Nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học cây thông đỏ

Nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học cây thông đỏ

3 NGHIÊN CỨU

3.1 GIỚI THIỆU CHUNG

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học

của lá cây thông đó (Taxus vwallichiana Zucc.) thu hái tại phần viện sinh hoc

tỉnh Lâm Đồng vào tháng 5 năm 2006 Mẫu cây được phơi khô, xay nhỏ rồi trích kiệt với metanol theo phương pháp ngâm đầm, lọc, cô quay thu hổi dụng

môi thu được cao metanol thô Cao metanol thô lần lượt đem trích với các dung môi eter đầu hỏa, cloroform và etyl acetat thu được các cao tương ứng,

Thực hiện sắc ký cột cao CHCH; (25g) trên silica gel với hệ dung ly

CHCH-MeOH có độ phần cực tăng dẫn thu được 80 phân đoạn, mỗi phân đoạn

200ml Dựa vào sắc ký bản mồng gộp lại thành 7 phân đoạn mã hóa thành (Fl- 7) Trong luận văn này, chúng tôi khảo sát phân đoạn 2 (F2), phân đoạn 3 Œ3), phân đoạn 5Š (F5) và phân đoạn 6 (FO)

3.2 KẾT QUÁ VÀ BIỆN LUẬN

Thực hiện sắc ký cột phân đoạn 2 (F2), phân đoạn 3 (F3), phân đoạn Š5 (F5) và phân đoạn 6 (F6) trên siica gel, pha đảo RP\; với nhiều hệ dụng ly khác

nhau, chúng tôi đã phân lập được 7 hợp chất Dựa vào các kết quả phổ nghiệm,

chúng tôi định danh các hợp chất này là taxinine B (31), taxuspine F (32), 10- deacetyltaxuspine F (33), 19-hydroxybaccan HH (34), ¡Ô-deacetylbaccaun HH

(35), 7-(0-xylosy])-10-deacetyltaxol (36) Ngoài các taxan đditerpen chúng tôi

còn cô lập được hợp chất p-hydroxybenzaldehid (37)

proton metin [, 2.24 (1H, dd, H-1) va 3.32 (1H, d, H-3)], một nhóm exometylen fou 4.9101H, s, H-20a} va 5.43 (1H, s, H-20b)], và một nhóm cinnamoyl [ôn 6.44

CH, d, J=16 Hz, H-22), 7.68 (1H, d, J=16 Hz, H-23), 7.42 @H, H-2', H-5 và H- 4') va 7.76 (2H, d, H-2' và H-6)]

Phổ C NMR kết hợp với phể DEPT 90 và DEPT 135 (phụ lục 2 và 3) cho các mỗi cộng hưởng ứng với 35 carbon bao gồm một carbon carbonyl tốc 199.3 (s, C-13)], bốn carbon carbonyl ester [ỗc 169.3 (s, 2-OAc), 169.7

(s, 7-OAc), 169.7 (s, 9-OAc) va 169.2 (s, 10-OAc)}, hai carbon olefin tri hodn

19

lộc 150.5 (s, C-11) va 138.6 (s, C-12)} vA 6 carbon don hodn mang oxygen [5c 68.6 (d, C-2), 76.2 (d, C-5), 69.6 (d, C-7), 75.0 (d, C-9) và 72.8 (d, C-10)]

Các kết quả phổ nghiệm trên cho thấy hợp chất này có công thức phân tử

C;;Ha¿O;; với độ bất bão hòa 16 Cấu trúc của TW1 được xác định dựa vào phổ

HSQC, HMBC va COSY (bang số 1)

Phổ HMBC (phụ lục 5) ở vong A cho thấy hai nhóm metyl cùng tương

quan với nhau [Hạ-16 (ồu 1.15) với C-17 (ốc 25.3) và Hạ-17 (õn 1.76), với C-16

(8c 37.8) đẳng thời càng tương quan với carbon trí hoán [ốc 37.4 (s)], một carbon olefin tri hoán [ñc 150.5 (s)} va mét carbon tam hodn mang oxygen [Šc 48.7 (s)]

Vậy carbon lần lượt là C-15, C-11 vA C-1 Nhém mety! [Hj-18 (8; 2.38 (]

tương quan với C-11, một carbon olefin tri hodn [é- 138.6 (s)] vA m6t carbon carbonyl &¢ 199.3 (s) V4y carbon olefin tri hodn phai 1a C-12 gan nhém 18-Me

và carbon carbonyl là C-13 Ngoài ra Phổ COSY (phụ lục 6) cho thấy hai proton

metylen (8, 2.34 (1H, d) va 2.84 (1H, dd) 1a H-i4a va H-14b, dựa vào sự ghép

cap gem (i= 20.0 Hz) và ghép cặp với H-1 Giaji= 7.0 Hz) Diéu nay được khẳng định lại trong phổ HMBC, proton H-14a cho tương quan với C-12, C-13

và C-15, Tương quan HMBC và 'H-'HCOSY được trình bày trong hình 1,

Hình 1 Tương quan HMBC và 'H-'HCOSY trong vòng A của TW1

Xác định vòng B dựa vào phé HMBC va COSY nhw sau: H-1 [dy 2.24 (dd, J=1.5; 7.0 Hz)] ghép cap vdi mOt proton tai 84 5.62 (dd, J=1.5; 6.5) 1A H-2

Proton 6, 3.88 (d, J=7.0 Hz) phải là H-3 dựa sự ghép cặp carbon kế cận H-2 với

J=7.0 Hz Ngoài ra trong phổ HMBC cho thấy nhém mety! [H3-19 (, 1.02 (s} tương quan với carbon C-3, mét carbon trí hoán [5c 47.6 (s)] va hai carbon tam hoán mang oxygen [8¢ 75.0 (d) vi 69.6 (d)} Vay 3 carbon này lan luot 1A C-8, C-9 va C-7 H-9 [6 5.94 (d, J=10.5 Hz)] tương quan với C-8, C-7 và carbon tam hodn mang oxygen [Sc 75.0 (d)] 1A carbon C-10 vA H-9 ghép cap véi H-10 vii

hằng số ghép J=10.5 Hz hién thị sự ghép cặp trans Tudng quan HMBC và !H-

'H COSY của vòng A trong hình 2,

N Tương quan HMBC mmmmzz 1 ƯƠng quan COSY

Oc

Hình 2 Tương quan HMBC, ‘H-'H COSY trong ving B của TWI

3 vòng C ta cé hai proton nhém exometylen [$y 4.91 (1H, s, H-20a) va

3.43 (1H, s, H-20h)] cùng cho tương quan vdi carbon C-3, carbon olefin

[Sc 139.8 (s, C-4)] va carbon tam hodn mang oxygen [ỗc 76.2 (d, C-5)] vay

nhóm exometylen gắn vào vị trí C-4 Mũi H-5 xuất hiện như một proion mũi ba tại ổn 5.38 (=3.0 Hz), và ghép cặp cả H-6a và H-6b có mỗi cộng hưởng tại ðu

.75 (m) và 2.11 (dd) H-6a và H-6b cũng ghép cặp với tín hiệu proton tại ðụ 5,44 (dd, 1=6.0; 11,0 Hz) là H-7 Các tương quan HMBC và 'H-'H COSY trong vòng C được mình họa Ở hình 3

“` Tương Y gq quan HMBC

Hình 3 Tương quan HMBC và 'H-'H COSY trong vong C cla TW1

Ngoài ra trong phổ HMBC cho tương quan giữa H-2, H-7, H-9, H-10 lần

lượt tương quan vdi carbon carbonyl ester [8 169.3 (s, 2-OAc), ốc 169.7

(s, 7-OAc), ốc 169.7 (s, 9-OAÁc) và õc 169.2 (s, 10-OAC)] Vậy ở vị trí C-2, C-7, C-9 và C-10 mang nhóm thé OAc

Nhóm cinnamoyl được xác định dựa vào phố HMBC như sau; proton olefn [ôn 7.68 (TH, d, H-23) cho tương quan với một carbon carbonyl [ốc 166.2 (s), một carbon olefimn [ốc 117.4 (đ)] và một carbon hương phương [õc 129.0 (đ)] Vậy proton nay phải là H-23 và các carbon tương ứng là C-21, C-22 va C- 2' Ngoài ra H-23 ghép cặp rans với H-22 (I=16 Hz) Từ kết quả này xác nhận

sự hiện điện của nhóm cinnamoyl

Vậy W1 là một taxinine B, các đữ liệu phổ của TWI1 đều trùng khớp

với taxinine B.” Hợp chất này đã được cô lập trong cây Taxus cuspidata Sieb

Et Zucc Taxinine B ngăn chặn hoại tính chuyển hóa thuốc của P-glycoprotein

và được sử dụng như tác nhân khắc phục các trường hợp kháng thuốc."

23

Bang 1 Số liệu phố "H NMR (500MHø), C NMR (125MH?) và tương quan

HMBC, 'H-'H COSY của taxinine B trong CDC

dd, H-7), 5.90 (TH, d, H-9), 6.25 (TH, d, H-10)], hai nhóm metylen lầu 1.61, 1.94

(H-6a và H-6b) và 2.33, 2.76 (H-14a và H-14b)], hai proton metin [3y 2.20 (1H,

dd, H-1) và 3.55 (1H, d, H-3)] và một nhóm exometylen [ôu 4.52 (s, H-20a) va

5.23 (s, H-20b)J tại C-4

Phổ !C NMR kết hợp với phổ DEPT 90 và DEPT 125 (phụ lục § và 9) cho các mỗi cộng hưởng ứng với 28 carbon bao gồm một carbon carbonyl

tñc 199.6 (s, C-13)], bốn carbon carbonyl ester [ốc 169.2 (s), 169.4 (s), 169.8 (s)

và 169.8 (S)], hai carbon olefin trí hoán [ỗc 139.2 @, C-11) và 144.8 (s, C-12)]

và năm carbon trí hoán mang oxygen [5c 69.0 (d, C-2), 74.5 (d, C-5), 69.6 (d, C-

7), 75.2 (d, C-9) và 72.8 (d, C-10)]

NO ti

Từ các kết quả phổ nghiệm trên cho thấy hợp chất này có công thức phân

tử là CagHssO¡o và có 4 nhóm -OAc Nhưng khác với hợp chất taxinine B (31), hợp chất TW3 không có nhóm cinnamoyl tại C-5 thay vào đó là nhóm -OH,

Phổ COSY (phụ lục 10) cho thấy H-2 [êu 5.60 (dd, 1=2.0; 6.0 H2)] có tưởng quan với proton có ôu 3.55 là H-2 (1; ;=6.0 Hz) và với proton có ðu 2.20 là B-1 (dd, Jo) =2.0 Hz, 1ij= 6.5 Hz), Mặt khác, phổ COSY cho tương quan H-2

và H-20a chứng tổ nhóm exometylen gắn vào vị trí C-4 Một proton 3y 2.33

(d, J=19.5 Hz) va proton 84 2.76 (dd, J=6.5; 19.5 Hz) IA H-14a va H-14b, dựa vao suo ghép cap gem (haaj=l9.5 Hz) và ghép cặp vdi H-1 tai &, 2.20 Qiá,¡=6.5, J› ¡2.0 Hz), Mũi H-5 xuất hiện như một proton mỗi déi tai dy 4.22 (d,

J=2.0 H2), và ghép cặp cả H-6a và H-6b có mũi cộng hưởng tại ôu 1.61 (m) và 1.94 (ddd, J= 3.0; 5.5; 13.5 Hz) H-6a va H-6b cling ghép cap vdi proton tai $y 5.52 là H-7 (1;@=11.5 Hz, l;¿¿=5.5 H2) Hai tín hiệu tại õu 5,90 và 6.25 lần lượt

là H-9 và H-10 với hằng số ghép cặp kế cận lớn Œạ¡o =10.5 Hz) biểu thị cấu hình định hướng /rans Dựa vào giá trị cộng hưởng của các proton oxymen lên

5.60, H-2), 5.52 (H-7), 5.90 (H-9), 6.25 (H-10)] ta xác định các carbon tương ứng C-2, C-7, C-9, C-10 mang các nhóm thé OAc Ở vi tri C-5, 8 4.22 và & 74.5 dé

nghị gắn nhóm -OH Tương quan 'H-'H COSY của TW3 được minh hoa trong hình số 4,

AcQ, PAC Ofc

wee

Hình 4: Tương quan 'H-'H COSY cia TW3

Vay TW3 1A taxuspine F, so véi cdc dif ligu 'H NMR va °C NMR trong

tdi liéu tham khdo® thấy có sự trùng khớp Taxuspine F đã được cô lập từ Taxus

cupidata Sieb Et Zucc năm 1995, Taxuspine F có hoạt tính chống lại tế bào

bạch cầu L1210 với 1Cso 0.33 (zg/ml) và tế bào ung thư biểu mô KB (người) với

TCso >10 (g/m).

Bang 2 Số liệu phổ 'H NMR (500 MH2), ÌC NMR (125 MH?) và tương quan

| ‘H-'H COSY cia taxuspine F (32) trong CDCI,

3.2.3 10-Deacetyltaxuspine F (33)

TW4 thu dude didi dang tinh thể hình kim không màu, sắc ký bản móng

với hệ dung ly CHCH-MeOH (95:5) cho vét tron mau nau

Phổ khối lượng MS (phụ lục 11) xuất hiện mỗi ion phân tử m/z =492.9

[M+H]! Phổ 'H NMR (phụ lục 12) sự hiện diện bốn nhóm mety! tứ cấp [ðu 1.20

(s, 16-Me), 1.79 (s, 17-Me), 2.16 (s, 18-Me), 0.96 (s, 19-Me)] dic trưng cho kKhung taxan diterpen Ba nhém -OAc [8, 2.08 (s, 9-OAc), 2.06 (s, 2-OAc), 2.11 (s, 7-OAÁc)], năm proton oxymetin [6, 5.60 (1H, dd, H-2), 4.14(1H, t, H-5), 5.46

[Se 69.1 (d, C-2), 74.0 (d, C-5), 70.1 (d, C-7), 77.7 (d, C-9) va 69.9 (s, C-10)]

Từ các kết quá phổ nghiệm trên cho thấy hợp chất này có công thức phân

tử là C;¿HssOs So với các dữ liệu phổ cho thấy hợp chất taxuspine F và hợp

29

chất TW4 có sự tương tự nhau Trong hợp chất Taxuspine E có 4 nhóm -OAÁc và

1 nhóm -OH nhưng trong hợp chất TW4 chỉ có 3 nhóm -OAc và 2 nhém -OH

Phổ COSY (phụ lục L7) cho thấy thấy H-2 [$y 5.60 (dd, J=2.0; 6.5 Hz)]

có tương quan với proton có $y 3.54 là H-3 (I;;=6.5 Hz) và với proton có by

2.18 là H-1 (m) Mặt khác, phổ COSY cho tương quan H-3 và H-20a, chứng tổ nhóm exometylen gắn vào vị trí C-4 Điều này được khẳng định rõ trong phổ HMBC (phụ lục 16), H-20a và H-20b cùng tương quan với C-3, C-4 và C-5, Một proton 5y 2.34 (d) va mét proton 6, 2.75 (dd) 1A H-14a và H-14b, dựa vào sự ghép cặp gem (a2 ¡a,=20.0 Hz) và ghép cấp vdi H-1 tai dy 2.18 Qha=7.0, Ja;

=2.0 Hz) Mũi H-5 xuất hiện như một proton mili ba tai 64 4.14 (=3.0 Hz), va

ghép cặp cả H-6a và H-ób có mũi cộng hưởng tại ấn 1.62 và 1.66 H-6a va H-6b

cũng ghép cặp với proton tại ðu 5.46 là H-7 Q;o=11.5 Hữ, Jze@=5.5 Hz ) Hai tín

hiệu tại õu 5.77 và 5.22 lần lượt là H-9 và H-10 với hằng số ghép cặp kế cận

lớn (1a ;o =10.0 H2) biểu thị cấu hình rang Ngoài ra phổ HMBC cho tương quan giữa H-2, H-7 và H-9 với các carbon carbonyl ester [Šc 169.5 (s, 2-OÁC), ốc 170.9 (s, 7-OAc), 5c 170.8 (5, 9-OAc)} Vay ở vị trí C-2, C-7, C-9 mang nhóm

thế -OAc Ở vị trí C-5 c6 84 =4.14 ppm và ôc =74.0 ppm, vi tri C-10 6 Sy = 5.22

và ôc =69.9 ppm nên nhóm ~OH lần lượt gắn tại C-Š và C-10 Tương quan HMBC và !H-!H COSY của TW4 được trình bày trong hình 5

“N\ Tương quan HMBC

“yy women TUOng quan COSY

Hình 5 Tương quan HMBC và !H - lí COSY của TW4

Vậy TẤW4 là 10-deacetyltaxuspine F Các tra cứu bằng chương trình SciFinder cho thấy hợp chất TW4 là chất mới chưa được công bố trên thế giới

Hóa lập thể của 10-dacetyltaxuspine E được xác định dựa vào phổ

ROESY (phụ lục 18) như sau: Phổ ROESY cho tương quan giữa H-2 với 16-Me,

19-Me va H-9;, H-7 với H-3 và H-10; H-9 với 19-Me và H-2; H-10 với Me-I8

Vậy lập thể của nhóm -OAc tại C-2, C-7, C-9 lần lượt là œ, đ-, œ- và nhóm

~OH tai C-10 định hướng đ- Nhóm ~QH tại vị trí C-5 được xác định là @ dua

vào hằng số ghép cặp nhỏ của H-5 (t J=3.0 H2) Vậy cấu trúc lÔ-

đihydroxvtaxa-4(20),11-đien-13-on Tương quan lập thể trong phổ ROESY của

hợp chất W4 được minh họa trong hình số 6

Hình 6 Tương quan ROESY của hợp chất TW4

31

Bang 3 Số liệu phổ 'H NMR (500MHz), °C NMR (125MHz) và tương quan

HMBC va 'H-'H COSY cia TW4 trong CDCI, va CD,0D

3.2.4 19-Hydroxybaccatin HH (34)

FiOIHi:c: \

TWS thu dude 6 dang tinh thể hình kim màu trắng, sắc ký bản mồng với

hé dung ly CHCL-MeOH (9:1) cho vét tron mau ndu den

Phé 'H NMR (phụ lục 19) cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của ba nhóm metyl tứ cấp [ôu 1.10 (3H, s, 16-Me), 1.26 3Ñ, s, 17-Me) và 2.06 (3H, s, 18-Me)] đặc trưng cho khung taxan điterpen Hai nhóm -OAc [84 2.25 (3H, s, 4-OAc) va 2.30 @H, s, 10-OAc)], nim proton oxymetin [õu 6.41 (1H, d,

Phổ C NMR kết hợp với phổ DEPT 90 và DEPT 135 (phụ lục 20 và 21)

cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện 31 carbon bao gồm một carbon

carbonyl [ốc 205.0 (s, C-9)], ba carbon carbonyl ester [ốc 171.0 (s, 10-OAC),

171.0 (s, 4-OAc) va 167.3 (s, 2-OB2)], sấu carbon hương phương [ốc 129.8

(s, C-1'), 130.2 (d, C-2'}, 128.7 (d, C-3)) va 133.6 (d, C-4')1, hai carbon olefin trí hoán [8c 131.5 (s, C-11) va 146.9 (s, C-12)], hai carbon nhi hoan mang oxygen [8c 59.6 (t, C-19) va 76.6 (t, C-20)], nam carbon tam hodn mang oxygen [5¢ 75.9

33

(d, C-2), 84.7 (d, C-5), 71.9 (d, C-7), 76.5 (d, C-10) va 67.3 (d, C-13)] va hai

carbon tri hodn mang oxygen [8 79.4 (s, C-1) vA 80.8 (s, C-4)]

Từ kết quả phổ trên cho thấy hợp chất này có công thức phân tứ

C¿¡H;gOy; với độ bất bão hòa 13 Từ các nhóm chức trong hợp chất ta có 9 độ bất bão hòa do đó hợp chất TW5 phải có 4 vòng So với dữ liệu phổ 'H NMR và

°C NMR véi hợp chất taxinine B thì hợp chất này không có nhóm exometylen

mà có nhóm metylen gắn oxygen [8y 4.4 va 4.3 (mỗi mũi 1H, d, J=8.5 Hz)] và 5c 76.5 (t) cho su hién dién vòng oxetane trong phân tử Vậy hợp chất này là

một iaxan điierpen có vòng oxetane tại C-4 và C-5

Phé HMBC (phụ lục 23) ở vòng A cho thay hai nhóm methyl cùng tương

quan với nhau [Hạ- Ló (ốu 1.10) với C-17 (6c 26.7) va H3-17 (y 1.26), với C-l6

(äc 26.8) đẳng thời cùng tương quan với carbon tri hoán [ỗc 42.9 (s)], một carbon olefin tri hodn [6c 131.5(s)] va mét carbon tri hodn mang oxygen [dc 79.4 ()] Vậy carbon lần lượt là C-15, C-11 và C-l G vị trí C-Í với Šc 79.4 so sánh với các hợp chất taxan chứa vòng oxetane thì C-l gắn nhóm OH Nhóm metyl {H3-18 (8, 2.06 (d)] cho tudng quan vdi carbon C-11, mt carbon olefin tri hodn [ỗc 146.9 (s)] và một carbon tam hoán mang oxygen ốc 67.3 (d) Vay carbon

olefin tri hodn JA C-!2 gắn nhóm 18-Me va carbon còn lại là C-13, Mà ta có H-13 cé 8, 4.80 ppm va 6¢ 67.3 ppm dude để nghị gắn nhóm OH Trong phổ

COSY (phụ lục 24) H-13 có ðu 4.80 (, J=8.0 Hz) ghép cặp với tín hiệu proton mili da tai $y 2.21 1A proton metylen H-14, Tương quan HMBC và 'H-'H COSY

vong A minh hoa trong hinh 7

HOmh

cr \ Tương quan HMBC

mm 1 ƯƠng quan COSY

Hình 7 Tương quan HMBC và “H-'H COSY ving A của TWS

Việc xác định vòng B và C dựa vào phổ HMBC và COSY như sau: H-14

tương quan C-15, C-13, C-12, C-1 vA mét carbon tam hodn mang oxygen lộc 75.9 (d)] phải là C-2 H-2 có tương quan với carbon carbonyl ester [õc 167.3 (s) mà carbon nay cho tong quan với một proton hương phương [8, 8.13

(dd, C-23] Vậy C-2 gắn nhóm 2-OBz¿ Trong phổ COSY, H-2 dy 6.41 (d, J=7.0

Hz) ghép cap proton 6, 3.88 (d, J=7.0 Hz) 14 H-3 Trong HMBC, H-20a trong

quan với C-3 và carbon đơn hoán mang oxygen [ôc 84.7 (d, C-5)], đồng thời H-

20b cho tương quan C-3 va carbon tri hodn mang oxygen [c 80.8 (s, C-4)] Vậy

vòng oxetane gắn vào vị trí C-4 và C-5, Vi tri C-4 cd độ dịch chuyển ñc 80.8 so

sánh với các hợp chất taxan có chứa khung oxetane thi C-4 mang nhém OAc Trong phổ COSY, H-5 [8, 5.04 (d, I=8.5Hz)] ghép cặp với H-6a và H-6b tại õu

1.80 và 2.57, Hạ-6 ghép cặp với proton ấu 4.42 (dd, J=7.0 và 1z11.5 H2) là H-7

Vi trí C-7 với độ dịch chuyến ðn 4.42 và õc 71.9 vậy C-7 gắn nhóm -OH Trong

HMBC, H-7 tương quan với C-3 và với nhóm ~CH;-OH là C-19 Mà H;-19 cho

tương quan với C-3 và carbon carbonyl [ốc 205.0 @G)] phải là C-9, Proton 86.43

(s) là H-10 cho tương quan C-15, C-12, C-11, C-9 va carbon carbonyl ester {Se 171.0 (s)} Vay C-10 gén nhém -OAc Hinh 8 cho thay twong quan HMBC và

!H-H COSY trong vòng B và C của TWS.