Giáo án điện tử môn sinh vật học: Samonella(Vi Sinh Học) ppt

Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY ĐHNLTP.. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY ĐHNLTP.. Nguyễn Ngọc Hải Khoa CNTY ĐHNLTP.. HCM -• Phương pháp phân lập • Phương pháp miễn dịch –Huyết thanh học –ELISA Bộ

Trang 1

PGS TS Nguyễn Ngọc Hải

Khoa CNTY ĐHNLTP HCM

-Gr-, họ Enterobacteriaceae

Hình trực ngắn, không vỏ bọc, không bào tử

2 loài chính: S enterica và S bongori

 Salmonella enterica chia 6 loài phụ:

–ISalmonella enterica

–II Salmonella salamae

–IIIa Salmonella arizona

–IIIb Salmonella diarizona

–IV Salmonella houtenae

–VI Salmonella indica

 Salmonella bongori có một loài phụ V

Salmonella: Vi sinh học

Trang 2

* Nhóm gây bệnh trên người: Sal typhi,

Sal paratyphi A, S paratyphi C Tác nhân gây sốt thương hàn và phó

Trang 3

-Kháng nguyên vi khuẩn Salmonella

Trang 4

Vi khuẩn Nhóm

KN

Kháng nguyên O

Kháng nguyên H

(flagellar)Phase 1 Phase 2

Trang 5

-PGS TS Nguyễn Ngọc Hải

-• Phương pháp phân lập

• Phương pháp miễn dịch

–Huyết thanh học

–ELISA (Bộ kit Hyoptest (Bommeli))

–Miễn dịch huỳnh quang

• Phương pháp phân tử

–PCR (Polymerase Chain Reaction)

–Real Time PCR

–Multiplex PCR

Phương pháp chẩn đoán Salmonella

Trang 6

Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh của cơ

thể thú ⇔ Kháng nguyên Salmonella

 Huyết thanh cho phản ứng dương tính sẽ pha loãng

1/20- 1/320 và kiểm tra lại với kháng nguyên phù hợp

Kiểm tra huyết thanh học

Trang 7

-Kiểm tra huyết thanh học

a

b

c

a: âm tính b: nghi ngờ c: dương tính

Trang 8

• * Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong

huyết thanh của cơ thể thú được nhuộm huỳnh

quang ⇔ Kháng nguyên Salmonella

• * Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang

 Chuẩn bị kháng nguyên và cố định vết

bôi lên phiến kính ⇒ kết hợp kháng thể

 Nhuộm vết bôi: dùng conjugate có chất

phát huỳnh quang

 Kính hiển vi có thể chụp lại hình ảnh

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Trang 9

- Salmonella > 2.500 kiểu huyết thanh

 cụm gen chung: inv (invasion) và iag giúp cho quá trình

xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật ⇒

gây bệnh

Cấu trúc phân tử của Salmonella

Trang 10

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA đích (gen inv)  band 520bp trên gel điện di

Cặp mồi invA1 và invA2:

invA1 : 5’ - TTGTTACGGCTATTTTGACCA – 3’

invA2 : 5’ - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG – 3’

Giếng 1: Thang DNA 100 bp Giếng 2, 3, 4, 5: Các chủng

Salmonella khác nhau

Giếng 6: Escherichia coli Giếng 7: Vibrio cholerae Giếng 8: Clostridium perfringens

Trang 11

-Real-time PCR: iQ- CheckTM Salmonella

 Phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm và

môi trường

 Probe phát huỳnh quang (fluorescent probes) = một trình tự oligonocleotide phát sáng rất chuyên biệt = tín hiệu phân tử (molecular beacon)

 Probe dạng tự do ⇒ tín hiệu huỳnh quang từ F sẽ bị Q

hấp thu ⇒ không phát sáng

 Probe đã được bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích ⇒ F và

Q tách ra xa nhau ⇒ tín hiệu huỳnh quang từ F không bị Q hấp thu ⇒ phát sáng

Trang 12

Fluorophore Quencher

Phân tử Beacon

Trang 13

-Ưu điểm iQ – CheckTM Salmonella

o Không cần điện di sau PCR

o Nhanh

o Qui trình đơn giản

o Độ nhạy cao (102 Salmonella cfu/ml)

o Độ đặc hiệu cao

o Không dương tính giả/ không phản ứng chéo

o Tự động

Trang 14

Tăng sinh Salmonella

(25/225ml, ủ 18 ±2 giờ ở 37OC)

Ly trích DNA

iCycle iQ Optical System

(Chọn chu kỳ nhiệt và vị trí plate)

Real Time PCR Đọc kết quả

Trang 15

-Salmonella enterica typhimurium

– Primer Rfbj: gen rfbj (kháng nguyên O.4.)

– Primer Flic: gen flic-1 (kháng nguyên H1-I

– Primer Flib: gen flib (kháng nguyên H2- 1,2)

Primer Gen

đích

Độdài Trình tự Kích cỡ

đoạn khuếch đại (bp) Rfbj-s

24 24 24 24 24 24

5’-CCAGCACCAGTTCCAACTTGATAC 5’-GGCTTCCGGCTTTATTGGTAAGCA 5’-ATAGCCATCTTTACCAGTTCCCCC 5’-GCTGCAACTGTTACAGGATATGCC 5’-ACGAATGGTACGGCTTCTGTAACC 5’-TACCGTCGATAGTAACGACTTCGG

663 183

526

Trang 17

Khoa CNTY

ĐHNLTP HCM

Trang 18

Mô tả bảng 96 giếng trên màn hình

Mô tả kết quả

ở thời gian thực

Trang 19

Trang 20

-Đối chứng dương : ODpos - ODneg

-Mẫu : ODmẫu - ODneg

Giá trị (%) = ODmẫu - ODneg

Trang 21

-Bộ phận cảm ứng sử dụng FRET tạo sóng huỳnh quang

giữa vật phát và vật nhận

Đầu dò miễn dịch

Flourescence Resonance Energy Transfer (FRET)

Sơ đồ của immunosensor FRET

Trang 22

Đầu sợi thủy tinh (a) Benchtop Fluorometer (b)

Phức hợp protein-kháng thể cố định trên đỉnh sợi thuỷ tinh và được gắn vào benchtop flourometer giám sát những thay đổi huỳnh quang

Trang 23

-• * Bacteriophage có tính chuyên biệt cho vi khuẩn chủ ⇒

dạng lý tưởng để xác định vi khuẩn

• * Enzyme luciferase của vi khuẩn được dùng để dò tìm và định lượng vi khuẩn:

Chuyển gen lux vào genome phage Phage thiếu cơ chế enzyme nội bào cần thiết ⇒ không phát sáng

Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, gen của phage và gen lux sẽ thể hiện ⇒ tế bào chủ phát sáng

Kỹ thuật bacteriophage và phân tách miễn dịch từ

Trang 24

Phân tách miễn dịch từ

Hạt từ được phủ kháng thể đa dòng kháng

Salmonella

Có Salmonella

trong dịch mẫu

Bacteriophage

Bacteriophage + Salmonella Bacteriophage bị rửa trôi

Không có Salmonella

trong dịch mẫu

Bacteriophage nhân lên

SAC (Signal Amplifing Cells)

SAC bị bacteriophage phá

hủy ⇒ Giảm mật độ quang SAC nhân lên ⇒

Tăng mật độ quang

Trang 25

Khoa CNTY

ĐHNLTP HCM

Định dạng
Số trang	25
Dung lượng	861,5 KB