Thực nghiệm li trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà

Thực nghiệm li trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà

PHẲN4:

THỰC NGHIỆM

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

S.1 Thực nghiệm

S.1.1 Thiết bị

1 Lò vi sóng gia dụng TOSHIBA ER ~ 675 VL(110)

Máy siêu âm: POWER SONIC405

Phổ UV được đo trên máy HP-8452A Diode Array

Phổ LC-MS được đo trên máy FINNIRAN - THERM EQUEFT

2

3

4

5 Cân điện tử METTLER PE 3000

6 Máy cô quay HEIDOLPH WB 2000

7 Cân điện tử SARTORIUS GP 1503P

8 Bộ Soxhlet lớn, nhỏ

9 Máy đun khuấy từ có điểu chỉnh nhiệt độ

10 Điểm nóng chảy đo trên khối maquenne

5.1.2 Hoá chất

1 Eter dầu hoa chung cất phân đoạn (60-90°C), làm khan bằng Na;SO,

2 Cloroform chưng cất phân đoạn ở 60 - 61°C, làm khan bằng Na;SO,

3 n-Hexan tỉnh khiết

4 Benzen tỉnh khiết

5, Dietil eter tính khiết

6 Etanol tỉnh khiết

7 Acetat etil tinh khiết

8 Iodur metil tính khiết

9 Oxid bạc

10 Dung dich FeCl; 1%

11 Na;SO¿ khan

Nghiên cứu ly trích và điêu chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xè

12

13

14

15

16

tt:

28

19

20

21

22

23

24

25

26

27

HCI đậm đặc

Alcol isoamil

Anhidrid acetic

H;SO, đậm đặc

Formol 36%

Gelatin

Dung dich acetat chi bao hoà

Dung dich acid picric 1% trong alcol

Dung dich timol xanh 2%

b

KI

HạCl;

Dung dịch acid picric bão hoà trong H;O

Acid slicotungstic

Dung dich KOH 2,5%, KOH 10%

Slicagel sắc ký lớp mỏng (25 DC - alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60

F;s„„ Merck) Silicagel sắc ký cột

5,13 Phương pháp Soxhlet

5.1.3.1 Soxhlet lớn

Cho vào 100 bột rễ cây bạch hoa xà vào bọc giấy và một lít dung môi eter dầu hỗa ( 60-90°C) vào bình cầu 2 lít đun hoàn lưu liên tục trong 33 giờ

Cô quay thu hổi dung môi đến khối lượng cao không đổi, cân tính khối lượng cao, qui ra phần trăm của cao.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

3.1.3.2 Soxhlet nhỏ

Cho 20 g bột rễ vào bọc giấy và 200 m\ dung môi eter dâu hỏa vào bình cầu 500 ml đun hoàn lưu liên tục trong 33 giờ Cô quay thu hồi dung môi, đến khối lượng cao không đổi, cân tính khối lượng cao, qui ra phần trăm cao

Š.1.4 Phương pháp khuấy từ :

§.1⁄4.1 Nhiệt độ phòng

Cho 20 g bột rễ cây bạch hoa xà và 200 ml dung môi eter dầu hỏa vào erlen 500 ml Khuấy liên tục trong những thời gian nhất định, thu hồi dung môi, đến khối lượng cao không đổi, tính khối lượng cao, qui ra phẩn trăm cao

Lặp lại thí nghiệm ở những khoảng thời gian khác nhau

5.1.4.2 Có dun

Cho 20 8 bột rễ cây bạch boa xà và 200 ml dung môi eter dẫu hỏa vào erlen 500 ml Khuấy từ được đun ở 50°C, giữ nhiệt độ bằng nhiệt kế điểu nhiệt, khuấy liên tục trong những khoảng thời gian xác đính, thu hồi dung mồi, đến khối lượng cao không đổi, cân tính khối lượng cao, qui ra phân trăm cao Lặp lại thí nghiệm ở những khoảng thời gian khác nhau

S.L.5 Vĩ sóng

Cho 20 g bột rễ cây bạch hoa xà và 200 mÌ dung mỗi eter dầu hỏa vào bình cầu 500 ml Đặt bình câu vào trong lò vi sóng (Phụ lục số 33) Sau khi chiến xạ vi sóng ở những thời gian xác định, thu hồi dung môi, đến khối lượng

cao không đổi, cân tính khối lượng cao, qui ra phan trim cao Lap lại thí

nghiệm ở những khoáng thời gian khác nha

5.1.6 Phương pháp siêu âm

Cho 20 g bột rễ cây bạch hoa xà vào 200 mÌ dung môi eter dẫu hỏa vào

erfen 500 ml Đặt erlen vào bổn siêu âm, sau khi thực hiện siêu âm ở những

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

thời gian xác định, cô quay thu hổi dung môi, đến khối lượng cao không đổi,

cân tính khối lượng cao, qui ra phẩn trăm cao Lặp lại thí nghiệm ở những thời khoảng thời gian khác nhau

§.1.7 Xác định hàm lượng plumhagin

5.1.7.1 Bằng phương pháp phổ tử ngoại (UV):

Cân chính xác 1Ö mg plumbagin tỉnh khiết (99,9%) rồi dùng dung môi cloroform (99%) pha thành các dung dịch có nổng độ C¡= 0,1mg/ml Tir dung dịch C¡ pha ra dung dịch Cạ= 0.01; 0,02; 0,03; 0,04 mg/ml Đo mật độ quang của các dung địch C;

Xây dựng đường chuẩn Cân chính xác một lượng cao eter của các phương

pháp ly trích Hoà tan các cao bằng một thể tích cloroform như nhau

Đo mật độ quang của các các dung dịch cao, (Phụ lục số 1,2,3,4).Từ phương trình đường chuẩn (3), tính ra nông độ plumabgin, phân trăm plumbagin trong cao

5.1.7.2 Xác định bằng phương pháp LC-MS

Cân chính xác plumbagin chuẩn, pha trong 10 ml dung môi metano] với các nông độ Cụ, Cạ, C¿,C¿, (Phụ lục số 5, 6, 7, 8) Bơm từng nổng độ đã pha vào máy, máy cho ta được 4 sắc ký đồ, (Phụ lục số 9, 10, 11, 12), trên đó xác

định được diện tích peak tương ứng với các nồng độ plumbagin hấp thụ Xây

dựng được đường chuẩn của plumbagin (Đổ thị 6)

Cân chính xác khối lượng cao theo các phương pháp ly trích Sau đó pha

vào metanol và thực hiện phương pháp LC-MS với những điều kiện như nhau

với chất chuẩn.Ta được diện tích hấp thụ cúa mỗi loại cao Dựa vào đường chuẩn plumbagin (®), tính được nông đô plumbagin trong các loại cao, phn trăm plumbagin trong, cao

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

5.1.8 Cô lập và nhận danh plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà

5.1.8.1 Cô lập plumbagin

Cân chính xác khối lượng các cao của các phương pháp ly trích (Bảng 27), tiến hành sắc ký cột các cao Cột có kích thước 20x40 mm, sắc ký cột sử dụng silicagel, dung môi giải ly là eter dau hoả ; EtOAc là 8 : 2

Sắc ký bản mỏng với hệ dung ly eter dau hod : EtOAc là 9 :1 có đối chiếu với plumbagin chuẩn cho 1 vết plumbagin cô lập trùng với plumbagin chuẩn có

Ry = 63, (Phụ lục số 33)

5.1.8.2 Nhận danh plumbagin

5.L.8.2.1 Nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của E2 cô lập qua sắc ký cột là 78°C, trùng với

plumbagin chuẩn! 'Ê!, đo trên khối nhiệt

5.1.8.2.2 Phé IR

Phổ IR của E2 được đo trên máy SHIMADZU IR-470, trong KBr

5.1.8.2.3 Phé 'H NMR

Phổ 'H NMR của E2 trong dung môi CDCI;, được đo trén may có tẫn số

200 MHz

5.1.8.2.4 Phổ °C NMR

Phổ °C NMR eda E2 trong dung môi CDCI; được đo trên máy có tần số

200 MHz Đối chiếu phổ chuẩn của plumbagin"”Ì, được đo trên máy JEOL g500 có tần số 125 MHz TMS làm chuẩn nội

5.1.8.2.5 Phổ HMQC

Phổ HMQC của (E2) trong dung môi CHCI,, được đo trên máy, AV - 500, tân số cộng hưởng 500 MHz tai Viện Hóa học, Hà Nội.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

5.2.3 Tổng hợp dẫn xuất của plumbagin

5.2.3.1 Phần ứng trong điều kiện cổ điển

5.2.3.1.1 Khao sat lugng dung mơi CHCI;

Cân chính xác 0,53 mmol (100mg) plumbagin, cho vào ống nghiệm, cho

tiếp vào 1,06 mmol (150,5 mg) CHạI, cho vào 0,5 g Ag;O Lượng dung mơi

cho vào khảo sát là CHC]; sẽ được thay đổi là 5; 10; 15; 20; 25 ml Hỗn hợp

phần ứng sẽ được khuấy từ ở nhiệt độ phịng trong thời gian là 40 giờ Cơ lập sản phẩm, tính hiệu suất, xác định lượng dung mơi thích hợp

5.2.3.1.2 Khảo sát tỷ lệ mol

Cân chính xác 0,53 mmol (100mg) plumbagin, cho vào ống nghiệm, cho tiếp vào 1,59 mmol (225,7 mg) CHạI và 0,5 g Ag:O, 10 ml dung mơi CHCl Hỗn hợp phản ứng sẽ được khuấy từ ở nhiệt độ phịng trong 40 giờ Tỷ lệ mol giữa plumbagin : CHạI sẽ thay đổi theo Bảng 32 Cơ lập sản phẩm, tính hiệu suất và tìm được tỷ lệ mol thích hợp

5.2.3.1.3 Khảo sát thời gian phản ứng

Cân chính xác 0,53 mmol (100 mg) plumbagin và 0,74 mmol CH¡I,

10ml CHC];, 0,5 g AgaO cho vào ống nghiệm, khuấy từ nhiệt độ phịng Thay đổi thời gian của phản ứng theo Bảng 33 Cơ lập sản phẩm, tính hiệu suất và tìm thời gian thích hợp

5.2.3.2 Khảo sát trong điều kiện siêu âm

5.2.3.2.1 Bon siêu âm

Cân chính xác 0,53 mmol (100 mg) plumbagin va 0,74 mmol CH3I,

10ml CHCh, 0,5 ø AøzO cho vào ống nghiệm Tiến hành thay đổi thời gian

phần ứng là 30; 45; 60; 75; 90 và 105 phút, Cơ lập sản phẩm, tìm được hiệu

suất thích hợp theo thời gian.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Phunbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

5.2.3.2.2 Thanh siéu am

§.2.3.2.2.1 Công suất P=20W'

Cân chính xác 0,53 mmol(100 mg) phumbagin và 0,74 mmol CHạI, 10ml CHCI;, 0,5 g Ag;O cho vào ống nghiệm Tiến hành phản ứng với công suất siêu âm P=20 W, thay đổi thời gian phản ứng là 5; 10; 15; 20; 25; 30 phút, cô lập sản phẩm, tìm được hiệu suất thích hợp theo thời gian

5.2.3.2.2.2 Công suất P= 40 W, P= 60W, P=80W

Cố định các điều kiện như đã để cập trong mục 5.2.3.2.2.1, thay đổi công suất của thanh siêu âm trong các thí nghiệm tương ứng là P= 40 W, P = 60 W,

P= 80 W, tìm được hiệu suất thích hợp theo thời gian

5.2.4 Nhận danh sản phẩm tổng hợp

5.2.4.1 Cô lập sản phẩm

Sau khi thực hiện phản ứng, hỗn hợp được lọc qua phễu lọc xốp Loại bỏ chất rắn, thu được dung dịch

Dung dịch cho vào bình lóng, ly trích với dung dịch KOH 10%, cho đến khi lớp nước hết màu hồng Tiếp tục rửa với dung dich NaC! bao hoà cho đến khi, nước rửa có pH = 7

Làm khan lớp hữu cơ với Na;§O, khan Lọc cô quay thu hồi dung môi được chất rắn màu cam

5.2.4.1.1 Kết tỉnh lại sản phẩm

Dùng một lượng dung EuO tối thiểu, hòa tan hoàn toàn chất rắn Nhỏ từ

từ từng giọt dung môi n-hexan(khan) vao dung dich E40, cho đến khi dung

dịch trở nên đục thì ngưng Làm lạnh hỗn hợp, để tỉnh thể xuất hiện, lọc thu

được tỉnh thể hình kim màu vàng, Sản phẩm được đặt tên là S1.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

§.2.4.1.2 Định tính S1

Lấy một vài tỉnh thể của S1, cho vào ống nghiệm, hoà tan bằng dung môi CHC;, nhỏ vào 2 giọt dung dịch FeCl; 1% lắc đều, quan sát Phản ứng cho kết quả âm tính

5.2.4.1.3 Nhiệt độ nóng chẩy

Bo nhiệt độ nóng chảy của S1 trên khối nhiệt, nhiệt kế không điều chỉnh nhiệt, nhiệt độ nóng chảy của S1 là 94°C

5.2.4.1.4 Xác định sản phẩm bằng các phương pháp phổ

5.2.4.1.4.11R

Phổ hồng ngoại IR của hợp chất S1 được đo trên máy SHIMADZU IR-470

5,2.4.1.4.2 'H NMR

Phé 'H-NMR cia SI trong dung méi CDCl; ghi trén máy cộng hưởng từ hat nhan AV - 500, có tần số cộng hưởng 500 MHZ

5.2.4.1.4.3 °C NMR

Phé C-NMR két hdp vdi ky thuat DEPT ciia $1 trong dung môi CDCl, được ghi trén máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, ¢6 tn sO cong hudng 500 MHz

5.2.4.1.4.4 MS

Phổ MS của S1 được ghỉ trên máy 5989B MS

5,2.4.1.4.5 HMQC,HMBC,COSY

Phổ HMQC, HMBC, COSY của S1 trong dung môi CDCI; được do trên

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

5.2.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

5.2.5.1 Vi khuẩn

Các chúng vi khuẩn và nấm dùng trong thử nghiệm là chủng phân lập từ bệnh phẩm hay môi trường tự nhiên, do phòng thí nghiệm vi sinh miễn dịch, viện Pasteur định danh theo qui trình chuẩn của tổ chức y tế thế giới

Staphylococcus aureus (ATCC 6538)

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)

Bacillus cereus

Escherichia coli (ATCC 8739)

Streptococcus pneumoniae

Vibrio cholerae

Vibrio parahaemolytucus

Staphylococcus aureus

Salmonella enteritidis

Salmonella typhi

Candina albicans (ATCC 10231)

5.2.5.2 Phương pháp

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch nghiên 24 giờ, pha thành huyền dịch có độ đục 0,5 Mac Earland (tương đương với 1,5 10” vi khuẩn/m]), cho vào môi trường đã hấp tiệt khuẩn và giữ ở nhiệt độ 45-50C, với tỷ lệ là 0,5 ml huyền dịch vi khuẩn trong 25 mÌ môi trường, xoay nhẹ ống để trộn đều

và đổ vào đĩa petri vô khuẩn Để yên 30 phút để cho môi trường đông đặc lại

Đặt những đĩa giấy vô khuẩn có đường kính 06 mm lên mặt môi trường,

cách đều nhau và cách bờ đĩa tối thiéu 20 mm Hut 20 ul dung dich da pha loang 6 cdc néng độ khác nhau, bắt đầu từ nông độ thấp nhất, tẩm lên đĩa giấy.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Để yên đĩa môi trường ít nhất 1 giờ, sau đó cho vào tủ ấm ở 37°C Sau 24 giờ,

lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có

5.2.5.3 Môi trường

Môi trường nuôi cấy Mueller Hinton Agar (MHA): là môi trường cung cấp

đây đủ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển gồm:

- Trích tinh thịt P 3g

- Casein hydrolysate : 17.5 g

~ Tỉnh bột 3 12g

- Agar Ỳ 12g

- Nước cất i 1000 ml

5.2.5.4 Tién hanh

Ta sẽ có được nồng độ của các dung dịch bằng cách hoà tan plumbagin, cao eter dầu hỏa vào dung môi dietil ether

Dung dịch được pha với các nồng độ như sau :

- C¡ = C/10 (mg/Hl)

- Co= Co/100 (mg/ul)

- C3=Co/1000 (mg/ml)

- Cy=Co/10000 (mg/ml)

5.2.5.5 Doc két qua

Sau 18 gid ủ, đọc kết quả dựa trên sự hiện diện của nhóm vi khuẩn tại

điểm chấm Xác định hộp có nông độ thấp nhất ức chế vi khuẩn (không có khóm vi khuẩn mọc), nồng độ của hộp này chính là MIC của chất thử đối với

vi khuẩn tương ứng.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Kết quả này chỉ có giá trị khi có sự xuất hiện khóm mọc một cách bình thường của các vi khuẩn trên mẫu đối chứng.