Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cây đại bi

Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cây đại bi

2 NGHIÊN CỨU

2.1 Giới thiệu chung

Trong luận văn này chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cây đại bi

thu hái tại Đà Lạt (Lâm Đồng), vào tháng 12 năm 2006 Mẫu cây được phơi khô,

xay nhỏ rồi trích nóng với metanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi

dung môi được cao MeOH thô Hòa tan cao MeOH thô vào nước rồi chiết lần lượt

với các dung môi hexan, cloroform, etyl acetat, thu hồi dung môi được các cao

tương ứng Tiến hành thử hoạt tính các cao thô trên với enzym XO, kết quả cho

thấy cao CHCl3 (IC50=5,0 μg/ml) và cao EtOAc (IC50=1,0 μg/ml) có hoạt tính ức

chế enzym XO mạnh nhất Sau đó lần lượt tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao

CHCl3, EtOAc với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau Chúng tôi đã cô lập

được ba hợp chất từ cao CHCl3 ký hiệu là (1), (2) và (4); bốn hợp chất từ cao

EtOAc ký hiệu là (3), (5), (6) và (7)

2.2 Biện luận và kết quả

Bằng các phương pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-NMR,

HSQC-NMR, HMBC-HSQC-NMR, cấu trúc của các hợp chất trên được xác định là:

quercetin-3,7,3’-trimetyl eter (1); quercetin-3,3’,4’-quercetin-3,7,3’-trimetyl eter (2); 5,7,3’,5’-tetrahydroxyl flavanon

(3); dihydroquercetin-7,4’-dimetyl eter (4); dihydroquercetin-7- metyl eter (5);

(2R,3R)-4’-O-metyldihydroquercetin (6); (2R,3S)-4’-O-metyldihydroquercetin (7)

Quercetin-3,7,3’-trimetyl eter (1) Quercetin-3,3’,4’-trimetyl eter (2)

OOH

7

1'

3' 4' 9

10

2.1.1 Khảo sát phổ của hợp chất (1)

Hình 2.1 - Công thức cấu tạo của hợp chất (1)

Tinh thể hình kim màu vàng nhạt Tan trong dung môi CHCl3, DMSO

Phổ 1H-NMR (phụ lục 1) có tín hiệu của nhóm hydroxyl -OH kiềm nối [δH

12,68 ppm (1H; s)] Các mũi còn lại thuộc vùng trường thấp của vòng thơm với hai

proton meta của vòng benzen [δH 6,78 ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-8)]; [δH 6,37 ppm

(1H; d; J=2,0 Hz; H-6)] cho ta dự đoán là của vòng benzen 1, 2, 3, 5 tứ hoán và ba

proton [δH 7,67 ppm (1H; d; J= 2,0 Hz; H-2’)]; [δH 7,63 ppm (1H; dd; J= 2,0 Hz và

8,5 Hz; H-6’)]; [δH 6,96 ppm (1H; d; J= 8,5 Hz; H-5’)] cho thấy hợp chất (1) còn

có thêm một vòng benzen 1, 3, 4 tam hoán Ngoài ra ở vùng trường cao có các tín

hiệu [δH 3,82 ppm (3H; s)] và [δH 3,87 ppm (6H; s)] đây là ba proton của nhóm

-OCH3 gắn trên nhân thơm

Phổ 13C-NMR và DEPT (phụ lục 2, 3) cho thấy hợp chất (1) có mười carbon

tứ cấp, trong đó có bảy tín hiệu carbon tứ cấp ở vùng trường thấp 137,9 -164,3 ppm

cho thấy chúng mang oxygen, ngoài ra còn có năm carbon metin (-CH<) cùng với

ba carbon metyl (-CH3) của nhóm -OCH3 ở vùng trường cao 55-60 ppm, một tín

hiệu carbon carbonyl tiếp cách [δC 178,0 ppm]

Từ dữ liệu phổ 1H, 13C và DEPT cho thấy hợp chất (1) là dẫn xuất của

flavonol

Trên vòng A, phổ HMBC-NMR (phụ lục 5) cho thấy proton của nhóm -OH

kiềm nối [δH 12,68 ppm (1H; s)] cho tương quan với một carbon tứ cấp mang

oxygen [δC 160,9 ppm], một carbon tứ cấp không mang oxygen [δC 105,2 ppm] và

một carbon metin [δC 97,8 ppm] xác nhận chúng lần lượt là C-5 [δC 160,9 ppm];

C-10 [δC 105,2 ppm] và C-6 [δC 97,8 ppm]

Tương ứng trên phổ HSQC-NMR (phụ lục 4) xác nhận proton H-6 [δH 6,37

ppm (1H; d; J=2,0 Hz)]

Proton mũi đôi [δH 6,78 ppm (1H; d; J=2,0 Hz)] được xác định là H-8 do có

tương quan với C-10 [δC 105,2 ppm] Proton H-8 này còn cho tương quan với

carbon tứ cấp mang oxygen [δC 156,3 ppm] là C-9 Vị trí C-7 [δC 165,1 ppm] được

xác nhận bởi tương quan của proton H-6 và H-8 Tương quan HMBC giữa proton

của nhóm -OCH3 [δH 3,87 ppm (3H; s)] với C-7 [δC 165,1 ppm] chứng tỏ trên C-7

mang nhóm thế -OCH3

Trên vòng B, chỉ có H-5’ và H-2’ có tương quan HMBC với [δC 147,5 ppm],

còn H-6’ không có tương quan này Như vậy [δC 147,5 ppm] là của C3’ Proton

-OCH3 [δH 3,87 ppm (3H; s)] có tương quan HMBC với C-3’ Do đó nhóm -OCH3

sẽ gắn trên C-3’ và -OH gắn trên C-4’

Hình 2.2 – Một số tương quan HMBC của hợp chất (1)

Từ các phân tích trên, hợp chất (1) được đề nghị là quercetin-3,7,3’-trimetyl

eter trên cơ sở so sánh với tài liệu tham khảo[16] (bảng 2.2) thì thấy dữ liệu phổ trùng

khớp

Số liệu phổ 1H, 13C và tương quan HMBC của hợp chất (1) được trình bày

+ : các vị trí này trùng lắp lên nhau

* : các vị trí này có thể hoán đổi cho nhau

Bảng 2.2 - So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi

DMSO-d 6 và hợp chất quercetin 3,7,3’- trimetyl eter trong dung môi DMSO-d 6.[16]

Hợp chất (1) Quercetin 3,7,3'-trimetyl eter

* : các vị trí này có thể hoán đổi cho nhau

2.1.1 Khảo sát phổ của hợp chất (2)

Hình 2.3 - Công thức cấu tạo hợp chất (2)

Chất bột màu vàng, tan trong dung môi CHCl3

Phổ 1H-NMR (phụ lục 6) cho thấy hợp chất (2) cũng là một dẫn xuất

flavonol tương tự như hợp chất (1) Ở vùng trường thấp có xuất hiện các tín hiệu

của proton vòng thơm [δH 7,73 ppm (1H; dd; J=2,0 Hz và 8,5 Hz, H-6’)]; [δH 7,69

ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-2’)]; [δH 7,00 ppm (1H; d; J=8,5 Hz, H-5’)]; [δH 6,41 ppm

(1H; d; J=2,0 Hz; H-8)]; [δH 6,28 ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-6)] Các dữ liệu này cho

thấy hợp chất (2) có chứa hai vòng benzen: một vòng benzen 1, 3, 4 tam hoán và

một vòng benzen 1, 2, 3, 5 tứ hoán Ngoài ra, ở vùng trường cao xuất hiện các tín

hiệu proton [δH 3,97 ppm (3H; s)]; [δH 3,96 ppm (3H; s)]; [δH 3,83 ppm (3H; s)]

Đây là những proton của nhóm -OCH3 gắn trên nhân thơm

Phổ 13C-NMR (phụ lục 7) và phổ DEPT (phụ lục 8) kết hợp với phân tích phổ

hai chiều HSQC-NMR (phụ lục 9), HMBC-NMR (phụ lục 10) cho thấy hợp chất (2)

chỉ khác với hợp chất (1) ở những vị trí nhóm -OCH3 trên vòng A và B của dẫn xuất

flavonol Tương quan HMBC giữa các proton metin [δH 3,83 ppm]; [δH 3,96 ppm];

[δH 3,97 ppm] lần lượt với các carbon có [δC 60,3 ppm]; [δC 56,1 ppm]; [δC 56,0

ppm], chứng tỏ các nhóm metoxy lần lượt gắn tại C-3; C-3’; C-4’

Từ các phân tích nêu trên, cấu trúc hợp chất (2) được xác định là quercetin-3,

3’, 4’-trimetyl eter, dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất (2) được so sánh với tài liệu

tham khảo[25] cho bởi bảng 2.4

Số liệu phổ 1H, 13C và tương quan HMBC của hợp chất (2) được trình bày

trong bảng 2.3

Hình 2.4 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (2)

Bảng 2.3 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan

MBC của hợp chất (2) trong dung môi CDCl3 và CD3OD

Tương quan HMBC ( 1 H Æ 13 C)

Bảng 2.4 - So sánh phổ 1H-NMR của hợp chất (2) trong dung môi CDCl3 và

CD3OD và hợp chất quercetin-3,3’,4’-trimetyl eter trong dung môi CCl4 và C6D6.[25]

Hơp chất (2) Quercetin - 3, 3’, 4’- trimetyl eter

2.1.3 Khảo sát phổ của hợp chất (3)

Hình 2.5 - Công thức cấu tạo hợp chất (3)

Tinh thể vàng cam Tan tốt trong dung môi aceton, DMSO.

Phổ 1H-NMR (phụ lục 11) có tín hiệu của nhóm -OH kiềm nối [δH 12,13 ppm

(1H; s)] Vùng trường thấp có hai tín hiệu proton của vòng thơm [δH 5,87 ppm (1H;

d; J=2,0 Hz; H-6)]; [δH 5,88 ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-8)] cho ta dự đoán là của

vòng benzen 1, 2, 3, 5 tứ hoán và ba proton [δH 6,74 ppm (1H; s; H-2’)]; [δH 6,87

ppm (1H; s; H-4’)]; [δH 6,74 ppm (1H; s; H-6’)] cho thấy hợp chất (3) còn có thêm

một vòng benzen 1, 3, 4 tam hoán Ngoài ra ở vùng trường cao có các tín hiệu

proton [δH 5,37 ppm (1H; dd; J=3,0 Hz và 12,5 Hz; H-2)]; [δH 3,18 ppm (1H; dd;

J=12,5 Hz và 17,0 Hz; H-3b)]; [δH 2,68 ppm (1H; dd; J=3,0 Hz và 17,0 Hz; H-3a)],

kết hợp với phổ 13C-NMR (phụ lục 12) và DEPT (phụ lục 13), thấy có tín hiệu của

nhóm metylen [δC 42,0 ppm] và nhóm metin [δC 78,4 ppm], đồng thời carbon

carbonyl dịch chuyển về trường thấp [δC 196,3 ppm] Ngoài ra còn có ba proton của

nhóm OH [δH 9,01 ppm (2H; s)]; [δH 10,87 ppm (1H; s)]

Từ các dữ liệu và phân tích nêu trên cho thấy hợp chất (3) có khung tương tự

như hợp chất (1) và (2) nhưng không có nối đôi tại C-2; C-3 nên có dạng flavanon

Hình 2.6 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (3)

Phổ HSQC-NMR (phụ lục 14) cho thấy hai proton [δH 2,68 ppm] và [δH 3,18

ppm] tương quan với carbon metylen [δC 42,0 ppm], đây là hai proton của C-3

Proton [δH 5,37 ppm] tương quan với carbon metin [δC 78,4 ppm], xác nhận proton

của C-2 Hằng số ghép các proton H-2, H-3 như sau:

Proton H-2 ghép với H3a (J23a=3,0 Hz), H-2 ghép cặp tiếp với H3b (J23b=12,5 Hz)

Proton H3a ghép với H-2 (J23a=3,0 Hz), H3a ghép với H3b (J3a3b=17,0 Hz) H3b

ghép với H-2 (J23b=12,5 Hz), H3b ghép với H3a (J3a3b=17,0 Hz)

Như vậy H-3a ở tại vị trí δH 2,68 ppm (dd; J= 3,0 và 17,0 Hz); H-3b ở tại δH

3,18 ppm (dd; J= 12,5 và 17,0 Hz) và H-2 tại δH 5,37 ppm (dd; J= 3,0 và 12,5 Hz)

Phổ HMBC-NMR (phụ lục 15) cho biết proton của -OH kiềm nối tại C-5 có

tương quan với hai carbon tứ cấp [δC 101,8 ppm]; [δC 163,4 ppm] và một carbon

metin [δC 95,7 ppm] Do đó vị trí của các carbon này lần luợt là C-5 [δC 163,4 ppm];

C-10 [δC 101,8 ppm] và C-6 [δC 95,7 ppm];

Proton H-2 tương quan với một carbon tứ cấp [δC 129,4 ppm]; 2 carbon metin

[δC 114,3 ppm]; [δC 115,3 ppm] Do đó vị trí các carbon này lần lượt là C-1’ [δC

-129,4 ppm]; C-2’ [δC 114,3 ppm]; C-6’ [δC 115,3 ppm]

Như vậy carbon metin còn lại được xác định là của C-4’ [δC 117,9 ppm]

Từ các phân tích trên, hợp chất (3) được đề nghị là 5,7,3’,5’-tetrahydroxyl

flavanon So sánh với tài liệu tham khảo (bảng 2.6) [18] thì thấy dữ liệu phổ trùng

khớp

Số liệu phổ 1H, 13C và tương quan HMBC của hợp chất (3) được trình bày

Vị trí Loại C δΗ (ppm) δC (ppm)

2 -CH(OR)- 5,37 (1H; dd; J=3,0 và 12,5 Hz) 78,4 C-1’ C-2’; C-6’

2,68 (1H; dd; J=3,0 và 17,0 Hz) 3a

3,18 (1H; dd; J=12,5 và3b

OH

5'

Các vị trí cùng ký hiệu: +, *, **, *** có thể hoán đổi cho nhau

++: các mũi này trùng lắp lên nhau

Bảng 2.6 - So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi

DMSO-d 6 và hợp chất 5,7,3’,5’-tetrahydroxyflavanon trong dung môi

Các vị trí cùng ký hiệu: ++, ++++ bị trùng lắp

2.1.4 Khảo sát phổ của hợp chất (4)

Hình 2.8 - Công thức cấu tạo hợp chất (4)

Chất bột trắng, tan trong dung môi CHCl3

Phổ 1H-NMR (phụ lục 16): có tín hiệu của nhóm -OH kiềm nối ở [δH 11,45

ppm (1H; s)] Các mũi còn lại thuộc vùng trường thấp của vòng thơm [δH 7,08 ppm

(1H; d; J=2,0 Hz; H-2’)]; [δH 7,01 ppm (1H, dd, J=2,0 Hz và 8,0 Hz, H-6’)]; [δH

6,91ppm (1H; d; J=8,0 Hz; H-5’)]; [δH 6,10 ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-6)]; [δH 6,04

ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-8)] Các dữ liệu này cho thấy hợp chất (4) cũng có chứa

hai vòng benzen: một vòng benzen 1, 3, 4 tam hoán và một vòng benzen 1, 2, 3, 5

tứ hoán Ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu của proton [δH 5,00 ppm (1H; d;

J=11,5 Hz; H-2)]; [δH 4,54 ppm (1H; d; J=11,5 Hz; H-3)] Như vậy tương tự như

hợp chất (3) hợp chất (4) có khung sườn là một flavanon Ngoài ra còn có 2 tín hiệu

proton [δH 3,90 ppm (3H; s)] và [δH 3,81 ppm (3H; s)], đây là những proton của

nhóm –OCH3 gắn trên nhân thơm

Phổ 13C-NMR (phụ lục 17) và phổ DEPT (phụ lục 18) kết hợp với phân tích

Hình 2.9 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (4)

Bảng 2.7 - Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (4) trong dung môi CDCl3 và CD3OD

Tương quan HMBC ( 1 H Æ 13 C)

3’ 145,8 146,3 4’ 147,8 148,1 5’ 6,91 (1H; d; J=8,0 Hz) 110,9 6,94 (1H, d, J=1,5 Hz) 111,9

6’ 7,01 (1H; dd; J=2,0 và

J= 8,0 Hz) 119,5 6,90 (1H; d; J=1,5 Hz) 119,4 7-OCH3 3,81 (3H; s) 55,8 3,79 ( 3H; s) 56,1

4’-OCH3 3,90 (3H; s) 55,6 3,78 (3H; s) 55,8

2.1.5 Khảo sát phổ của hợp chất (5)

Hình 2.10 - Công thức cấu tạo của hợp chất (5)

Chất bột màu vàng, tan tốt trong dung môi DMSO

Phổ 1H-NMR (phụ lục 22), ta thấy có tín hiệu của nhóm hydroxyl -OH kiềm

nối [δH 11,80 ppm (1H; s)], ở vùng trường thấp có các tín hiệu [δH 6,89 ppm (1H; s;

H-2’)]; [δH 6,75 ppm (2H; s; H-5’ và H-6’)]; [δH 6,06 ppm (1H; d; J=1,5 Hz; H-6)];

[δH 6,08 ppm (1H; d; J=1,5 Hz; H-8)] Các dữ liệu trên cho thấy hợp chất (5) cũng

có hai vòng benzen: một vòng benzen 1, 3, 4 tam hoán và một vòng benzen 1, 2, 3,

5 tứ hoán Ngoài ra ở vùng trường cao có thêm các tín hiệu proton hydroxyl –OH

[δH 5,80 ppm (1H; d; J = 6,1 Hz)], [δH 8,99 ppm (2H; s)], vùng trường thấp còn có

các tín hiệu proton [δH 4,53 ppm (1H; dd; J = 6,1 Hz và 11,2 Hz; H-3)] và [δH 5,01

ppm (1H; d; J = 11,2 Hz; H-2)], một tín hiệu của nhóm -OCH3 [δH 3,34 ppm (3H;

s)] gắn trên nhân thơm Từ các dữ liệu trên kết hợp so sánh phổ của (5) với (3) và

(4) cho thấy hợp chất (5) cũng có khung sườn flavanon

Phổ 13C-NMR (phụ lục 23) và DEPT (phụ lục 24), phổ hai chiều HSQC-NMR

(phụ lục 25), HMBC-NMR (phục lục 26) kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [12]

(bảng 2.10) của hợp chất dihydroquercetin cho phép kết luận hợp chất (5) là

dihydroquercetin-7-metyl eter Trong đó, vị trí nhóm metoxy (-OCH3) được xác

định ở C-7 nhờ vào tương quan giữa proton của nhóm -OCH3 [δH 3,34 ppm (3H; s)]

với C-7 [δC 167,5 ppm] trên phổ HMBC (phụ lục 26)

Số liệu phổ 1H, 13C và tương quan HMBC của hợp chất (5) được trình bày

trong bảng 2.9

Hình 2.11 - Một số tương quan HMBC của hợp chất (5)

Bảng 2.9 - Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz), 13C-NMR (100 MHz) và tương quan

HMBC của hợp chất (5) trong dung môi DMSO-d 6

Tương quan HMBC ( 1 H Æ 13 C)

Bảng 2.10 - So sánh phổ 13C-NMR của hợp chất (5) trong dung môi DMSO-d 6 và

hợp chất dihydroquercetin trong dung môi DMSO-d 6 [12]

6’ 119,4 119,2

2.1.6 Khảo sát phổ của hợp chất (6)

Hình 2.12 - Công thức cấu tạo của hợp chất (6)

Chất bột màu vàng nâu Tan trong dung môi CHCl3 và MeOH

Phổ 1H-NMR (phụ lục 27), cho thấy ở vùng trường thấp có các tín hiệu [δH

7,06 ppm (1H; d; J= 2,0 Hz; H-2’)]; [δH 6,99 ppm (1H; dd; J= 2,0 Hz và 8,0 Hz;

H-6’)]; [δH 6,90 ppm (1H; d; J= 8,0 Hz; H-5’)]; [δH 6,00 ppm (1H; d; J= 2,0 Hz; H-8)];

[δH 5,95 ppm (1H; d; J= 2,0 Hz; H-6)] Các dữ liệu trên cho thấy hợp chất (6) cũng

có hai vòng benzen: một vòng benzen 1, 3, 4 tam hoán và một vòng benzen 1, 2, 3,

5 tứ hoán Ngoài ra ở vùng trường cao có các tín hiệu [δH 4,96 ppm (1H; d; J= 11,5

Hz; H-2)]; [δH 4,51 ppm (1H; d; J= 11,5 Hz; H-3)] kết hợp với phổ 13C-NMR (phụ

lục 28) và DEPT (phụ lục 29) cho thấy đó là hai proton của nhóm metin mang

oxygen (>CH-O) tương ứng với hai tín hiệu carbon [δC 83,2 ppm]; [δC 72,2 ppm]

Ta còn thấy có tín hiệu proton [δH 3,89 ppm (3H; s)] đây là proton của nhóm -OCH3

gắn trên nhân thơm Từ các dữ liệu phổ trên cho thấy hợp chất (6) cũng có khung

sườn là một flavanon tương tự như hợp chất (3), (4) và (5)

Dựa vào hằng số ghép giữa proton H-2 là 11,5 Hz và H-3 là 11,5 Hz cho phép

kết luận vị trí lập thể của proton H-2 và H-3 trong khung flavanon như hình 2.13

Hình 2.13 - Hóa học lập thể của C-2 và C-3 trong hợp chất (6)

Phổ HMBC-NMR (phụ lục 31) cho thấy cả ba proton H-6’ [δH 6,99 ppm (1H;

dd; J= 2,0 và 8,0 Hz)]; H-5’ [δH 6,90 (1H; d; J= 8,0 Hz)] và H-2’ [δH 7,06 (1H; d;

J= 2,0 Hz)] đều có tương quan với carbon [δC 147,9 ppm] và chỉ có proton H-5’,

proton H-2’ tương quan với carbon [δC 145,9 ppm], điều này xác nhận carbon [δC

147,9 ppm] là C-4’ và carbon [δC 145,9 ppm] là C-3’ Mặt khác phổ HMBC cho

thấy proton metoxy -OCH3 [δH 3,89 ppm (3H; s)] có tương quan với carbon [δC

147,9 ppm] Như vậy nhóm metoxy -OCH3 gắn trên carbon C-4’ trong hợp chất (6)

Từ các phân tích trên hợp chất (6) được đề nghị là

(2R,3R)-4’-O-metyldihydroquercetin trên cơ sở so sánh với tài liệu tham khảo [15] (bảng 2.12)

Số liệu phổ 1H, 13C và tương quan HMBC của hợp chất (6) được trình bày

trong bảng 2.11