Thực nghiệm khảo sát hóa học cao eter dầu hỏa của cây sữa lớn

Thực nghiệm khảo sát hóa học cao eter dầu hỏa của cây sữa lớn

4.1 Nguyên liệu, hóa chất va thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 4.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là cây Có Sữa Lớn Lá thu hái ổ các bở

ruộng và vườn cây ăn trái của xã Mỹ Khánh, huyện Châu Thành, tỉnh Cần Thơ vào

tháng 12 Nhận danh cây, loại bỏ cây chết, đất, cát Phơi cây dưới ánh năng mặt trời

trong 3 ngày Sấy khô ở 40 -S0°C Để nguội, xay cây khô thành bột Sau khi xử lý,

30 kỉ cây tươi cho 3 kí bột cây khô

4.1.2 Hóa chất

Tỉnh chê các hóa chất sử dụng trong sắc ký trên cột alumin và sắc ký trên

bản mồng silicagel

a Eter dầu hỏa

Chưng cất phân đoạn xăng napta Hứng phân đoạn eter dầu hỏa ở 60-50°C,

LắẮc dung mỗi với HạSO, đậm đặc đến khi dung dịch acid không còn màu vàng Rửa dung môi với nước cất đến pH trung hỏa Lắc với KMnO¿ 10% đến khi dụng dịch

` KMnO, không đổi màu Rửa với nước cất; làm khan vdi Na,SO, Chung cat dung

môi, lấy phân đoạn sôi ở 60-80°C Làm khan với kim loại Na

b Benzen

Lắc benzen thương mại với H;SO¿ đậm đặc đến khi dung dịch acid không con màu vàng, Rữa dụng môi với nước cất đến pH = 7 Lâm khan với Na;SOu Lọc,

chưng cất phân đoạn và hứng phần dung môi ở §0”C Làm khan dung môi với kim

loại Na

c Cloroform

Lắc cloroform thương mại 3 lần với nước cất Chưng cất phân đoạn, lấy phân đoạn dung môi ỏ 60°C Lam khan vdi CaCl, khan

d Metanol

Chung cat metanol thuong mai vdi Mg, hung lấy phân đoạn ở 68°C

Trang 60

© Alumin trung tính

Rửa alumin với dung dịch HCI 2% trong nước ở §0°C, trong lgiỏ Rửa

alumin với nước cất dén pH = 7 Rila vdi alcol etil 95% Sdy khé 6 120°C trong 4

gid

4.1.3 Thiét bi

- Dung cu Soxhlet

Miẫu cây nghiên cứu được ly trich trong bé dung cu Soxhlet cd dụng tích là

10 lit

- Máy cô quay:

Cô cạn dung môi bằng máy cô quay BÚCHI RE-II1

- Cột sắc ký: các chất được tách chiết trên cột sắc ký alumin trung tính có kích thước 600 x 36mm

- Các thiết bị dùng để khảo sát cơ cấu là:

e Máy áo điểm nóng chảy BUCHI METTING POINT B-545

e Pho IR ghi bing may [R-470 va mdy BRUKER-IFS 48

® Khéi phé trén may LC/MS’ LCQ FIANIGAN MAT (USA)

ø Phổ 'H-NMR: ghi trên máy cộng hưởng tử hạt nhân BRUCKER-AC 200, tân số cộng hưởng 50 MHz

e Phổ 'ÍC-NMR: ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER-AC 200,

ian số cộng hưởng 200 MH¿

ø Phân tích nguyên tế thực hiện trên máy phân tích nguyên tế tự động

Trang 61

4.2 Phương pháp định tính và định lượng một số cấu tử hữu cơ

trong cây Có Sữa Lớn Lá

4.2.1 Điều ché cao eter dau héa, cao cloroform, cao aceton, cao alcol

etil va cao nước

Tan trich bét cay khé (200gam) vdi dung méi eter dau hda (60-80°C) (2lit} trong dung cu Soxhlet trong 62 gid Dé nguội; lọc; cô cạn dung môi cho cao eter đầu hỏa (6gam) Say phần bã cây khô, trích với cloroform (2lít) trong dụng cụ Soxhlet trong 36 giỏ Để nguội; lọc; cô cạn dung môi cho cao cloroform (4,28gam) Phần bã còn lại được sấy khô, tận trích bã với aceton (2lít) trong 48 giỏ trong dung

cu Soxhiet Để nguội; lọc; cô cạn dung môi cho cao aceton (5,9gam) Phần bã còn lại được trích với alcol eul 95% trong dụng cu Soxhlet trong 48 gid Để nguội; cô

cạn dụng môi cho cao alcol (9,16gam) Phân bã được tiếp tục trích với nước; cô cạn

dung méi 6 40°C cho cao nude (37,9gam)

Dùng các cao trên để định tính và định lượng các cấu tử hữu cơ

4.2.2 Dinh tinh va định lượng alcaloid

4.2.2.1, Định tính

Để định tính alealoid , sử dụng các thuốc thử sau đây:

+ Thuốc thủ Hager: dụng dịch acid picric bảo hòa với nước

+ Thuấc thủ Bouchardat:

Nước cất 10 mi

+ Thuốc thử Dragendorff

- Dung dich A:

Nước cất 40 ml

- Dung dịch B

Nước cất 20 mi

Trang 62

Trên 2 dung dịch A và B Khi sử dụng, lấy 20ml dung dịch hỗn hợp (A+B),

thêm vào CH;COOH (20ml) và nước cất (100ml)

+ Thuốc thử Bertrand

Acid silicotingstic § gam

+ Thuốc thử Mayer

Xác định sự hiện điện của alcaloid trong cây Có Sữa Lớn Lá bằng 2

phương pháp sau đây:

- Phương pháp 1:

Tận trích nguyên liệu (5gam) (bột cây khô, cao eter dẫu hỏa, cao

cloroform, cao aceton, cao alcol, cao nước) với dung dịch HCI 1% trong nước ở

80°C Loe; lay dịch lọc làm mẫu thủ

- Phương pháp 2:

Tận trích nguyên liệu (5gam)(bột cây khô, cao eter dầu hỏa cao cloroform, cao acefon, cao alcol, cao nước) với hỗn hop eter etil-CHCl,-alcol etil 95% - amoniac thep tỉ lệ 25:8:2,8:1 ở nhiệt độ phòng Khuay thường xuyên Lấy lúp hữu cơ; cô cạn dụng môi Hỏa tan căn trong HCI 1% trong nước ở nhiệt độ §0°C, khoảng

1 giỏ Lấy dịch lọc làm mẫu thủ,

Dinh tinh alcaloid theo cach sau day:

Lay 5 éng nghiém Cho vao mdi éng nghiệm mẫu thủ (2ml) và lần lượt

cho từng giọt các thuốc thủ trên, vào ống nghiệm

Kết quả: Mẫu thủ của bột cây khô, cao cloroform, cao aceton, cao alcol, trong 2 phương pháp thủ cho:

- trầm hiện màu nâu nhạt với thuốc thủ Hager

- trầm hiện màu đỏ với thuốc thủ Dragendorff,

- trầm hiện mảu vàng nâu với thuốc thử Bertrand

- trầm hiện màu nâu với thuốc thủ Miayer

Trang 63

4.2.2.2 Định lượng

Tận trích bột cây khô (100gam) với eter dầu hỏa trong dung cu Soxhlet trong 48 gid Sau đó phơi khô bã va tận trích bã vdi alcol metil trong 48 gid Dé nguôi; lọc Cô cạn dưng môi trong máy cô quay ở nhiệt độ 40°C thu được cao metanol Hoa tan cao vdi dung dich HCI 0,2 N (20ml) Trích dung dịch với hễn hợp eter etil - benzen 1:1 (theo thể tích) Thêm NH,OH 30% đến pH = 9 Trích dung dịch với cloroform Làm khan cloroform với Na;SO¿ Cô cạn dung môi thu được alcaloid thé (0,01 gam)

Trích dịch nước với acol „-butil Làm khan dung môi vdi Na,SO, Cé can dung môi cho alcaloid thô (0,19 gam)

Hiệu suất: bột cây khô chúa 0,2% alcaloid thô

4.2.3 Định tính và định lượng glicosid

4.2.3.1 Định tính

Tân trích nguyên liệu (100gam) (bột cây khô, cao eter dầu hỏa, cao cloroform, cao aceton, cao alcol, cao nước) với alcol etil 20% trong 24 giờ Lắc thưởng xuyên Lọc; chế hóa dịch lọc với dung dịch acetat chì trong nước đến khi không còn trầm hiện Lọc, thêm dung dịch Na;SO;¿ bão hỏa đến khi không còn trằm hiện Để yên 12 giờ Lọc, cô cạn dung dịch Hỏa tan phần cặn trong alcol etil 95%,

dung dịch này dùng làm mẫu thử

Để định tính glicosid, tiến hành pha các thuốc thử sau đây:

+ Thuốc thử Baljet

+ Thuốc thử Molish

Dung dịch thymol 2% 1 - 2giot

Định tính glicosid theo cách sau đây: lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống thứ nhất 2ml thuốc thử (làm đối chứng) Cho 2ml dịch mẫu thử vào ống thứ nhì, cho thuốc thử vào

Kết quả: Với mẫu của bột cây khô, cao cloroform, cao aceton, cao alcol, có

xuất hiện màu đỏ với thuốc thủ Baliet và cho màu tím hồng, chuyển sang màu đó carmin với thuốc thủ Molish

4.3.2.2 Định lượng

Tận trích bột cây khô (100 gam) với eter đầu hóa (60-80°C) trong dụng cụ Soxhlet trong 48 gid Say bã, trích bã với alcol etil 60% trong 30 giờ Để nghội; lọc;

cô cạn dung môi ở 40”C; thêm nude (100ml) Trích với CHƠI; (4 lần, mỗi lần với

S0ml CHCI;) Rửa dịch CHCH; với nước Làm khan dung môi với CaCl; Có cạn

dung môi Làm khô căn trong bình bút ẩm đến khi trọng lượng không đổi thu được

glicosid thé (0,17gam)

Bôt cây khô chứa 0,17% glicosid J 5

4.2.4, Dinh tinh va định lượng tanin

4.2.4.1 Dinh tink

Cân nguyên liệu (5gam) (bot cay khé, cao eter dau hdéa, cao aceton, cao cloroform, cao alcol, cao nudc) Thém nudc cất (100ml) Đun sôi trong L0 phút,

Lọc, lấy dich lọc dùng làm mẫu thd

- Lấy mẫu thủ (100 mi), thêm thuốc thủ Stiasny (5 mì); dun nóng Trâm hiện

màu đỏ cho biết sự hiện diện của tanin

- Lấy mẫu thử (10 ml), thém 4 giọt acetat chỉ Trầm hiện mâu vàng cho biết

sự hiện diện của tanin

- Lay mau thu (10 ml), thém dung dich gelatin man (0,5 ml) Tram hiện vô định bình màu vàng, để lâu biến thành nau cho biét sy hién dién cila tanin

- Lấy mẫu thử (10 ml), thém 2 giot FeCl, 1% trong nước Dung dịch chuyển

sang màu xanh ld cho biết sự hiện diện của tanin

Định tính tanin bằng thuốc thử sau đây:

- Thuốc thủ Stiasny

Formol 36% 20ml

HCI đậm đặc lÔmi

~ Dung dich gelatin mặn

Dung dich NaCl bao hoa 100ml

- Dung dich acetat Pb bdo hoa

- Dung dịch FeCl; 1% trong nước

Dinh tính tanin theo cách sau day: cho lần lượt vào các ống nghiệm các dịch mẫu thử (10ml) Thêm thuốc thử

Kết quả: Bột cây khô, cao aceton, cao alcol, cao nước cho:

e_ trầm hiện vô định hình màu đỏ khi đun nóng với thuốc thử Stiasny

e_ trầm hiện vàng nhạt khi thêm 4 giọt acetat Pb

e_ trầm hiện vô định hình khi thêm 0,S5ml dung dịch gelatin mặn

e Dung dịch chuyển sang màu xanh lơ khi thêm 2 giọt dung dịch FeCl,1% trong nước

4.2.4.2 Định lượng

Tận trích bột cây khô (10gam) với hỗn hợp aceton- nước 7:1 (theo thể

tích) Lọc; thu hồi aceton Trích dịch nước với eter etil, kế tiếp với acetat etil Tiếp tục trích dịch nước với z-butanol Cô cạn n-butanol trong may cô quay ở áp suất thấp Làm khan cặn trong bình hút ẩm đến khi trọng lượng không đổi thu được tanin thô (0,86gam) Tiếp tục cô cạn dịch acetat etil trong máy cô quay Cặn được làm

khan trong bình hút ẩm đến khi trọng lượng không đổi thu được tanin thô

(0,48 gam)

Tanin toàn phần: 1,34gam

Hiệu suất: 13,4% tính trên trọng lượng bột cây khô

4.2.5 Dinh tinh sterol va triterpen

Hỏa tan nguyên liệu (1 gam) (bột cây khô, cao eter dầu hỏa, cao cloroform,

cao aceton, cao alcol, cao nước) trong cloroform Lọc; dịch lọc dùng làm mẫu thử

Trang 66

4.2.5.1 Sterol

Dinh tính sterol bằng thuốc thử Liebermann-Burchard và Salkowski

« Thuốc thử Liebermann- Burchard

Anhidric acetic 20ml

H;SO, đậm đặc im

ø Thuốc thủ Salkowski

H;:SO¿ đậm đặc

Cách thử: cho mẫu thử (2ml) vào trong ống nghiệm; thêm thuốc thủ (2ml)

vào

tả

Kết quả: mẫu thử của bột cây khô, cao eter dầu hỏa, cao cloroform cho:

` + z “+ a * +

e màu xanh lục chuyển sang tím với thuốc thử Liebermann- Burchard

se dụng địch tách thanh 2 lớp, lốp H;SQ¿ có màu xanh và lấp cloroform có

màu đó với thuốc thử Salkowskl

4.2.5.2 Triferpen

Dinh tinh triterpen bing thuốc thủ Liebermann- Burchard, Salkowski va Noller

ø Thuốc thử Noiler:

SOCI, va thiéc

Cách thủ:

- Thuấc thử Liebermann - Burchard và Salkowski: cho mẫu thử (2ml) vào trong ống nghiệm, thêm thuốc thử

- Thuốc thử Noller: cho SOC]; (2ml) vào trong ống nghiệm Thêm 2 viên thiếc, khi dung dich hét sui bọt, thêm mẫu thử (2ml)

Kết quả: mẫu thủ của bột cay kbd, cao eter đầu hỏa, cao cloroform cho:

ø màu xanh lục chuyển sang tím với thuée thi Liebermann- Burchard

ø dung dịch tách thành 2 lớp: lớp H;SO, có màu xanh và lớp cloroform có

mau đó với thuốc thủ Salkowski

ø màu cam chuyển sang màu đó, tím với thuộc thứ Noller

Trang 67

4.2.6 Định tính saponin

Cho mẫu nguyên liệu (lgam) (bột cây khô, cao eter dẫu hỏa, cao

cloroform, cao aceton, cao alcol, cao nước) vào trong bình cầu (250ml) Thêm nước

cất (100ml) Đun sôi trong 30 phút Lọc; để nguội Thêm nước cất cho đủ 100ml Đây là dịch dùng làm mẫu thủ

Cách thử: lấy 10 ống nghiệm có kích thước l6 x 60 mm Cho vào các ống

nghiệm lẫn lượt 1,2,3 10ml địch mẫu thử Lắc theo chiều dọc của ống nghiệm

trong 15 giây (nỗi giây lắc 2 lần) Dể yên 15 phút Đo chiều cao các cột bột Tính

chỉ số bọt theo công thức:

Chỉ số bọt = 10—

C

d: chiều cao cột bọt, tính bằng cm

c: lượng nguyên liệu trung bình trong mỗi ống nghiệm, tính bằng gam

Kết quả: Các ống nghiệm của các mẫu thú có chí số bọt nhỏ hơn 100

4.2.7: Định tĩnh flavon

Cân nguyên liệu (100mg) (bột cây khô, cao eter dâu hỏa, cao cloroform,

+ 2 ˆ , A nt , v

cao aceton,cao alcol, cao nước) Thêm nước cât (100 ml) Dun soi 30 phút, Đề

nguội; lọc Dùng dich lọc làm mẫu thủ

Định tính ñavon bằng thuốc thd Shibata

- Thuốc thủ Shibata:

HCI đâm đặc

Bét Mg

Alcol isoamul

Cách thử: cho mẫu thử (2ml) vào 2 ống nghiệm, ông thủ nhất lam đối chúng

Trong ống thú nhì, thêm HCI đậm đặc (5ml), bột Mg Thêm alcol isoamil doc theo thành ống nghiệm Dun nhe

Kết quả: Mẫu thử của bột cây khô, cao cloroform, khi đun nhẹ có một vòng

` ` a, vs a ` 32 ký

màu hồng từ từ xuất hiện, chuyển sang máu do tìm

Trang 68

4.3 Phương pháp tách chiết và cô lập alcol béo, sterol, triterpen

tử cây Có Sửa Lớn Lá

4.3.1 Ly trích bột cây khê với eter đầu hổa (60 - 80°C)

Tân trích bột cây khô (3 kí) với eter dầu hỏa (60 - 80°C) trong dụng cụ Soxhlet, khoảng 72 giỏ ĐỂ nguội dung môi; lọc Cô cạn dung môi trong máy cô

quay ở nhiệt độ 40°C Làm khan phần cô cạn trong bình hút ẩm đến khi trọng lượng không đối cho cao eter đầu hỏa (88,9 gam)

4.3.2 Phương pháp sắc ký trên cột alumin trung tính thực hiện trên cao

eter dầu hóa

Đừng cột có kích thước:

- bản kính : 36 mm

- chiều đài : 600 mm

Chất hấp phụ là alumin hoạt hóa (400 gam)

Dung môi giải ly là eter dầu hỏa, benzen, cloroform đã xử lý để dùng cho sắc

ký cột

Hòa tan cao eter dầu hỏa (16 gam) trong dung môi eier dầu hóa (60-80°C)

(50 ml) Để eter dầu hỏa vào cột, Cho tử tử alumin vào Cho vào đâu cột dung dịch cao eter dầu hóa Hứng từng phân đoạn 100 ml Lân lượt cho vào cột dụng môi giải ly:

Eter dầu hỏa (60-80”C) 6.800 ml

Eter du héa-benzen9:1 — 1.006 mi

Eter dầu hóa - benzen §;Í — 2.100 mi

Eter đầu hỏa - benzen 3:1 — 1.600 mi

Eter dầu hỏa - benZzen 1:1 800 mi

Eter đầu hỏa - benzen l:3 1.100 ml

Benzen - cloroform 9:Ì 2.500 mi

Benzen- cloroform 5:1 1.200 ml

Benzen- cloroform 3:1 800 ml

Benzen- cloroform 1:1 1.100 mi