thu ở bước sóng A 549 = 0.1851

Theo công thức tính:

A-

¡; H + Ig_——®#?®

a'l p BA _A

Hyp

pK

PKyy = 8.66

Tw gid tri pK,; = 8.66 x4c dinh được cho thấy việc dự đoán sự khử proton đầu

tiên xảy ra ở -OH số 3 là hợp lý (vì -OH peri thường có pK, >10) Kết quả này còn cho thấy rằng sau khi một nhóm -OH bay của hypericin bị khóa thì -OH ở vị

trí bay còn lại có tính chất của một -OH kiểu phenol bình thường (pK; z 8 -9)

- Tương tự như hypericin pKạ¿ của dẫn xuất 3-O-benzylhypericin xác định được trong khoảng 10.4 - 11.2

44

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUA VA BIEN LUAN

4.2.2 DAN XUAT 3,4-0-DIBENZYLHYPERICIN:

4.2.2.1 Nhận danh 3,4-O-dibenzylhypericin:

-Phổ ˆH của dẫn xuất 3,4-O-dibenzylhypericin so sánh với phổ 'H của hypericin

Hypericin Dẫn xuất 3,4-O-dibenzylhypericin Vị trí tương ứng

vùng 13- 14ppm vùng 13 - 14ppm

-mũi đôi của đôi, -hai nhóm-O-CH;-Ph ving 5.11 - 4.8lppm

eee

|

Hình 13a: Phổ !H của 3,4 -O-dibenzylhypericin trong dung méi CDCl,

45

LUẬN ÁN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Dibenzylhypericin 1n C0C13

r T + T + T T T r T 7 T —

= oo xà nm „ v 1 „ 1a mà ve “ nM or os vw

Hinh 13b: Phé 'H cta 3,4 -O-dibenzylhypericin trong dung môi CDC];

4.2.2.2 Kết quả đo pK„» của dẫn xuất 3,4-O- dibenzylhypericin:

Kết quả ở phụ lục 33 đến phụ lục 35

-Các nhóm -OH ở vị trí peri có khả năng kiểm nối nên phổ UV-VIS của dẫn

xuất 3,4-O-dibenzylhypericin hầu như không thay đổi trong khoảng pH từ 1.2-

11.2ppm tổn tại ở dạng Hyp (590nm) Khi tăng pH= 12.1 thì dẫn xuất chuyển

hoàn toàn sang dạng Hyp' (625nm) Do đó, có thể kết luận giá tri pK,» cia dan xuất 3,4-O- dibenzylhypericin trong khoảng từ 11.2 - 12.1

46