Tổng quan về điều chế Chitosan theo phương pháp hóa sinh

Tổng quan về điều chế Chitosan theo phương pháp hóa sinh

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

LỜI MỞ ĐẦU

Tôm là sản phẩm xuất khẩu chính của nước ta Hàng năm, tôm đông lạnh xuất

khẩu khoảng 50.000 tấn thành phẩm đồng thời cũng tạo ra khoảng 20.000 tấn phế liệu (phế liệu chiếm khoảng 40 % nguyên liệu) Phế liệu chủ yếu là đầu và vỏ tôm

Nhằm mục đích nâng cao giá trị phế liệu tôm đông lạnh và giảm ô nhiễm môi trường, nhiều cơ quan nghiên cứu đã sử dụng đầu và vỏ tôm cua để điều chế chitosan đùng làm vô bọc thuốc bột và làm chất tạo màng bảo quản thủy hải sẵn

và rau quả Tuy nhiên các công trình nghiên cứu này sử dụng một lượng lớn HCI,

NaOH nồng độ cao và đun nóng ở nhiệt độ trên 100°C nên cần phải có thiết bị đặc biệt chịu được tác dụng của acid-kiểm

Nhằm khắc phục những nhược điểm trên, trong để tài này chúng tôi dùng

phương pháp hóa sinh để điều chế chitosan qua 2 giai đoạn:

-Khử muối vô cơ với các chủng vi sinh vật thuộc giống Baciilus ở nhiệt độ

thường

-Phân giải protein và cắt nối peptid trong chitin với enzym protease ở nhiệt độ thường

=ễễễễ-ễễễ

GVHD: GS.TS TRẦN KIM QUI HVTH: NGUYÊN NGỌC THỦY

1 NGUỒN GỐC, PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHE CHITIN

1.1 Nguồn gốc

Chitin có tên khoa học là B-(1>4)-2-acetamido-2- deoxy-D-glucose, con cé tên khác là N-acetyl-D-glucose |?" ,

Chitin có công thức phân tử (CạH;,;NO¿),,

Trong đó C 47,29%; H 6,45%; O 39,37%; N 6,89%

CHạ

OH Oo OH

NH

HO O Oo HO $

os OH °=(

CHạ CHạ

Hình 1: Cấu trúc của chitin

Chitin có rất nhiều trong tự nhiên chỉ sau cellulose

Chitin được tìm thấy chủ yếu ở hai nguồn sau đây:

e Từ động vật bậc thấp

Chiun là chất hữu cơ chủ yếu trong vỏ mai ( bộ xương ngoài của động vat không xương sống)

Theo Richard !??Ì chitin được tìm thấy trong lớp vỏ cutin của loài chân đốt Ngoài ra chiún còn được tìm thấy trong tế bào ống của loài mực, ở lớp vỏ bao

ngoài của loài bọ cánh cứng, trong lớp vỏ mai của loài giáp xác, trong loài nhện,

bướm,

Chitin thông thường có khoảng 25 - 50 % trên lượng khan của lớp cutin, thành phần chủ yếu khác là protein và các muối calci carbonat

Thành phần chất hữu cơ trong động vật chân đốt được trình bày ở bảng 1

GVHD: GS.TS TRẦN KIM QUI HVTH: NGUYỄN NGỌC THỦY

Bảng 1: Thành phần chất hữu cơ chính trong động vật chân đốt

Nguồn Tỉ lệ phần hữu cơ trong trọng lượng khan

i Lớp nhện

2 Lớp côn trùng,

cứng

- Periplameta 35,0 -

3 Lớp bọ cánh cứng

4 Loài bướm

trùng)

3 Loài tôm cua

-Cencer 71,4 13,3

e “Từ thực vật bậc thấp

Nguồn gốc của chiủn trong thực vật giới hạn ở một số loài nấm và tảo !°Ì

Trong nấm, chiữn đóng vai trò như cellulose trong các loài cây

Người ta đã đưa ra các giả thuyết về sự hiện điện của chitin hodc cellulose

làm cơ sở cho mối liên hệ phát sinh giữa các nhóm của giống nấm đặc biệt là

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYÊN NGỌC THỦY

Phycomecetus Qua phan tich bing tia X, Frey WS) aa xde nhan ring chitin va cellulose không hiện diện đồng thời

Chitin hiện diện trong tảo xanh, bằng phương pháp vì hóa học Roelofsen và Hoette |"! 4a tim thay chitin trong nấm men, Kreger cũng thu được chitin trong

một số loài nấm men bằng nhiễu xạ tia X

Chitin khéng hiện điện một mình trong lớp vỏ ngoài của loài nấm mà nó được

liên kết với những thành phần khác Lượng chiún được tỉnh chế từ loài nấm thông

thường 3% - 5%

Chitin được tính chế bằng cách thủy phân với dung dịch acid, Kreger cho rằng

35% lượng chitin thô có thể thu được từ loài Agaricus LÍ bỡi nhiễu xạ tia X

1.2 Phương pháp điều chế

Chitin tén tai trong tự nhiên dưới dạng kết hợp với protid và calci carbonat

Do đó cần phải dùng những tác động mạnh để tách các chất này ra khdi chitin

Những phương pháp này có thể gây ra sự phân hủy một phần chiún, khó mà thu được sẵn phẩm nguyên vẹn không bị phân hủy

Phương pháp điều chế chiún bao gồm 2 giai đoạn:

e Giai đoạn |: Những phần tử vô cơ thường bị loại đo tác đụng của acid

võ cơ loãng hoặc enzym hòa tan muối vô cơ

ø_ Giai đoạn 2: Prold và các hợp chất hữu cơ khác bị loại do tác dụng của kiểm hoặc enzym protease

Hackman cho biết chỉ có 6,6% chitin bi thdy gidi thanh 2-acetamido-2-deoxy-

D-glucose đo tác dụng với HCI 2N ở 100°C trong 7 giờ và chỉ có 1,3% nhóm acetyl trong chitin bi khử do tác dụng của NaOH 1N ô 100°C trong 48 giờ

Có nhiều phương pháp điều chế chiủn

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

1.2.1 Phương pháp Hackman, |"!

Vỏ tôm

(220g)

1 Ngâm trong 21 HCI, ở Ú phòng, trong 5 giờ,

2 Rửa và sấy phần không tan

3 Nghiễn thành bột

¥

Vỏ tôm xử lý lần 1

1 Ngâm trong 0,51 HCI 2N, ở LÝ phòng,

trong 45 giờ,

2 Phần rấn rửa kỹ

ká

Vỏ tôm xử lý lần 2 ety

1 Ngâm trích trong Ô,5I NaOH 1N,

ởi00ÔC, trong 12 giờ (Thực hiện 3 lần)

2 Phần rắn rửa kỹ

X

Vỏ tôm xử lý lần 3

1 Rửa bằng etanol rỗi đến eter,

2 Sấy đến trọng lượng không đổi

¥ Chitin

37,48)

Hình 2: Qui trình điều chế chiún theo phương pháp Hackman

GVHĐ:GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

Vỏ tôm được rửa sạch bằng cách cạo và rửa dưới vòi nước chảy rổi sấy khô

trong lò sấy ở 100°C, Lượng dùng là 220g được ngâm trong 2l HCI 2N trong 5 giờ

ở nhiệt độ phòng, rồi rửa kỹ với nước và sấy ở 100°C (trọng lượng còn khoảng 91,3ø) Sau đó nghiền thành bột, bột nhuyễn này được trích trong bình cầu lắc

mạnh trong 48 giờ với 0,51 HƠI 2N, ly tâm bổ phần lồng, phần rắn được rửa kỹ,

và tiếp tục được chiết bằng cách lắc mạnh trong 12 giờ với 0,51 NaOH IN ở 100°C, qui trình trích trong dung dịch kiểm thực hiện 3 lần, sau đó phần rắn được thu hổi và rửa nhiều lần với nước cho đến khi trung tính Cuối cùng rửa với etanol

và cter, rồi sấy khô, chiún thu được là 37,4g, hiệu suất là 17%, có dang bội màu vàng nhạt, hầm lượng N đo được là 6,8% so với lý thuyết là 6,9%,

1.2.2, Phương pháp WISTLER và BENHLLER !*

Vỏ tôm được rửa sạch, sấy khô trong lò sấy chân không ở 50 °C Dùng 500g

xay nhuyễn rồi ngâm với dụng dịch NaOH 10% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, dụng dịch kiểm được thay đổi hằng ngày Những hại đã được loại protein được rửa với nước rồi nghiễn với etanol 95%, lọc cho đến khi phần nước lọc gần như

không màu (thao tác này dùng khoảng ỐÌ etanol 95% )

Phan rin lại tiếp tục đem nghiền với khoảng 1 lít acetone, 2,5 lit etanol va 0,51 eter, sau đó lọc những bại thu được gần như không màu, sấy khô dưới áp suất kém và được ngâm trong dung dich HCI 37%, 6 20°C trong 4 ngày Những hạt

trương phống được ly tâm tách ra 6 0 °C va rita với nước ở O?C cho đến khi hết

+?

acid Hiệu suất là 20% (100g) hàm lượng N là 7,1%

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYÊN NGỌC THỦY

1.Ngâm trong NaOH 10%, 3 ngày,

ở tŸ phòng, thay đối NaOH hằng ngày

2 Rửa sạch phần rấn,

Vỏ tôm xử lý lần 1

Nghiên với 61 etanol 95% đến khi phần nước qua nghiền gần như không màu

i

Vỏ tôm xử lý lần 2

1 Nghiên với lL acetone, 2,51 etanol, 0,51 eter đến khi nước lọc gần như không màu

2 Sấy khô dưới áp suất kém

Ỹ

Vỏ tôm xử lý lần 3

1 Ngâm trong HCI 37%, ở 20c, trong 4 ngày

2 Ly tâm lấy phần rắn và rửa đến khi trung hòa,

Chitin

(100g) |

Hình 3: Qui trình diéu ché chitin theo phucng phdp Wistler va Beniller

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

1.2.3 Phương phap ROSEMAN !'°!

Vỏ tôm được khử Ca giống như phương pháp Hackman ở trên 100g được lắc

rung cơ học trong 18 giờ với 100ml acid formic đậm đặc (90%) ở nhiệt độ phòng Loc lay phan bã, rửa kỹ với nước và xử lý trong 2 giờ với dung dịch NaOH 10%, Đem lọc, phần bã thu được có màu trắng, rửa dưới vòi nước đến khi trung tính, sau đó rửa vài lần với etanol và eter, rồi sấy khô dưới áp suất kém, hiệu suất khoảng 50-60%, hàm lượng N là 8,5%, hàm lượng acetyl là 19,2%

va (Rửa sạch, sấy khô, được khử Ca

Vỏ tôm

theo phương pháp Hackman.)

1 Lắc rung cơ học trong HCOOH 90%,

trong 18 giờ, ở t phòng

2 Rửa kỹ với nước phần bã

Vỏ tôm xử lý lần I

1 Ngam trong dd NaOH 10%, trong 2,5 gid,

61° phong

2 Rửa đến khi trung tính

v

Vỏ tôm xử lý lần 2

1 Rửa với etanol rồi eter

2 Sấy khô dưới áp suất kém

Chitin

Hinh 4: Qui trinh diéu ché chitin theo phuong pháp Roseman

—————eeE———————————————————————

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

1.3 Tinh ch&t cda chitin

Chitin 14 chất vô định hình, mầu vàng nhi, có cấu trúc tương tự cấu trúc của

cellulose 1H

Chiun tan tốt trong HCI đậm đặc, HạSO/¿ đậm đặc, H;PO, 78-97%, acid formic

khan, tan trong LÌNCS và Ca(NGCS$)¿

Chiun không tan trong HạO, acid loãng, kiểm loãng hoặc đậm đặc, trong alcol

và các dung môi hữu cơ khác, không tan trong KạCO¿ đậm dac 6 160°C

Các nghiên cứu về nhiễu xạ tia X cho thấy khi chiún bị hòa tan trong HC!

đậm đặc, sự thủy phân liên kết glycoside hầu hết xây ra tức thời, tiếp theo là sự tiêu hủy rất chậm các acetyl,

Sự thay đối triển quang trong dụng địch HCI từ -1427 đến +56° chứng tó có sự

thủy giải của chiún Điểm giống nhau của liên kết glycoside trong chitin va

cellulose dude thể hiện qua năng suất tổa nhiệt tương đương nhau (khoảng 29Kcal/mol),

Theo Sehmid, chiún có thể hòa tan một cách khó khăn trong NH: lỏng

1.4 Sự thủy giai chitin

1.4.1 Thủy giải bằng acid

Ledderhose!”! thụ được từ sự thủy phân chiún một sản phẩm dạng tính thể mà

ông gọi là glucosamin vào năm 1876,

1902, một phương pháp thủy giải nhẹ nhàng hơn tạo nên 2-acetanido-2-

dđeoxy-D-glucose Như thế cấu trúc về thành phần chính của chiún đã được cô lập 2-amino-2-deoxy-D-glucose Hydroclorid đã được tách rời với hiệu xuất 60-

70% do sự thủy phân chiún từ của với acid HCI đậm đặc 5L

GVHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

1.4.2 Thay giải bằng enzym

Với chế phẩm enzim từ một ốc sên, Hackman đã thu được một lượng 44% tinh thể 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose và chỉ 0,5% 2-amino-2-deoxy-D-glucose từ chitin

Trong thí nghiệm tương tự với một enzim H Pomaria, tính thể 2-acetamido-2-

deoxy-D-glucose thu được từ chiún của nấm men và tôm hùm với lượng tương ứng là 50% va 80%

2 Các dẫn xuat cia chitin

2.1 Acetat chitin Ê! #11

Phương pháp thông thường không sử dụng để acetyl hóa chitin được vì chitin không tan trong acid loãng

Acetat chitin tan trong acid formic và resorcinol 50% nhưng không tan trong dung dịch hữu cơ khác Chitin tan chậm trong HCI đậm đặc, HạSO¿ đậm đặc Sự

hòa tan xảy ra tức thời trong HNO; đậm đặc cho một kết tủa dễ gãy vụn là một

hỗn hợp eter acetat-nitrat của chitin

2.2 Sulfat chitin ”',

Nhitng diester sulfat cia chitin duoc diéu ché réng rai do né dugc dùng dé tổng hợp những chất đông máu Chất thường được sử dụng nhất là clorosulfonic trong pyridin, gần đây người ta sử dụng acid clorosulfonic trong 1,2- dicloroetan Những disulfat chiủn có thể có hiệu lực chống đông máu trên 20% của

heparin, chỉ kèm theo tính độc nhẹ

2.3 Chitosan !*'!,

Chitin xử lý với kiểm đậm đặc ở nhiệt đô cao, bị khử nhóm acetyl cho ra sản phẩm là chitosan

TS SN CGnñnnnn nnnnnnnnnnnn=====—————

GVHN: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

3 CAU TRUC, PHUONG PHAP DIEU CHE CHITOSAN

3.1 Cấu trúc

Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin

CHạ

OH

Hình 5 : Cau tric cla chitosan

3.2 Phương pháp điều chế

Phương pháp diéu ché chitosan bao gém 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Những phần tử vô cơ thường bị loại do tác dụng của acid vô

cơ loãng hoặc enzym hòa tan muối vô cơ

Giai đoạn 2: Protein và các hợp chất hữu cơ khác bị loại do tác dụng của kiểm hoặc enzym protease

Giai đoạn 3: Dùng NaOH 40-60% và các muối của nó hoặc enzym protease để để acetyl hóa thu được chitosan

Có nhiều phương pháp điều chế chitosan

fEn.xn.TV xuễn

| THY VIÊN |

| 001157)

GVHD: GS.TS TRẦN KIM QUI HVTH: NGUYỄN NGỌC THỦY

3.2.1 Phương pháp của Nguyễn Hoàng Hà !!?L

Vỏ tôm

1 Rửa sạch, nghiền nhỏ

+ Đun với nước theo t lệ 1:1, trong, 1-2 gIỜ, lọc

Vỏ tôm xử lý lần I

1 HCI 10%, ở t” phòng, trong 6—12 giờ

2 Lọc, rửa, sấy khô

Vỏ tôm xử lý lần 2

1 NaOH 10%, ở t thường, trong 2-3 ngày

2 Lọc, rửa, sấy khô

ŠsÚ Chitin thô

Nước Javen công nghiệp tỉ lệ 1:1, trong 30 phút

Ỹ

Chitin tính khiết

1 NaOH 40%

2 Lọc, rửa, sấy

ở 110-130°C, trong 5~8 giờ

khô

=

Chitosan

Hinh 6: Qui trinh diéu ché chitosan theo phuong pháp Nguyễn Hoàng Hà

VHD: GS.TS TRAN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

Vỏ tôm được làm sạch, nghiền nhỏ, cho vào lò nguyên liệu cùng với nước theo tỉ lệ 1:1, nấu sôi trong 1-2 giờ, lọc thu được vỏ tôm Vỏ tôm để nguội 60- 65°C réi thủy phân đạm bằng HCI 10% theo tỉ lệ 2 kg nguyên liệu :1 lít HCI, trong 2-5 giờ, hoặc enzim protease (1 kg nguyên liệu : 0,3-0,5g protease} 6 40-

70C, trong 0,5-3 giờ Sau đó cho vào dung dịch HCI 10%, ở nhiệt độ phòng, trong 2~ 6 giờ thu được phức chiún protein Tiếp theo tiến hành thúy phân phức

chitin protein bằng dung địch NaOH 10% theo t lệ 5 kg nguyên liệu : 1 lít NaOH ở nhiệt độ thường, trong 2-2 ngày thu được chiún thô Chiún thô được tẩy màu bằng javen công nghiệp theo t lệ Ikg chiún : 1 lit javen công nghiệp Sau

30 phút thu được chiún tỉnh khiết Cuối cùng chuyén hda chitin thanh chitosan bằng NaOH 40% ở 110-130°C, trong 3-§ giờ, rửa, lọc, sấy khô thu được chitosan

3.2.2 Phương pháp của Dang Van Luyến

Vỏ tôm được nghiền nhỏ, phơi khô, cho vào dung địch NaOH 3% ( theo tỉ lệ i

kg nguyên liệu : 4 lít NaOH ) tiến hành phản ứng 6 90°C trong 2~4 giờ, sau đó rửa sạch, sấy khô Tiếp tục cho vào dd HCI 0,6 N (theo tỉ lệ 1 kg nguyên liệu ; 4 lit HCl) phan tng tiến hành ở 20—230C, trong 4 ~ 6 giờ Tiến hành lọc, rửa, sấy

vO tam (quá trình này lập đi lập lại 2-3 lần để tách hết Ca và protein ) Hiệu suất

tách chiún 10—15% so với vỏ tôm khô

Tiếp theo cho chitin vao dung dich NaOH 40% (theo ti ié ikg chitin : 1 Hit NaOH ) thay déi dot ngội nhiệt độ của huyén pho chitin trong dung dich NaOH 40% từ 5—100°C bằng cách tăng rồi giảm đột ngột nhiệt độ 2 ~ 3 lan Sau đó để huyền phù chiún ở 30°C trong 2—5 ngày Cuối cùng, tiến hành phản ứng chuyển hóa chiún thành chitosan ở 70—100ÖC, trong 1-3 giờ Lọc, rửa, sấy khô Dung dich NaOH thu hôi để xứ lý vỏ tôm ban đầu