Thực nghiệm khảo sát thành phần hóa học cây đại bi

Thực nghiệm khảo sát thành phần hóa học cây đại bi

3 THỰC NGHIỆM

3.1 Điều kiện thực nghiệm

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại bi được thực hiện với các

điều kiện sau:

¾ Nguyên liệu:

Toàn cây đại bi thu hái tại Đà Lạt (Lâm Đồng) vào tháng 12 năm 2006, được

ThS Nguyễn Duy Chính, bộ môn Tài nguyên và Môi trường, đại học Đà Lạt nhận

danh Xay toàn cây thành mảnh nhỏ dùng để làm mẫu nguyên liệu cho nghiên cứu

¾ Sắc ký cột:

Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60F254)

Silica gel pha đảo (RP silica gel) (Cosmisil 75 C18 - OPN), Nacalai Tesque

Inc., Kyoto)

¾ Sắc ký lớp mỏng:

Silica gel pha thường (Merck, Kielselgel 60 F254, dày 0,25 hay 0,50 mm)

Silica gel pha đảo RP18 (Whatman, KC18F, dày 0,25 hay 0,50 mm)

¾ Thuốc thử:

Dung dịch Ce(SO4)2 trong H2SO4 10%

¾ Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Máy Bruker Avance 500 [500 MHz (1H) và 125 MHz (13C)]

Máy Jeol JNM - LA 400 [400 MHz (1H) và 100 MHz (13C)]

¾ Đèn UV:

Produkte fur die Biotechnololie, bước sóng 254-365 nm

¾ Dung môi sử dụng:

Hexan (Trung Quốc, Labscan)

Metanol (Trung Quốc, Labscan)

Cloroform (Trung Quốc, Labscan)

Acetonitril (Merck)

Etyl acetat (Trung Quốc)

Nước cất

H3PO4 (Trung Quốc)

NaOH (Trung Quốc)

Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc)

NaH2PO4.2H2O (Trung Quốc)

Etanol (99,7%) (Trung Quốc)

HCl (Trung Quốc)

Bovine milk xanthine oxidase (Sigma)

Xanthine (Kanto chemical Co INC)

Allopurinol (Sigma)

3.2 Ly trích cao thô

Cây đại bi xay nhỏ được chia làm nhiều phần và được trích nóng với metanol

bằng phương pháp đun hoàn lưu Mỗi lần trích khoảng 250 gam với 1,5 lít metanol,

đun hoàn lưu trong ba giờ Mỗi phần trích 3 lần Toàn bộ dịch trích thu được đem

cô quay áp suất kém, thu được cao metanol thô

Cao metanol thô cho phân tán trong nước cất và lần lượt chiết với các dung

môi hexan, cloroform, etyl acetat thu được các cao tương ứng: cao hexan, cao

CHCl3, cao EtOAc và cao H2O

Quy trình ly trích các cao được trình bày trong sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1 - Quy trình ly trích các cao từ cây đại bi

Cây đại bi

(2,0 kg)

Cao MeOH

(180 g)

- Trích nóng với MeOH

- Lọc

- Thu hồi dung môi

- Hòa tan với nước

- Trích với hexan

Thu hồi dung môi

Cao hexan

(57,6 g)

Dịch CHCl 3

Thu hồi dung môi

Cao CHCl 3

(68,4 g)

Dịch nước

Trích với EtOAc

(15,3 g)

Thu hồi dung môi

Cao EtOAc

(32,4 g) Trích với CHCl3

3.3 Quá trình cô lập

Trong luận văn này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao

CHCl3 và EtOAc được trích từ cây đại bi

Thực hiện sắc ký cột cao CHCl3 (57,6 g) trên silica gel với hệ giải ly

cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%,

20%) dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO4)2 đun nóng, chúng

tôi gom thành 4 phân đoạn (F1-F4)

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F2 (9,1 g) với hệ dung ly

cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH), dựa trên sắc ký lớp

mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO4)2 đun nóng thu được sáu phân đoạn

(F2.1-F2.6) Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F2.3 (2,5 g) với hệ dung ly

cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH) thu được 5 phân

đoạn (F23.1-F23.5) Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn F23.2

(354 mg) và F23.3 (612 mg) với hệ dung ly acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu

được hợp chất (1) và (2) (sơ đồ 3.2)

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3 (11,2 g) với hệ dung ly

cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-15% MeOH), dựa trên sắc ký lớp

mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO4)2 thu được năm phân đoạn (F3.1-F3.5) Sắc

ký cột hấp phụ trên silica gel pha đảo phân đoạn F3.2 (1,2 g) với hệ dung ly

acetonitril : metanol : nước (1:1:4), thu được hợp chất (4) (sơ đồ 3.3)

Sơ đồ 3.2 - Quy trình cô lập hợp chất (1) và (2) từ cao CHCl3.

F23.2

(354 mg)

F2

(9,1 g)

F2.3

(2,5 g)

SKC trên silica gel CHCl3-MeOH (0-15%), thu được 6 phân đoạn (F2.1-F2.6)

SKC trên silica gel CHCl3-MeOH (0-10%), thu được 5 phân đoạn (F23.1-F23.5)

SKC pha đảo hệ dung môi

CH3CN:MeOH:H2O (1:1:4)

Hợp chất (1)

(6,7 mg)

F23.3

(612 mg)

SKC pha đảo, hệ dung môi

CH3CN:MeOH:H2O (1:1:4)

Hợp chất (2)

(8,3 mg)

Sơ đồ 3.3 - Quy trình cô lập hợp chất (4 ) từ cao CHCl 3

Thực hiện sắc ký cột cao EtOAc (32,4 g) trên silica gel với hệ giải ly

cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%,

20%) dựa trên sắc ký lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO4)2, chúng tôi gom

thành 7 phân đoạn (F1-F7)

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3 (4,6 g) với hệ dung ly

cloroform : metanol có độ phân cực tăng dần (0%-20% MeOH), dựa trên sắc ký lớp

mỏng hiện màu bằng dung dịch Ce(SO4)2 thu được bốn phân đoạn (F3.1-F3.4) Sắc

ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3.2 (2,3 g) với hệ dung ly acetonitril :

metanol : nước (1:1:4), thu được hai hợp chất (6) và hợp chất (7) (sơ đồ 3.4) Sắc ký

cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F3.4 (820 mg) với hệ dung ly acetonitril :

metanol : nước (1:1:4), thu được hợp chất (3) (sơ đồ 3.4)

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn F4 (3,5 g) với hệ dung ly

F3

(11,2 g)

F3.2

(1,2 g)

Hợp chất (4) (9,2 mg)

SKC, hệ CHCl3: MeOH (0-15%) thu được 5 phân đoạn (F3.1-F3.5)

SKC pha đảo hệ dung môi

CH3CN:MeOH:H2O (1:1:4)

Sơ đồ 3.4 - Quy trình cô lập hợp chất (3), (6), (7) từ cao EtOAc

Hợp chất (6)

(14,6 mg)

F3.4

(820 mg)

F3.2

(2,3 g)

SKC, CH3CN:MeOH: H2O

(1:1:4)

SKC, CH3CN:MeOH: H2O

(1:1:4)

F3

( 4,6 g)

SKC, hệ CHCl3:MeOH (20%) thu được 4 phân đoạn (F3.1-F3.4)

Hợp chất (7)

(20 mg)

Hợp chất (3)

(7,2 mg)

Sơ đồ 3.5 - Quy trình cô lập hợp chất (5) từ cao EtOAc

F4

(3,5 g)

F4.2

(550 mg)

SKC, CH3CN: MeOH: H2O (1:1:4)

SKC, CHCl3: MeOH (20%) thu được 5 phân đoạn (F4.1- F4.5)

Hợp chất (5)

(6,3 mg)

3.4 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO

3.4.1 Nguyên tắc

Xanthine oxidase là một enzym thân oxi hóa, xúc tác phản ứng oxi hóa

xanthine tạo acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2● Phương pháp thử XO

sử dụng phương pháp trắc quang khảo sát khả năng ức chế enzym XO của các mẫu

thử thông qua mật độ quang của sản phẩm acid uric hình thành Acid uric có bước

sóng cực đại hấp thu tại 290 nm Chất có khả năng kháng enzym XO càng cao sẽ

càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó mật độ quang của mẫu đo được sẽ giảm

Hình 3.1 - Phản ứng tạo acid uric

3.4.2 Chuẩn bị hóa chất

• Đệm phosphat 70 mM, pH = 7,5: cân 3,702 g NaH2PO4.2H2O và 16,57 g

Na2HPO4.12H2O định mức thành 1000 ml bằng nước cất 2 lần Dùng NaOH

và H3PO4 điều chỉnh pH đến 7,5 bằng máy pH

• Xanthine oxidase 0,05 U/ml: pha từ XO 25 U/ml theo nguyên tắc pha loãng

(Một units (U) của XO được định nghĩa là một lượng enzym cần thiết để tạo

ra 1 µmol của acid uric trong 1 phút ở 250C)

• Xanthine 150 µM: cân chính xác 1,14 mg xanthine, pha trong bình định mức

50 ml bằng đệm phosphat 70 mM pH=7,5

Sơ đồ 3.6 - Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym XO

Mẫu thử và mẫu control được pha theo bảng sau:

Tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank) Mẫu trắng

tương tự như mẫu thử nhưng thay 100 μl XO bằng 100 μl đệm

Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát đối với enzym

XO, chúng tôi sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dương Đây là một hợp chất

ức chế enzym XO rất tốt, đã được sử dụng làm thuốc để chữa trị bệnh gút

Dung dịch sau ủ lần 2

Dung dịch sau ủ

- 100 μl XO (0,05U/ml)

- Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng

- 900 μl Xanthine 150 μM

- Ủ lần 2 (30 phút)

- 200 μl HCl 1N

Đo tại λ= 293 nm

Hình 3.2 – Công thức cấu tạo của allopurinol

3.4.3 Chuẩn bị mẫu

Mẫu khảo sát được cân sau đó sẽ được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat

pH 7,5

Khả năng chống oxi hoá của các hợp chất được tính dựa trên phần trăm ức chế

(%I) Phần trăm ức chế (%I) được xác định theo công thức:

Với :

− Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử (control)

− As: Giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu thử (sample)

Mỗi mẫu ban đầu được thử ở bốn nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µM Mỗi

nồng độ được tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính được 3 giá trị % ức chế

(%I) Lấy trung bình 3 giá trị %I từ đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế

ứng với từng nồng độ khảo sát Nếu hoạt tính của mẫu thử ức chế trên 50% ở 10

µM thì sẽ được thử tiếp ở các nồng độ nhỏ hơn 5, 2, 1, 0.5, 0.2 µM để tìm ra giá trị

IC50

Định nghĩa :

Cách xác định IC 50 :

- Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau

- Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ

một đường thẳng y = ax+b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là

nồng độ)

- Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một

cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50% và cũng

tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b Ta sẽ thu được phương trình y = ax + b

với 2 hệ số a, b đã biết

- Thay y = 50 % vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x Đó chính là nồng độ

ức chế được 50 % gốc tự do (IC50)