Nghiên cứu khảo sát hóa học cao eter dầu hỏa của cây sữa lớn

Nghiên cứu khảo sát hóa học cao eter dầu hỏa của cây sữa lớn

3.1 Xác định sơ bộ một số cấu tử hữu cơ trong cây Có Sữa Lớn

Lá

3.1.1 Xử lý mẫu cây

Chúng tôi thu hái cây Có Sữa Lớn Lá mọc hoang ở các bở ruộng, vườn cây

ăn trái của tỉnh Cần Tha, vào tháng 12 Phơi cây tươi dưới ánh nắng mặt trời và sau

đó sấy cây ở 50°C đến khi trọng lượng cây không thay đổi Nghiễn cây khô thanh

bột, đây là mẫu nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

Sau đây là trọng lượng của bột cây khô tương ứng với trọng lượng cây tươi

thu hai (bang 1)

Bảng 1: Trọng lượng bột cây khô tương úng với mẫu cây tươi

3.1.2, Điều chế nguyên liệu

Để xác định sự hiện diện của một số cấu tử hữu cơ trong cây Có Sữa Lớn Lá

nhu sterol, triterpen, flavon, tanin, giicosid, alcaloid, saponim, chúng tôi tiến bảnh

một số phản ứng có màu hoặc phần ứng cho trầm hiện của các cấu tử trên với các thuốc thủ đặc trưng Sau khi có phần úng dương tính, tiến hành xác định định lượng

So dé 1: Điều chế bột cây khô, cao eter dầu hỏa, cặn cloroform, căn aceton, căn

alcol và căn nước của cây Cỏ Sữa Lớn Lá

Mẫu cây tươi

- Phơi dưới ánh nắng mặt trởi

- Say Ô 50°C đến khi trọng lượng không đổi

- Nghiên thành bột Bật cây khâ | (200 gam)

- Tận trích với eter dầu hóa (60-80°C)

trong dung cy Soxhlet

- Tận trích với etanol 95% Cô cạn ở 4ữC

- Loc | Cặn aceton | (5,9 gam)

VA

- Tan trich vdi nudc Có cạn ô 40C

- Loc Cin alcol | (9,16 gam)

Bảng 6: Kết quả định tính triterpen trên bột cây khô và các cao khác nhau của cây

Có Sữa Lớn Lá

Sự hiện diện của tanin được xác định bởi phản ứng có màu và phản ứng tram

hiện như: thuốc thử Stiasny, dung dịch gelatin mặn, dung dịch acetat chì bảo hỏa,

‘dung dich FeCl; 1% trong nước (bảng 7)

Bảng 7: Kết quả định tính tanin trên bột cây khô và các cao khác của cây Cổ Sữa

3.1.5.2 Bink higng [26]

Định lượng tanin theo phương pháp Takashi Yoshida (sơ đổ 2)

Sơ để 2: Định lượng tanin theo Takashi Yoshida

a-butanol bdo hoa

- Có cạn, lam khan đến khi

sử

[Dick n-butanol | | Căn không tan |

- Thu hồi dụng mỗi ở 40%C

Để định tính alcaloid, dùng các thuốc thử đặc trưng sau đây:

- Thuốc thử Hager: cho trầm hiện nâu

- Thuốc thử Dragendorff: cho trầm hiện đỏ

- Thuốc thử Bertrand: cho trầm hiện vàng nâu

- Thuốc thử Mayer: cho trầm hiện nâu

Định tính alcaloid trong cây Có Sữa Lớn Lá bằng 2 phương pháp sau đây:

a Phương pháp 1: phương pháp Harold St John

Biến đối alcaloid ở dạng tự do trong cây thành muối alcaloid bởi dung dịch acid loãng Các muối trên cho phản ứng màu với những thuốc thử đặc trưng của alcaloid

b Phương pháp 2

Dùng phương pháp này để xác định sự hiện điện của alcaloid ở dạng kết hợp

với acid vô cơ hoặc hữu cơ Alcaloid sau khi được phóng thích bởi baz mạnh như

NH,OH, dược hỏa tan trong dụng môi hữu cơ thích ứng (dung dịch Prolius) Sau đó thực hiện như phương pháp ! (bảng 9),

Băng 9: Kết quả định tính alcaloid trên bột cây khô và các cao khác nhau của cây

Có Sửa Lon La

nguyên liệu pháp Hager | Bertrand | Dragendorff Mayer

Kết luận: Với 2 phương pháp thủ, bột cây khô, căn cloroform, cặn aceton va

cặn alcol chứa alcaloid 6 dang ni do

3.1.7.2 Định higng

Alcaloid được định lượng theo phương pháp STASS - OTTO (sa dé 3)

Sơ đã 3: Định lượng alcaloid trong bột cây khô theo phương pháp STASS - OTTO

| Bột cây khô | (100g)

- Để yên 48 giờ

- Ngâm trone hỗn hợp eter etil-cloroform (3:1) trong 24 giờ

- học

Địch trích

Tân trịch uới H,SO, 3%

~ Rita oới nước it nhdt 3 lan

- Lam khan boi NaySOy

3.1.8 Glicosid

3.1.8.1 Dink tink

Dé xc dinh su hién dién ctia glicosid, chting t6i ding phuong pháp SOOS

(sơ đổ 4) Dùng dịch alcol sau cùng để trắc nghiệm với thuấc thủ Baljet và thuốc

thủ Molish (bang 10)

Sơ đề 4: Định tính glicosid trên bột cây khô, cao eter dầu hóa, căn cloroform, căn

aceton, căn alcol và căn nước của cây Có Sữa Lén Lá

Bảng 10: Kết quả định tính glicosid trên bột cây khô và các cao khác nhau của cây

Căn cloroform Căn aceton + + + +

Kết luận: Bột cây khô, cặn cloroform, cặn aceton vả cặn alcol chứa glicosid

3.1.8.2 Định lượng

Định lượng glicosid theo so dé 5

Sơ đề 5: Định lượng glicosid trong bột cây khô

Bật cây khê | (700 gam)

Tận trích với eler dâu hỏa (60 -8ØC)

trong dung cu Soxhlet

- Sdy khô

- Tan trich voi alcol etil 60%

trong dung cu Soxhlet

- Loc

[ Ba cay } [ Dich trich alcolÌ

- Rửa với nước

- Làm khan với CaCÌ›

- Cô cạn dung môi

Glicosid thé | (0,017 gam) Hiệu suất: 0,017% tính trên trọng lượng cây khô

c: lượng bột khô trung bình trong mỗi ống nghiệm, tính bằng gam

Kết quả: Các mẫu nguyên liệu đều có chỉ số bọt dưới 100, không có saponin trong cây Có Sữa Lớn Lá

- Cao eter dầu hỏa chứa sterol va triterpen

- Căn cloroform chứa sterol, triterpen, flavon, alcaloid và glicosid

- Căn aceton chứa alcaloid, glicosid và tanin

- Căn alcol chứa alcaloid, glicosid và tanin

- Can nước chứa tanin

Hàm lượng của tan là: 1,34% tính trên trọng lượng cây khô

Hàm lượng của alcaloid là: 0,02% tính trên trọng lượng cây khô

Hàm lượng của glicosid là: 0,017% tính trên trọng lượng cây khô (bảng 11)

Bảng 11: Tóm tắt kết quả xác định các cấu tử hữu cơ trong bột cây khô, cao eter

dầu hỏa, cặn cloroform, cặn aceton, cặn alcol, cặn nước của cây Cỏ Sữa

3.2 Khảo sát hóa học phần chiết xuất cây Có Sữa Lớn Lá bởi

eter dau héa (60 - 80°C)

Đại cương

Sự khảo sát sơ bộ về thánh phân hóa học của cao eter đầu hóa của cây Có Sữa Lớn Lá cho biết là cao này chứa sterol và triterpen qua trắc nghiệm dương tính

với thuốc thử Laebermamn - Burchard, Salkowski va Noller

Các tác giả Ấn Độ D R GUPTA, S K GARD [18] da ly trich va c6 lập từ cao eter dau hỏa và cao alcoi của cây Có Sữa Lớn Lá trồng tại Bengale (Ấn Độ) một

số cấu tử như aleol béo |-triacontanol, ba triterpen taraxerol, friedelin, B-amurin và

một sterol B-sitosterol

Chúng tôi thủ nghiệm tách chiết các chất trên từ cây Có Sữa Lớn Lá, dùng

dung mới eter dâu hỏa (60 - 80°C) Để tách chiết vá cô lập alcol béo, triterpen và sterol, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký trên cột alumin trung tính, dùng dụng

môi giải ly là: eter dầu hóa (60 - §0°C), benzen, cloroform và các hỗn hợp của

chúng Để theo đối quá trình sắc ký trên cột alumin, các hợp chất alcol béo, sterol, triterpen tách ra tử những phân đoạn dung môi giải ly khác nhau, được phát hiện

dich KMnO, 1% trong nước

Kết quả của sắc ký trên cột alumin cho 4 phân đoạn như sau:

s Phân đoạn A: dung ly bởi eter dau hda, cho trắc nghiệm âm tính với thuốc thử sterol và triterpen, dương tính với KMnO¿ 1% trong nước và cho Ì vết duy nhất trên sắc ký bản mồng sHicagel, Rf = 0,35 (dung ly là benzen -

cloroform 4:1, thuốc thử làm hiện vết là KMnO, 1% trong nước)

e Phan doan B: dung ly bdi eter dau hoa - CsH, 5:1 va eter dau hda - CoH, 3:1, cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuốc thử Liebermamn - Burchard, Salkowski và Noller đặc trưng của trerpen, cho một vết màu xanh,

Trang 24

Rf = 0,35 trên bản mỏng silicagel (dung ly là CHCI;, thuốc thử làm hiện

vết là acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%)

e Phân đoạn C: dung ly bởi CạH¿, cho trắc nghiệm dương tính với thuốc thử

triterpen (Liebermann - Burchard, Salkowski và Noller), cho 1 vết màu

xanh, Rf = 0,30 trên bản mỏng silicagel (dung ly là cloroform, thuốc thử

làm hiệu vết là acid phosphomolbdic 10% trong EtOH 95%)

e Phân đoạn D: dung ly bởi benzen - cloroform 9:] và 5:1, cho trắc nghiệm

dương tính với thuốc thử Liebermamn - Burchard và Salkowski đặc trưng

của sterol, và cho 1 vết Rf = 0,20 với thuốc thử acid phosphomolbdic 10% trong EtOH 95%)

Các phân đoạn trên, sau khi cô cạn dung môi, được kết tỉnh trong metanol

cho 4 sản phẩm E¡, E›, Ea và Ea

E,: tan trong eter dau hda, benzen, eter etil, rất ít tan trong alcol lạnh, tan hơn trong alcol nóng và không tan trong nước Sắc ký trên bản

mỏng silicagel, triển khai bởi benzen - cloroform 4:1 cho l vết trỏn,

Rf= 0,35 vói KMnO, 1% trong nước

: tan trong clorofØrm, eter etil Sắc ký trên bản mỏng silicagel, triển

khai bởi cloroform, cho ] vết Rf = 0,35 với acid phosphomolibdic

10% trong EtOH 95%

: tan trong cloroform, eter etil, it tan trong alcol lạnh, tan hơn trong aleol nóng Sắc ký trên bản mỏng silicagel, triển khai bởi cloroform cho l vết xanh đậm, Rf = 0,30 với dung dịch acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%

3.2.1 Xử lý mẫu cây nghiên cứu

Mẫu cây, sau khi thu hái (sử dụng toản thân cây, lá, rễ, bông), được phơi dưới ánh nắng mặt trời và sấy khô ở 40 - 50°C đến khi trọng lượng không thay đổi

Nghiễn cây thành bột khô, đây là mẫu nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

3.2.2 Điều ché cao eter dau héa

Tận trích mẫu cây khô (3 kí) với eter dầu hỏa (60 - 80°C) trong dụng cụ Soxhlet, khoảng 72 giờ Để nguội dung môi; lọc Cô cạn dung môi trong máy cô quay cho cao eter dau hda (so dé 6)

Sơ đề 6: Điều chế cao eter dầu hỏa của cây Cổ Sữa Lớn Lá

Mẫu cây tươi | (30 ki)

- Phơi dưới ánh nắng mặt trởi

- Sâu ở 40-5ŒC đến khi trọng lượng không đối

Bã cây Ì Dung môi Ì

- Cô cạn 640°C

- Làm khô trong bình hút âm chân không

Cao eter dầu hỏa | (88,90 gam)

Hiệu suất 2,9% tính trên trọng lượng cây khô

Bang 12 sau day cho biết các chỉ số đặc trưng trong phương pháp trích ly cây

Có Sữa Lớn Lá với eter dầu hỏa (60 - 80°C)

Bảng 12: Trị số đặc trưng trong phương pháp trích ly cây Cỏ Sữa Lớn Lá với eter

dầu hỏa (60 - 80°C)

Mẫu cây | Mẫu cây Dung môi trích lY.| Thời gian Hàm lượng cao

tươi, kí khô, kí eter dau hoa trich, gi | eter đầu hỏa, gam

(60-80°C), lit

3.2.3 Tach chiét va cé lap hop chat alcol béo E,, 2 triterpen E¿, E¿ và

sterol E, tw cao eter dau héa của cây Có Sửa Lớn Lá

Sự tách chiết và cô lập các cấu tử hóa học trong cao eter dầu hỏa của cây Cỏ

Sữa Lớn Lá được thực hiện bởi phương pháp sắc ký trên cột alumin trung tính, dùng các dung môi giải ly là eter dầu hỏa (60-80”C), benzen, cloroform và các hỗn hợp

- của chúng Các dung môi được hứng dưới cột sắc ký với từng phân đoạn 100 ml va được cô cạn Theo dối tiến trình sắc ký trên cột alumin bởi trắc nghiệm có màu của

sterol (thuốc thử Liebermamn - Burchard và Salkowski), của triterpen (thuốc thử

Liebermamn - Burchard, Salkowski và Noller) của alcol béo (dung dịch KMnO¿ 1%

trong nước) và sắc ký trên bản mỏng silicagel, hệ dung môi giải ly là benzen - cloroform 4:1 (theo thể tích) và cloroform, thuốc thử làm hiện vết trên bản mỏng là KMnO/ 1% trong nước và acid phosphomolibdic 10% trong alcol etil 95% Kết quả

của tiến trình sắc ký trên cột alumin trung tính được tóm tắt trong bảng 13

Trang 27

Theo kết quả sắc ký trên cột alumin trung tính thực hiện trên cao eter đầu hỏa

của cây Có Sữa Lớn Lá:

+ Phân đoạn 1-60, giải ly với eter dầu hỏa (60-80°C) (6000 ml), cho Ì vết có

Rf = 0,35 với sắc ký trên bản móng silicagel (dung ly là C,H,-CHCI 4:1, thuốc thủ làm hiện vất trên bản mỏng là KMnO, 1% trong HạO)

+ Phân đoạn 79 - 99, giải ly với eter dầu hỏa - benzen 5:1 (2100 mil) va phân đoạn 100 - 115, giải ly với eter dầu hda - benzen 3:1 (1600 ml), cho 1 vết có

Rf = 0,35 với sắc ký trên bản mỏng silicagel (dung ly là CHCHh, thuốc thủ làm hiện vết trên bản mỏng là acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%)

+ Phân đoạn 135-156, giải ly với benzen (2200 ml), cho l vết có Rf= 0,30 với sắc ký trên bản mỏög silicagel (dung ly là CHƠI;, thuốc thủ làm hiện vết trên ban móng là acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%)

+ Phân đoạn 164-188, giải ly với benzen - cloroform 9:1 (2500 ml) và phân đoạn 189-200, giải ly với benzen - cloroform $:1 (1200 mJ), cho 1 vết có Rf = 0,20 với thuốc thử acid phosphomolibdic, 10% trong EtOH 95%

Cô cạn dụng môi giải ly của phân đoạn I-ó0 cho chất vàng nhạt (4,15 gam),

_ kết tỉnh trong MeOH dudi dang tinh thé trắng E¡, nóng chảy ỏ 84-85°C Sản phẩm

E, cho phan ving 4m tinh vdi thudée thi Liebermann - Burchard, Salkowski, Noller

và dương tính với KMnOx¿ 1% trong HạO

Cô cạn dung môi giải ly của phân đoạn 79-99 và 100-115 cho chất rắn trắng (0,45 gam), két tinh trong MeOH dưới dang tinh thể hình kim trắng E¿, nóng chảy ỏ

282°C E; cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuéc thi Liebermann - Burchard, Salkowski va Noller d&c truing cua triterpen

Cô cạn dung môi giải ly của phân đoạn 135-156 cho chất rắn trắng (0,53

gam), kết tỉnh trong MeOH dưới dạng tính thể trắng E¿, nóng chay 6 90 - 91°C San

phẩm E; cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuốc thủ Liebermann - Burchard,

Salkowski và Noller đặc trưng của triterpen

Cô cạn dung môi giải ly của 2 phân đoạn 164-188 và 189-200 cho chất rắn

trắng (0,45 gam), két tinh trong MeOH dưới dạng vấy trắng E¿, nóng chảy ở 138 -

139°C E, cho trắc nghiệm dương tính với 2 thuốc thử Liebermann - Burcbard và Salkowski đặc trưng của sterolL

Trang 29

Bang 14: Vai đặc trưng của 4 sản phẩm E¡, E;, E;, E, c6 lap tit cao eter dau hỏa của

đoạn Dung môi lượng | lượng của | Điểm silicagel

cột cặn | khi kết tỉnh | chay, °C | CHeCHCh thude thd: acid

alumin tha trong 4:1 thuốc | nhosphomalibdic

được, ! metanol, thủ: KMaO, 10% trong

1-60 Eter đầu hỏa 6000 | 4,15 2,26 85-86 | Rf=0,35

79-99 | Eter dầu hỏa - benzen | 0,35 0,10 282 Rf = 0,35

5:1, 2100

100-115 | Eter dâu hỏa - benzen | 0,10 0,05 282 Rf = 6,35

135-156 Benzen, 2200 0,53 0,16 91 Rf = 0,30 164-188) Benzen-cloroform 0,30 0,20 138-139 Rf=0,20

3.2.4 Khảo sát cơ cầu của 4 hợp chất cô lập Eụ, Ea, E¿ và E„

3.2.4.1 Khảo sát cơ cầu của E¿

Sau khi chiết xuất và cô lập sản phẩm E¡ từ cao eter dâu hỏa của bột cây khô bằng sắc ký trên cột alumin trung tính, dung môi giải ly là eter dầu hỏa, cô

cạn dung môi cho chất sáp, kết tính trong metanol dưới dạng tỉnh thể trắng E¡ E¿ cho trắc nghiệm âm tính với thuốc thử sterol và triterpen, đương tính với dung dịch KMnO, 1% Tiến hành khảo sát cơ cấu của E¡, dùng các phương pháp sau đây

© Phổ ỨC -NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT

+ Điều chế dẫn xuất acetat cilia E,

Dung môi giải ly là C¿Hạ¿-CHC]; 4:1 (theo thể tích)

Làm hiện vết trên bản mỏng với dung dịch KMnO¿ 1% trong nước

Một vết hiện trên bản mong, Rf = 0,35 (hình 3)

c) Phan tich C, H (xem phu luc sé 1, trang 75)

Phân tích C, H trên sản phẩm E¡ cho kết quả như sau:

Cc 82,58%

H 14,37%

d) Phương pháp phể nghiệm

+ Phẩ khi lượng (xem phụ lục số 2-3, trang 76-77)

ưa = 438 (MỸ); 420 (MỸ -HạO); 392 (MỸ -HạO-C;H,)

+ Phô hồng ngoại (xem phụ lục số4, trang 7§)

Phố H-NMR của sản phẩm E¡ có các mỗi cộng hưởng đặc trưng biơng ứng

với các loại proton như sau (bằng 15)

2H(-CH;CH;OH) 2H (-CH;-OH)

+ Phé C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT (xem phụ lục số 6-7, trang 80-81)

Phổ !°C-NMR kết hợp vái phổ DEPT có các mũi cộng hướng tương ứng với

loai carbon nhu sau (bang 16)

Trang 32

ở 3300 cm` Để chúng mính thêm sự biện điện của nhóm hidroxi, thực hiện phân

ứng acetil hóa E,, ding anhidrid acetic va piridin

Acetat của E¡ kết tinh trong metanol dudi dang tinh thé tring, ndng chdy 6

7°

Phổ hồng ngoại của acetat có các mũi đặc trưng sau đây (xem phụ lục sế 8, trang 82)

i 1730: -C-O ester V„„„.Cn

1238 : -O-Ac ester phé 'H-NMR cia acetat (xem phụ lục số 9, trang 83) cho thấy có sự xuất hiện thêm của proton -OCOCH; 6 6 = 2,04 ppm va proton -CH,-OAc 6 6 = 4,05 ppm (bang 17)

Trang 33

Bằng 17: Phổ 'H-NMR của acetat của E,

5, ppm Loai proton 0,88 (4) -CH;

tương ủng của ]-triacontanol [32] Phổ "C-NMR va DEPT của Eạ chứng mình thêm

cơ cầu của E,

Cuối cùng, acetat của E, có điểm nóng chảy và phổ hổng ngoại tương

tự như acetat của Ì-triacontanol

- Đại cương về triacontanol:

CH, (CH g-CH, OH

l-Triacontanol là một alcol nhất cấp day thẳng bdo hòa,

CH;(CH;);;CHạOH, được cô lập lần đầu tiên tử có Linh Lăng (alfalfa), Medicago

saiua L {33] Người ta thưởng tìm thấy nó trong lớp sáp của tế bảo thực vật, sáp

ong, lúa mì, gạo [34] 1-Triacontanol là một chất điều hỏa tăng trưởng thực vật, được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều ở Mỹ [35] [36] [37], có khả năng kích thích tăng trưởng trên tế bao của cây thuốc lá, cà tô-mách, khoai tây, đậu [38]

1-Triacontanol náng chảy 4 86°C, không tan trong nước, tan nhiều trong eter

dầu hỏa, benzen, cloroform, alcol nóng, ít tan trong aleol lạnh

E, được nhận danh là I-triacontanol dựa trên các kết quả sau đây:

- Điểm nóng chây:

E¡ nóng chảy 6 85-86°C (MeOH)

Theo tài liệu tham khảo [32], I-triacontanol néng chay 6 86-87°C (MeOH)

- Phân tích C, H:

Thí nghiệm C 82,58% H 1437%

(tương ứng với M = 438) C;oH;¿O là công thức nguyên của l-triacontanol

Phé ‘H-NMR Phé ‘H-NMR Vị trí của proton trên cơ cấu của

0,88 (t) 0,89 (t) 3H (-CH:) của C-30

1,25 (bs) 1,26 (bs) 2H (-CH;-) của carbon từ C-3 đến C-29 1,55 (m) 1,56 (m) 2H (-CH;-CH;OHN) của C-2

3,60 (t) 3,62 (t) 2H (-CH;-OH) của C-I

- Phể ”C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT:

Tài liệu tham khảo không đẻ cập đến số liệu về phổ 'ÍC-NMR và DEPT

của l-triacontanol

Kết quả của phổ '”C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT của E; chứng

minh thêm chất này là l-triacontanol Các mũi cộng hưởng của 2 phổ trên tương