Nghiên cứu li trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà

Nghiên cứu li trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà

PHAN 3:

NGHIEN CUU

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumnbagin từ rễ

Vấn để cơ bản của mọi ly trích các hợp chất có trong tự nhiên là chọn dung môi và phương pháp ly trích Trong phần nghiên cứu này chúng tôi áp dụng 2 phương pháp kích hoạt phản ứng trong hóa học xanh là: Vi sóng và siêu vào việc tẩm trích các hợp chất tự nhiên

Chọn cây bạch hoa xà ở Việt Nam làm đối tượng nghiên cứu Xem xét sự tác động của vi sóng, siêu âm đến việc lấy kiệt hết plumbagin ra khỏi nguyên

liệu thực vật

Chúng tôi chọn cây bạch hoa xà làm tiêu điểm cho việc ly trích theo các

phương pháp mới bởi vì:

Cây Bạch hoa xà dễ tìm, mọc khắp nới ở Việt Nam

Plumbagin là cấu phần chính trong rễ cây bạch hoa xà, các thành phần khác chiếm tỷ lệ không đáng kể để có thể gây ảnh hưởng đến việc ly trích Trong việc ly trích thì dung môi là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất ly trích Chúng tôi chọn dung môi eter dầu hoả (60-90°C) làm dung

môi tẩm trích, việc này hoàn toàn dựa vào các tài liệu tham khảo của các tác

giả trước đây ở trong nước cũng như ngoài nước, đã chọn dùng làm dung môi

cho việc ly trích plumbagin tiv rễ cây Bạch hoa xà.

40

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà Một điều may mắn là eter dầu hỏa thuộc loại dung môi không phân cực, khi tẩm trích bằng vi sóng, dung môi không nóng lên, do đó có thể xem như dung môi không bị ảnh hưởng của việc chiếu X Vi sóng

Chọn dung môi eter dầu hoả để ngăn ngừa bớt các thành phần phân cực không phải là plumbagin tan vào trong dung môi, làm khó khăn cho việc tỉnh chế plumbagin Plumbagin tan tốt trong dung môi eter dầu hỏa Eter dầu hỏa

là dung môi rẻ tiền, ít độc hại,

Thực hiện 4 phương pháp tẩm trích: 2 phương pháp cổ điển là Soxhlet, siêu âm, 2 phương pháp mới là vi sóng và siêu âm Sau khi tẩm trích, thực hiện

Việc sO sánh ;

- Khối lượng cao

- Thời gian ly trích để có khối lượng cao lớn nhất

- So sánh chất lượng của cao thông qua phần trăm plumbagin trong cao 2.2 Nội dung nghiên cứu

Trong vấn để ly trích chúng tôi dùng một lượng bột rễ của plumbagin

bằng nhau Tiến hành ly trích theo các phương pháp cổ dién 1a Soxhlet, khuấy

từ và hai phương pháp mới là: vi sóng, siêu âm để có được các loại cao eter dầu hoả Tìm thời gian để có lượng cao tối đa theo các phương pháp ly trích Trên cơ sở các lượng cao cực đại theo thời gian, chúng tôi tiến hành xem xét chất lượng của cao thông qua các phép phân tích định lượng plumbagin

trong cao mà chúng tôi chọn là UV, sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), ngoai

ra khi tiến hành sắc ký cột trên silicagel để cô lập plumbagin thi đây cũng

được xem là một phương pháp định lượng plumbagin.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Cuối cùng đánh giá hiệu quả của các phương pháp ly trích mới so với

phương pháp truyền thống là Soxhlet, khuấy từ, đối chiếu với các tài liệu đã làm trước đây, đề xuất các phương pháp ly trích mới

2.3 Nguyên liệu

Cây bạch hoa xà được thu hái vào tháng 03/2001, tại xã Tam An, huyện Long Thành, tỉnh Đồng Nai Chúng tôi khảo sát trên toàn bộ rễ cây Rễ cây

hái về được rửa sạch, phơi khô đến trọng lượng không đổi Sau đó sấy khô ở

nhiệt độ 50°C, sau đó đem xay mịn

2.4 Định tính sơ bộ những chất có trong bột rễ và trong cao eter dầu hỏa

Bột rễ + eter dầu hỏa (60-90°C)

Dung dịch eter dầu hỏa

_—— Cao eter dầu hỏa

Sơ đồ 1 : Ly trích plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà

42 Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

2.4.1 Xác định sự hiện diện của flavon:

Flavon là hợp chất thường gặp trong thực vật, có cơ cấu sườn phenil benzopiron

2-Phenilbenzopiron Các vòng thường mang một hoặc nhiều nhóm hidroxi tự do Vì vậy về tinh chất chúng là các poliphenol, nên có tính acid Độ hoà tan flavon phụ thuộc nhiều vào nhóm hidroxi và các nhóm thế khác của chúng

Flavon được biểu tính bằng phản ứng Shibata hay còn gọi là phản ứng Cianidin của Wilstatter Thuốc thử HCI đậm đặc, bột Mg kim loại và alcol isoamil

Thực nghiệm: Nấu sôi mẫu bột rễ hoặc cao eter dầu hoả, trong nước cất khoảng 10 phút Để nguội lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử Cho mẫu thử vào 2

ống nghiệm Ống thứ nhất dùng để đối chứng, ống thứ hai thêm HCI đậm đặc

và một ít Mg kim loại, rồi thêm từ từ alcol isoamil theo thành ống nghiệm Đun nhẹ, có một vòng màu hồng xuất hiện rồi chuyển sang màu đỏ tím, chứng tỏ có

sự xuất hiện của flavon.

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

2.4.2 Xác định sự hiện điện của sterol

Sierol là những hợp chất hữu cơ dạng tỉnh thể không màu, có nguồn gốc thực

vật hay động vật chứa ít nhất một nhóm hidzoxi, thường ở C-3, có 29 C và có

khung cơ bản ciclopentanoperhidrophenantren

Sterol là những chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dung

môi hữu cơ không phân cực như eter etil, hexan, benzen, cloroform nên các dung môi này thường dùng để lý trích sterol

Sterol được xác định dựa trên phản ứng màu với các thuốc thử sau:

~ [iebermann- Burchard : anhidrid acetic (20 ml), H;§O, đậm đặc

(1ml) Nếu xuất hiện màu xanh nhạt, lục,hồng hoặc đỏ là phản ứng

đương tính

- Salkowski : H;ạSO¿ (đđ), nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính,

+ Thực nghiệm : Hoà tan mẫu trong CHCI; Lọc lấy địch lọc làm mẫu

thử với các thuốc thừ trên.

44 Nghién citu ly trich va diéu ché ddn xudt cia Plumbagin từ rễ

Mau thy T Thuốc thử Kết luận — Ì

2.4.3 Xác định sự hiện diện của tanin

Tanin hay acid tanic là một poliphenol (hỗn hợp các acid polihidroxi~ benzoic) thường gặp trong thực vật Mặc dù thành phân hoá học rất thay đổi nhưng chúng thường có tính chất chung như sau:

-_ Làm kết tủa một số protein đặt biệt là gelatin, albumin

~_ Làm kết tủa một số baz hữu cơ như alkaloid

Với muối kim loại nặng, tanin cho nhựa với các màu sắc khác nhau,

đặc biệt với muối Fe", tanin cho màu xanh lá cây hoặc xanh đậm

~ _ Tan trong nước (dung dịch có tính acid), aleol, acetat etil Thường ở dạng vô định hình, xốp, có màu từ vàng nhạt đến nâu và sâm dưới

nễn ảnh sáng và không khí Để xác định tanin chúng tôi dùng các thuốc thử sau:

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rỗ

Thuốc thử Hiện tượng phản ứng dương tính

Stiasnt ; Formol 36% (20 ml), HC! Trầm hiện vô định hình màu đỏ đậm đặc (10 ml)

Dung dịch gelatin mặn: 2 g gelatin | Trầm hiện vô định hình màu vàng,

/100 g dung dịch bão hoà để lâu hoá nâu

Dung dịch acetat chì bão hoà Trầm hiện màu vàng dạng bột

Dung dich FeCl; 1% Trầm hiện xanh đen

2.4.4 Xác định sự hiện diện của glicosid

Glicosid là chất hữu cơ có nguồn gốc thực vật, có cơ cấu gồm phần đường (glucoz, fructoz, rhamnoz, galactoz, ) va phần không đường hay còn gọi là aglicon hay genin Trong thực vật, glicosid tổn tại dưới dạng hòa tan trong tế

bào Dưới tác dụng của men hoặc acid, glicosid đễ dàng bị thủy phân cho

thành phần aglicon và phần đường

Độ tan của glicosid phụ thuộc vào số đường hiện diện trong phân tử

Glicosid có một nhóm đường (monoglicosid) hòa tan trong các dung môi ít

phân cực như CHC]ạ, acetat etil Glicosid có nhiều nhóm đường trong phân tử

(poliglicosid) hòa tan trong các dung môi phân cực như EtOH, n-butanol, nước.

- Phan ứng Baljet : Dùng dung dịch acid picric 1% trong aleol Phẩn

ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng cam hoặc đỏ sẫm

~ _ Phản ứng Molish : 1-2 giọt tìmol xanh 2%, H;SO, đậm đặc (1ml) phần ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ

Bảng 10; Kết quả xác định sự hiện diện của glicosid trong rễ và trong cao

2.4.5 Xác định sự hiện diện của alkaloid

Alkaloid là những chất hữu cơ có nguồn gốc thực vật hoặc điểu chế do tổng hợp, có tính baz, chứa ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử và có được tính Các hợp chất alkaloid không tham gia một cách đáng kể vào hoạt động của tế bào của cơ thể chủ, nhưng lại có độc tính cao hoặc hoạt tính sinh học đặc biệt

với sinh vật và các cơ thể khác

Hầu hết alkaloid tự do có tính baz và không tan trong các dung môi hữu

cơ như : cloroform, dietil eter, benzen

Thực nghiệm: Để định tính alkaloid chúng tôi tiến hành theo phương

pháp sau: ngâm nguyên liệu trong dung địch H;SO, 3%, đun nhẹ ở 80°C trong

6 giờ Sau đó lọc lấy dung dịch để thử với các thuốc thử sau:

- Thuốc thử Bouchardat: 1; (2,5 g), KLG ø), HO (10 mÙ), phần ứng,

dương tính cho trầm hiện màu nâu.

Nghiên cứu ly trích và điêu chế dẫn xuất của Plưnbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

~_ Thuốc thử Mayer : HgCl; (1,36 g), KI (5 g), HzO (100 ml) Hoà tan HẹC]; trong nước cất (60ml) và KI trong nước cất (10ml) Trộn đều hai dung dịch và thêm HạO đủ 100 ml Phản ứng dương tính cho trầm hiện màu vàng nâu

-_ Thuốc thử Hager: Dung dich acid picric bão hoà trong H;O Phản ứng dương tính cho trầm hiện màu trắng

- Thuốc thử Bertrand: acid slicotungsti (5 g), HạO (100ml) Phản ứng dương tính cho trầm hiện màu trắng (đun nhẹ trầm hiện màu nâu) Bảng 11: Kết quả xác định sự biện diện của alkaloid trong rễ và trong cao

2.4.6 Xác định sự hiện điện của quinon

Quinon là điceton bất bão hoà khi hoàn nguyên chúng biến thành poliphenol, poliphenol dễ dàng bị oxid hoá cho trở lại quinon Quinon là

những hợp chất có màu (vàng, cam, đồ, tím) đã góp phần tạo nên màu sắc của

thực vật

Dựa trên sản phẩm khử của quinon, người ta chỉa quinon thành các nhóm chính: benzoquinon, naptoquinon, antraquinon.

Benzoquinon Naptoquinon Antraquinon

Trong đó benzoquinon và naptoquinon là chất không phân cực nên tan

trong các dung môi không phân cực như eter, benzen, cloroform Các

antraguinon do thường mang nhiều nhóm -OH phenol nên nói chung chúng là những chất phân cực mạnh Chúng tan được trong nước nóng, rượu và các dung dịch kiểm

Chúng tôi sử dụng phan ting Bortrager để phát hiện quínon

Thực nghiệm: Lấy vài mg mau hoa tan trong dung dich KOH 2,5% Dun

nóng trong 10 phút, để nguội Acid hóa dung dịch và ly trích với benzen Tách

lớp benzen, cho vào benzen một thể tích tương đương dung dịch KOH, lắc đều Nếu lớp benzen mất màu và lớp KOH có màu đỏ đó là phản ứng dương tính Bảng 12: Kết quả xác định sự hiện diện của quinon trong rễ và trong cao

| Mẫu thử Phan ting Bortrager Két luan

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

2.5 Các phương pháp ly trích

2.5.1 Dat van dé

Chúng tôi tiến hành ly trích plumbagin theo phương pháp cổ điển như

phương pháp trích Soxhlet, khuấy từ Trên cơ sở đó chúng tôi áp dụng phương

pháp ly trích mới đó là vi sóng và siêu âm Để có thể so sánh được sự khác

nhau giữa phương pháp cổ điển và mới chúng tôi cố định một lượng bột rễ (20 g) trong cả 2 phương pháp với tỷ lệ giữa bột rễ và dung môi là rễ : dung môi eter dâu hỏa là 1:10 Tiến hành ly trích theo thời gian để có được khối lượng

cao lớn nhất trên bốn phương pháp.

Nghién citu ly trích và điều chế dẫn xuất của Phumbagin từ rễ

nêu trên, khối lượng cao, hiệu suất cao được ghi trong Bảng 13

Bảng 13: Khối lượng cao eter dầu thu được bằng phương pháp Soxhlet lớn

Cho 20 g bột rễ vào bọc giấy và 200 ml dung môi eter dầu hỏa vào bình

cầu 500 ml đun liên tục trong 33 giờ Trong điểu kiện được nêu trên, khối

lượng cao eter dầu hoả và hiệu suất cao được ghi trong Bảng 14

Bảng 14: Khối lượng cao eter dầu hỏa thu được bằng phương pháp Soxhlet nhỏ

có kích thước khác nhau là như nhau Vậy việc ly trích trong các dụng cụ khác nhau không ảnh hưởng đến hiệu suất cao

Bảng 15: Khối lượng và hiệu suất cao thu được bằng phương pháp khuấy từ ở nhiệt độ phòng theo thời gian

Khối lượng (g) 0,1729 | 0.1880 | 0,1941 | 0.1963 | 0.2212 | 0.2218 Hiệu suất (%) 0,86 0,94 0,97 0,98 111 111 Khối lượng cao cực đại sau 18 giờ khuấy từ là 0,2212 g với hiệu suất cao là 1,11%

Nghién citu ly trich và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

Cho 20 g bột rễ cây bạch hoa xà và 200 ml dung môi eter dầu hỏa vào

erlen 500 ml Khuấy từ và đun ở 50°C liên tục trong những khoảng thời gian nhất định, thu được kết quả được trình bày trong Bảng 16

Bảng 16: Khối lượng và hiệu suất cao bằng phương pháp khuấy từ có đun thu được theo thời gian

54

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Qua kết quả Bảng 15 và 16, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến

hiệu suất cao, khuấy từ ở nhiệt độ phòng cho hiệu suất cao cực đại là 1,11% sau 18 giờ Khuấy từ có đun cho hiệu suất cao cực đại là 1,5% chỉ sau 12 giờ

Dé thi 2 : Khối lượng và hiệu suất cao bằng phương pháp khuấy từ có đun thu

được theo thời gian

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Phumbagin từ rễ

56 Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

2.5.2.4 Phương pháp siêu âm

Cho 20 g bột rễ cây bạch hoa xà vào 200 ml dung môi eter dầu vào erlen

500 ml Dat erlen vào bổn siêu âm (Phụ lục số 34), sau khi thực hiện siêu âm ở những khoảng thời gian khác nhau ta thu được khối lượng và hiệu suất cao tương ứng, được biếu diễn ở Bảng 18

Bảng 18: Khối lượng và hiệu suất cao thu được bằng phương pháp siêu âm theo thời gian

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin tit ré

cây Bạch hoa xà

Đổ thi _4: Khối lượng và hiệu suất cao thu được bằng phương pháp siêu âm

theo thời gian,

2.6 Biện luận kết quả

“Theo các phương pháp ly trích đã được khảo sát ở trên ta thu được khối

lượng cao eter đầu hỏa tối đa theo các phương pháp ly trích được tóm tắt trong

Bang 19

Bang 19: So sánh hiệu suất tối đa cao eter dầu hỏa thu được theo thời gian của

các phương pháp ly trích

58 Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plunbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Xét về yếu tố thời gian thì phương pháp vi sóng có thời gian ngắn nhất, phương

pháp Soxhlet cho thấy thời gian ly trích là dài nhất Biến thiên tỷ lệ về thời

gian của các phương pháp tăng tuyến tính theo trình tự sau :

Vi sóng : siêu âm : khuấy từ : Soxhlet =1: 26,67 : 40: 110 (1)

Xét về yếu tố hiệu suất cao thì phương pháp vi sóng cũng cho kết quả cao là

lớn nhất Biến thiên tỷ lệ về % cao của các phương pháp giảm theo trình tự sau:

Ví sóng : Soxhlet: khuấy từ : siêu âm = 1,36 :1,3 :122 : 1 (2)

Xét về cả yếu tố thời gian ly trích và yếu tố khối lượng cao chúng tôi nhận

thấy phương pháp vi sóng cho hiệu suất cao là cao nhất Phương pháp Soxhlet

và khuấy từ thời gian quá dài mà khối lượng cao cũng chỉ bằng vi sóng hoặc

thấp hơn

Vấn để cần lưu tâm ở đây là hiệu suất cao biến thiên theo (2) nhưng chất

lượng plumbagin trong các phương pháp có biến thiên tương tự (2), không, thì

phải đánh giá thông qua % plumbagin có trong cao (chất lượng cao), điều này

chúng tôi sẽ trình bày trong phần định lượng plumbagin có trong các loại cao ở mục 2.7

2.7 Xác định hàm lượng plumbagin

2.7.1 Đặt vấn để

Để đánh giá chất lượng cao (%plumbagin trong cao) của các phương

pháp ly trích chúng tôi tiến hành định lượng plumbagin trong cao Đã có nhiều

tài liệu về các phương pháp định lượng plumbagin trong cao như sắc ký cột”,

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin tit ré

cây Bạch hoa xà

Trong phần này chúng tôi để xuất hai phương pháp định lượng là UV và

LC-MS, ngoài ra phương pháp cô lập plumbagin sẽ để cập ở mục 2.8 cũng là một phương pháp định lượng

2.7.1.1 Phương pháp phổ tử ngoại (UV)

Để xác định hàm lượng plumbagin trong các các loại cao, tiến hành theo các bước sau:

- _ Xây dựng đường chuẩn

- Do mat d6 quang

- Dinh lượng plumbagin trong các loại cao theo các phương pháp lý

trích

2.7.1.1.1 Nguyên tắc

Plumbagin có phổ đổ đặc trưng ở độ dài sóng hấp thu 422 nmÉ?”l, Chúng

tôi dùng phương pháp đo quang phổ UV để định lượng hàm lượng plumbagin

trong các cao dựa trên chất chuẩn là plumbagin 99,9% (Aldrich)

Đo mật độ quang A của các dung dịch có nỗng độ plumbagin chuẩn xác định, xây dựng đường chuẩn Từ đó với bất kỳ loại cao nào có chứa plumbagin được mật độ quang A cùng bước sóng của plumbagin chuẩn là

422 nm, rồi dựa vào đường chuẩn suy ra được nồng độ plumbagin trong các

loại cao

2.7.1.1.2 Xây dựng đường chuẩn

Cân chính xác 10 mg plumbagin tỉnh khiết (99,9%) rồi dùng dung môi cloroform (99%) pha thành các dung dịch có nồng độ C¡= 0,1mg/ml Từ dung dịch C¡ pha ra dung dịch Cạ= 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05 mg/ml.

60

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Bảng 20: Nồng độ plumbagin được pha theo các thể tích tương ứng để đo mật

độ quang xây dựng đường chuẩn

0,5 5 0,05 10

Mật độ quang A của các dung dịch được pha ở nồng độ Cạ ở bước sóng 422

nm Két qua được trình bay 6 Bang 21

Bảng 21: Mật độ quang của các dung dịch C;

Nghiên cứu ly trích va điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

-Dang d6 thị 5 được xử lý bằng phần mềm ORIGIN50

- Phương trình đường chuẩn : y = 21.91x - 0.0021 (3)

- y : mật độ quang ; x: nồng độ plumbagin trong mẫu đo

- Hệ số tương quan của mô hình: R = 0.99996

- Độ lệch chuẩn SD = 0.00359

- Số thí nghiệm N= 5

- Độ tỉnh cậy : P.< 0,0001

- Công thức tính nồng độ % plumbagin trong cao ‘MPa GB’)

~ Cạ : Nông độ pha ban đầu để đo mật độ quang

-€ : Nồng độ tính từ phương trình hồi qui (3)

62

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

2.7.1.1.3 Định lượng plumbagin trong các loại cao

Cao được hút ẩm, sấy khô đến trọng lượng không đổi Cân chính xác mỗi loại cao, hoà tan hoàn toàn trong CHC], trong bình định mức 25 ml, được dung

dich có nồng độ Cạ (mg/ml)

Từ các dung dịch có nồng độ C¿, lấy Iml dung dịch cho vào bình định mức đủ 10 ml, thu được dung dịch có nồng độ Cạ Đo mật độ quang của các dung dịch có nồng độ Ca

Dựa vào đường chuẩn suy ra nỗng độ plumbagin có trong dung dich C, va hàm lượng plumbagin trong các loại cao

Kết quả hàm lượng plumbagin trong các loại cao được xác định bằng

phương pháp phổ tử ngoại UV được trình bày trong Bảng 22

Bảng 22: Mật độ quang, nông độ và các hàm lượng % plumbagin trong các

loai cao eter dầu hỏa (Phụ lục số 1, 2, 3, 4)

Phương pháp Soxhlet | Khuấy từ | Siêu âm | Vi sóng

Khối lượng cao (g) 0/0104 | 0/0104 | 0/0138 | 0/0110

| Nông độ pha để đo ABS(mg/ml) 0/0416 | 0,0416 | 0,0552 0,0440 Mật độ quang (ABS) | 0.226 0.275 | 0,514 | 0,334 |

Aghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Phunbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

Siêu âm : Vi sóng : Khuấy từ : Soxhlet = 1,71 1,4 :1/2:1 (4)

Phương pháp siêu âm và phương pháp vì sóng cho hiệu suất cao cao nhất, nhưng phương pháp siêu âm thời gian dài hơn phương pháp vi sóng, Bảng 19,

phương pháp cổ điển Soxhiet cho hiệu suất p[umbagín là thấp nhất

Từ Bảng 19 cũng cho ta nhìn nhận một vấn để rất có ý nghĩa: khối lượng

cao thu được của hai phương pháp ly trích Soxhlet và vì sóng là tương đương

nhau Nhưng hầm lượng plumbagin thì khác xa nhau rất nhiều, vi sóng :

Soxhlet là 1,4 : 1 Điểu này không đồng nghĩa với hiệu suất cao tăng lên là

plumbagin trong cao tăng lên tương ứng

Sự khác biệt về khối lượng cao theo hai phương pháp này có thể được lý

giải, do phương pháp Soxhlet thực chất là phương pháp tấm trích, thời gian kéo dài, các thành phân khác không phải là plumbagin đã hoà tan vào dung môi,

làm tăng khối lượng cao, nhưng không tăng lượng plumbagin cho dù thời gian

có kéo dài hơn nữa, Trong khi đó phương pháp vi sóng thời gian chiếu xạ rất ngấn, các thành phẩn khác không phải là plumbagin không kịp tan vào dung dich, do đó sự tăng khối lượng cao trong vì sóng thực chất là sự tăng

plumbagin, do plumbagin là hợp chất phân cực do đó ảnh hưởng mạnh dưới tác

động của vi sóng

2.7.1.2 Bằng phương pháp sắc ký lồng ghép phổ khối (LC-MS)

3.7.1.2.1 Nguyên tắc

Dựa vào phương pháp LC-MS và plumbagin chuẩn, chúng ta có thể xác

định được hàm lượng plumbagin có trong các loại cao eter dầu hỏa.

64

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

2.7.1.2.2 Xây dựng đương chuẩn

Cân chính xác plumbagin chuẩn, sau khi cân pha trong 10 mÌ dung môi

metano] với các nổng độ Dạ, Dạ, Dạ, D; (Phụ lục số 5, 6, 7, 8) Bơm từng dung địch có nổng độ đã pha vào máy, máy cho 4 sắc ký đổ, trên đó xác định được diện tích mũi hấp thu tương ứng với các nông độ plumbagin, Từ số liệu này ta xây dựng được đường chuẩn của plumbagin (đồ thị 6)

Bảng 23: Diện tích mũi hấp thụ, nồng độ mẫu plumbagin

C(mg/ml) | Diện tchpeak(S) |

02513 215,300 _— 0/3103 310,300 0.5843 584,300 0/6214 _ 621400

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

- Phương trình đường chuẩn : y = 1000x + 5,68434.107* (5)

-y: Diện tích ; x: nỗng độ plumbagin

Bảng 24: Hàm lượng plumbagin thu được theo phương pháp LC-MS (Phụ lục

Phương pháp Soxhlet | Khuấy từ | Siêu âm | Vi sóng

Khối lượng (g) 0/3158 | 0,3012 0/2452 | 0/3341 Phần trăm plumbagin (%) 32,10 33,30 38,50 35,10

Bảng 24 cho thấy tỷ lệ biến thiên của đại lượng % plumbagin gidm theo trình tự: Siêu âm : vi sóng : khuấy từ : Soxhlet = 1,20 :1,1 : 1,03 : 1 (6) Phương pháp siêu âm hàm lượng plumbagin là cao nhất, tiếp đến là phương pháp vi sóng, hai phương pháp cổ điển cho hiệu suất plumbagin là

tương đương nhau.Tuy nhiên nếu xét về yếu tố thời gian (bảng 18), tỷ lệ về

'Từ biểu thức (4) và (6), ta thấy kết quả của phép phân tích có sự biến

thiên tương tự nhau về tỷ lệ % plumbagin trong các phương pháp ly trích Cho

nên ta có thể xem kết quả của hai phương pháp định lượng plumbagin là UV,

LC-MS là như nhau, không có sự khác biệt của hai phương pháp

2.7.1.3 Biện luận kết quả và đánh giá biệu quả của các phương pháp ly

trích

2.7.1.3.1 Biện luận kết quả

Bắng 25 : Kết quả định lượng theo UV và LC-MS của các phương pháp ly

Tr : Tỷ lệ qui đổi trên khối lượng cao

%Pyy: Phan tram plumbagin trong cao theo phương pháp UV

T, :Tỷ lệ qui đổi trên thời gian

%PLcaus: Phần trầm plumbagin trong cao theo phương pháp LC-MS

Tapuv; : Tỷ lệ qui đổi trên đại lượng %Puv

Nghiên cứu ly trích và điều chế dẫn xuất của Plumbagin từ rễ

cây Bạch hoa xà

T%pacws;: Tý lệ qui đổi trên đại lượng %Ptc.ws

Theo tác gid Selma Ribeiro de Paiva!?! cùng cộng sự.(2003) đã tiến hành

ly trích theo phương pháp ly trích Soxhlet Đun 450 ø nguyên liệu rễ Plumbago zeylanica trong 30 giờ, dung môi eter dầu hoả (60-90°C), thu được 7,5 g cao

Tiến hành sắc ký cột 5 gam cao, với hệ dung ly : n- hexan : EtOAc = 98 : 2 thu

được 1,18 g plumbagin Hiệu suất plumbagin trong cao: 23,6%

Kết quả trong Bảng 24 của phương pháp trích cổ điển Soxhlet khi định

lượng bằng UV có sự tương đương về kết quả, khi so sánh với tài liệu"?!

So sánh dữ liệu của Bảng 24 của phép định lượng bằng UV trên các loại cao thì, có sự khác biệt về kết quả Điều này có thể do những nguyên nhân

sau:

- Phương pháp UV khi chọn cực đại hấp thu ở budc song 4 = 420 nml8! thi plumbagin hap thu cực đại, nhưng các hợp chất có cơ cấu 1,4-naptoquinon không phải là plumbagin cũng hấp thu ở bước sóng này, gây tín hiệu nhiễu

- Theo tài liệu chúng tôi tham khảo, trong rễ cây bạch hoa xà ở Việt

Nam mà các tác giả đã làm trước đây, tổng số các cấu phần không phải là plumbagin chiếm 18,14%

Do đó ta có thể tính được sai số do các thành phần không phải là plumbagin đã hấp thu ở bước sóng nều trên lớn nhất là :+6,0%

- Việc tính toán nồng độ plumbagin trong mẫu theo UV, thông qua phương trình hổi qui tuyến tính (3) cũng có mang mang sai số ngẫu nhiên

~_ Ngoài ra có trong rễ cây bạch hoa xà thu hái ở Tây Ban Nha, có hàm lượng plumbagin thấp hơn so với ở Việt Nam do điểu kiện sinh thái, thổ nhưỡng, thời gian thu hái, mức độ già non của rễ Do đó kết quả phân

tích của chúng tôi là phù hợp.

quan giữa diện tích mũi hấp thu và C rất tốt (hệ số tương quan mô hình , R=1),

không mắc sai số ngẫu nhiên Kết quả định lượng plumbagin theo LC-MS là phù hợp hơn phương pháp UV

Tuy nhiên để định lượng nhanh plumbagin trong cao thì ta nên dùng phương pháp đo UV, vì phương pháp này chỉ phí đâu tư thấp, sai số của phép

đo không lớn + 6,0%

2.7.1.3.2 Đánh giá hiệu quả của các phương pháp ly trích

Xét về yếu tố thời gian ly trích:

Vi sóng : siêu âm : khuấy từ : Soxhlet = 1 : 480 : 720 : 1980

Phương pháp vi sóng có thời gian ly trích ngắn nhất, phương pháp ly trích

Soxhlet chiếm thời gian dài nhất

Xét về yếu tố chất lượng cao :

Vi sóng : siêu âm : khuấy từ : Soxhlet = 1,1: 1,2: 1.03: 1

Chúng tôi nhận thấy % plumbagin theo các phương pháp ly trích gần như biến thiên nghịch biến với yếu tố thời gian, thời gian ly trích càng dài, thì gần như hàm lượng plumbagin không tăng hoặc giảm đi Điều này có thể được giải thích do plumbagin khi ly trích trong thời gian dài với nhiệt độ cao dễ bị phân hủy hoặc chuyển hoá thành thành phần khác

Xét về quan hệ giữa khối lượng cao, chất lượng cao, chúng tôi nhận thấy hàm lượng plumbagin trong cao không tăng tuyến tính theo khối lượng cao

(Bảng 25).