Thực nghiệm về thành phần hóa học của lá cây xuân hoa
Trang 2Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của lá cây Xuân Hoa Trang 63
THỰC NGHIỆM
4.1 NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
4.1.1 Hóa chất
e© Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, bản mỏng gồm:
eter dầu hỏa ( 60°C- 90°C ); n-hexan; benzen; cloroform; etyl acetat; aceton;
metanol va etanol đều là hóa chất Trung Quốc và được làm khan bang CaCl
nếu sử dụng lại
e Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ trên bản mỏng, phun xịt bằng
acid sulfuric đậm đặc hoặc dùng hơi iod
4.1.2 Thiết bị
e Các thiết bị dùng để ly trích ( lọ thủy tĩnh, becher )
e Máy cô quay chân không Buchi- Ï 1 l
e Cột sắc ký: cột khô, cột cổ điển
Sắc ký bản mỏng 25DC - Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel Fas¿ Merck
Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne
Các thiết bị ghi phổ:
- Phổ IR: Ghi trên máy quang phổ hổng ngoại IR-470 SHIMADU, BRUKER- EQUINOX 55
- Phổ MS-EL Ghi trên máy 5989B-HP-MS-Engine
- Phổ MS phân giải cao: Ghi trên máy quang phổ LC-MSD-Trap-SL Phổ
'H_NMR, 2C-_NMR, kết hợp với phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi trên máy
cộng bưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phé proton va 125 MHz
cho '°C-NMR
Tất cả phd dude ghi tai Phong Phan Tich Cấu Trúc, Viện Hóa Học và
Cầu Giấy, Hà Nội
Trang 34.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ
CÂY XUÂN HOA
4.2.1 Điều ché cao etanol
Bột cây khô (0,96kg) được ngâm dầm trong etanol ở nhiệt độ phòng trong
lọ thuỷ tinh (loai 10 lít) khoảng 24 giờ, lọc, cô cạn dung môi ở 50°C, thu được
cao etanol Lập lại quá trình trên nhiều lần đến khi trích kiệt
4.2.2 Điều chế cao eter dầu hỏa, cao cloroform, cao etyl acetat, cao
metanol
Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực, theo đõi quá trình bằng sắc ký
bản mồng rồi cô quay thu hổi dung môi sẽ thu được các loại cao tương ứng
4.2.3 Cô lập các hợp chất có trong các loại cao
Tiến hành sắc ký cột (nhanh cột khô, cổ điển) các loại cao, sau đó sắc
ký cột và sắc ký điều chế nhiều lần trên những phân đoạn được chọn để cô lập
các hợp chất Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc ký bản mồng với
thuốc thử hiện hình là acid sulfuric đậm đặc hoặc hơi 1od
4.3 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC #*
4.3.1 Dụng cụ
— Becher cdc loai: 250ml (2 chiếc); 500ml (2 chiếc); 1000ml (2 chiếc) dùng
để ấp trứng
—_ Khay thử với các ống nghiệm có vạch định mức 5ml, kính lúp, đèn pin
nhỏ
~_ Ống đong 10ml (3 chiếc) có chia vạch Iml, 5ml
— Pipettman sit dung cone 10 - 1001, 100-1000 pl
Trang 4
Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của lá cây Xuân Hoa Trang 65
—_ Lọ thủy tỉnh loại 5ml (10m}) có nắp đậy kín dùng để pha mẫu thử
4.3.2 Hóa chất
— Dung méi DMSO (Dimety] sulfoxid) loại tỉnh khiết, hãng Prolabo
—_ Nước biển (loại dùng để nuôi cá cảnh biển), nước cất
—_ Gossypol và plumbagin được sử dụng như chất đối chứng dương
4.3.3 Nguyên liệu
Tring Artemia salina
4.3.4 Cách tiến hành
4.3.4.L Ấp trứng thành ấu thể
- Cân 0,1 gam trứng cho mỗi lẫn thử (khoảng 100 ống nghiệm), cho vào becher, ngâm với 150 mi nước cất trong 30 phút, lọc trứng trên giấy lọc và phễu
thủy tinh
- Dùng ống hút bơm nước biển rửa trứng trên giấy lọc cho chảy vào một
becher có chứa sẵn 100 mÌ nước biển Sau đó thêm nước biển vào cho đủ
250ml
- Ngâm becher vào một thau nước nhỏ để giữ nhiệt độ trong khoảng 28
°%C _ 34°C (trên 35 °C ấu trùng sẽ chết) Không cần đậy kín, để yên becher sau
48 giờ
- Dùng đèn pin soi cho ấu thể tập trung tại vùng có ánh sáng, rồi dùng
ống hút chúng thả riêng vào một becher có chứa sẵn 150 ml nước biển sạch
(nếu trước 48 giờ mà thấy ấu thể nổ nhiều và bơi khỏe thì nên hút chúng để riêng dẫn theo cách như trên nhằm tạo điều kiện cho ấu thể hô hấp tốt) Chỉ sử dụng ấu thể nở trong khoảng thời gian từ 48 - 72 gid
Trang 54.3.4.2 Cách pha mẫu
e Pha mẫu cái: Đối với cao nên pha ở nồng độ lớn, tùy vào kết qủa độc tính mà
có sự giảm hoặc tăng nổng độ cho lần thử tiếp theo Cân 30 mg cao cho vào lọ,
nhỏ vào một ít dung môi DMSO hoặc dung môi trích cao để hòa tan (tổng thể tích tích DMSO và dung môi trích cao < 150 nl), có thể đun cách thủy nhẹ để
cao tan tốt hơn Thêm 3 ml nước biển vào lọ, đậy nắp, lắc đều
e Pha mẫu chứng :
— Mẫu chứng dương: cân 5 mg Plumbagin, hòa tan bằng bằng 50 Hl aceton rồi
thêm 1 ml nước biển, đậy nắp, lắc đều
— Mẫu chứng dung môi trích cây: cân 30 mg dung môi trích cây cho vào lọ, nhỏ thêm vài giọt DMSO để giúp dung môi dễ phân tán trong nước (thể tích DMSO
< 150 nl), rồi thêm 3 ml nước biển, đậy nắp, lắc đều
— Mẫu chứng DMSO: hòa tan 150 nl DMSO bằng 3 mÌ nước biển trong lọ
4.3.4.3 Cách tính
e Tính nồng độ
- Mẫu cái: 30 mg/ 3ml tương đương 5mg/500 yl Nhu vay, nếu hút 500 nl sẽ có
chứa 5mg mẫu chất Sau khi thêm nước biển cho đủ 5 ml thì nồng độ khi đó sẽ
là 1000 jg/ pl, tinh tương tự cho các nông độ khác
~_ Mẫu chứng dương (Plumbagin): 5mg/ ml tương đương 0,5mg/100 nl Như vậy, nếu hút 100 nl sẽ có chứa 0,5mg Plumbagin Sau khi thêm nước biển cho đủ 5 ml
thì nỗng độ khi đó sẽ là 100 pg/ pl
- Mẫu chứng dung môi trích cây: nếu pha mẫu cái ở nồng độ nào thì mẫu chứng
dung môi trích cây cũng phải được pha Ở nông độ đó
Trang 6
Góp phân tìm hiểu thành phần hóa học của lá cây Xuân Hoa Trang 67
— Mẫu chứng DMSO: có thể không cần tính nồng độ nhưng với 150 pl DMSO/3ml nước biển (sử dụng lượng bằng với lượng hòa tan cao), cũng hút 500
pl, 250 ul, 50 yl cho vao mẫu thử
e Tinh todn liéu LCs
Liéu LCs là liều mà mẫu thử được pha với nông độ xác định có thể giết
chết 50% ấu thể Ar/emia salina trong vòng 24 giờ Nếu số lượng ấu thể chết ít
hơn 50% ở một nồng x nào đó và chết 100% ở nồng độ lớn hơn 10x, thì phải thử
nghiệm lại ở những nồng độ loãng hơn trong khoảng x đến 10x để xác định chính xác liều ICao
4.3.4.4 Cách thư (mỗi nông độ muốn thử được thực hiện trên 3 ống nghiệm)
Từ becher chứa ấu thể, dùng pipette pasteur hit 10 con Artemia salina cho
vào mỗi ống nghiệm, sao cho thể tích nước biển trong ống đạt ống đạt khoảng 4
ml Bơm mẫu chất vào ống thử rồi thêm nước biển cho đủ 5ml/ ống nghiệm Khay thử được che đậy, để yên sau 24 giờ Dùng kính lúp đếm số lượng ấu thể chết ở mỗi ống nghiệm, suy ra tỷ lệ con chết do dung dịch thử nghiệm ở mỗi nồng độ