Thực nghiệm li trích Cynarin trong lá atisô và thủy giải Cynarin thành Acid quinic

Thực nghiệm li trích Cynarin trong lá atisô và thủy giải Cynarin thành Acid quinic

O THUC NGHIEM

4.THUC NGHIEM

4.1 Xử lý mẫu

Mẫu cây atisô sau khi thu hái và ổn định bằng hơi alcol etyl được chia

thành ba phần lá, rễ, thân Dược liệu sau khi sấy khô được cắt nhỏ Đây là mẫu nguyên liệu ban đầu dùng để định tính các hợp chất hữu cơ và ly trích cynarin

4.2 Xác định sự hiện diện các cấu tử hữu cơ trong lá, thân, rễ cây atisô

ở 3 dạng: mẫu nguyên liệu thô, cao eter dầu hỏa và cao alcol etyl

4.2.1 Điều chế mẫu nguyên liệu thô, cao eter dầu hỏa, cao alcol etyl

Phản ứng định tính các hợp chất hữu cơ được thực hiện trên bột khô, cao

eter dầu hỏa và cao alcol etyl của lá, thân, rễ cây atisô

Điều chế mẫu nguyên liệu thô: Lá, thân, rễ sau khi ổn định bằng hơi alcol etyl và sấy khô, được cắt nhỏ

Điều chế cao eter dầu hỏa: Mẫu nguyên liệu thô của từng bộ phận được tận trích bằng eter dầu hỏa 60-90C trong dụng cụ soxhlet cho đến khi làm bay hơi

dung môi không còn cặn Thu hồi dung môi eter dầu hỏa ở áp suất kém, thu được cao eter dầu hỏa

Điều chế cao alcol etyl: Bã của mẫu nguyên liệu thô sau khi trích bằng eter

dâu hỏa được để khô tự nhiên Tiếp tục tận trích với alcol etyl 90° Thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được cao alcol etyl

Sơ đồ 2 Qui trình điều chế mẫu nguyên liệu thô, cao eter đầu hỏa và

cao alcol etyl của các bộ phận lá, thân, rễ

Mẫu nguyên liệu tươi

1 Ổn định bằng hơi alcol etyl (5 phút)

2 Sấy khô ở 40-50°C Mẫu nguyên liệu

thô

Tận trích bằng eter dầu hỏa 60 — 90°

trong dụng cụ Soxhlet

1 Để khô tự nhiên

2 Trích kiệt bằng alcol etyl 96”

dầu hỏa

Thu hồi dung môi ở áp suất kém

Cao alcol

4.2.2 Phản ứng định tính các hợp chất hữu cơ

a) Sterol°

Sự hiện diện của Sterol được xác định bởi phản ứng màu với thuốc thử

Liebermann - Burchard va Salkowski

Thuốc thử Liebermann — Burchard:

H;SO¿ đậm đặc 1ml

Anhydric acetic 20ml

Thuốc thử Salkowski:

H;SO¿ đậm đặc

Điều chế dung dịch thử:

Hòa tan 0,5g mẫu nguyên liệu thô trong 10ml CHC];, lọc thu được dịch

CHC]1; của mẫu thô

Hòa tan 0,5g mẫu cao trong 30m] CHC]¿, lọc, được dịch trích cao

Thêm từ từ thuốc thử vào dịch CHC]; Phản ứng dương tính nếu dung dich

từ không màu chuyển sang:

Màu xanh lục đậm với thuốc thử Liebermann

Màu nâu đỏ với thuốc thử Salkowski

Kết quả: Mẫu nguyên liệu thô, cao eter dầu của lá, thân, rễ atisô có chứa hợp chất sterol

b) Tanin®

Sự hiện diện của tanin được xác định bởi phản ứng màu và phản ứng tạo

thành trầm hiện với dung dich gelatin man, dung dich Stiasny, dung dịch

Pb(CH;COO);, dung dich FeCl

Điều chế dung dịch thử: Nấu 5g mẫu nguyên liệu thô, hoặc cao eter dau

hỏa, cao alcol ety]) trong 100ml nước, 10 phút Lọc lấy dịch trong để thực hiện

các phần ứng màu và trầm hiện

Thuốc thử tanin gồm:

Dung dịch Stiasny:

Formol 36% : 20ml

HCI đậm đặc: 10ml

Dung dịch gelatin mặn:

Gelatin: 2 g

Dung dịch NaCl bão hòa 10ml

Dung dịch Pb(CH;COO); bão hòa

Dung dich FeCl; 1%

Lấy 2ml dịch trong, thêm 1ml thuốc thử Stiasny, đun nóng Phần ứng dương

tính nếu có trầm hiện kết khối vô định hình màu đỏ

Lấy 2ml dịch trong, thêm 2-4 giọt acetat Pb(CHạCOO); Phản ứng dương tính nếu có trầm hiện màu vàng nhạt

Lấy 2ml dịch trong, thêm 2ml FeCl; 1% Phản ứng dương tính nếu dịch

chuyển sang màu đen

Lấy 2ml dịch trong, thêm 1ml dung dịch gelatin mặn Phản ứng dương tính

nếu có kết tủa vô định hình màu vàng xuất hiện Để lâu kết tủa hóa nâu

Kết quả: Mẫu nguyên liệu thô, cao alcol etyl của lá, thân, rễ cây atisô có

chứa tanin

Cc) Flavonoid™

Sự hiện diện của flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata (còn gọi là phản ứng cyanidin của Wilstatter) và phản ứng cho màu vàng với dung dịch

clorua nhôm

Thuốc thử Shibata gồm dung dịch HCI, bột Mg kim loại, alcol isoamyl

Điều chế dung dịch thử:

Nấu 10g mẫu với 100ml nước cất trong 30 phút Để nguội, lọc Lấy dịch lọc làm mẫu thử

d) Phan ting Shibata:

Cho 2ml dịch lọc vào 2 ống nghiệm, ống 1 dung dich loc lam đối chứng

Thêm 5ml HCI đậm đặc và 0,1 g bột Mg vào ống nghiệm thứ 2 Để yên đến khi

hết sủi bọt Thêm từ từ alcol ¡isoamyl theo thành ống nghiệm, đun nóng nhẹ Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng màu hồng, chuyển sang màu đỏ đậm

Phan ting tao phifc vdi dung dich AICI:

Thêm vài giọt dung dich AICI; 3% vao dich loc Phan ting dương tính nếu địch lọc có màu vàng đậm hơn

Kết quả: Mẫu nguyên liệu thô, cao alcol etyl của lá có chứa hợp chất

flavonoid

Thân, rễ atisô không chứa hợp chất flavonoid

e) Alcaloid”’

Sự hiện diện của alcaloid được xác định bởi phản ứng trầm hiện với các

thuốc thử Hager, Bouchardat, Bertrand và Dragendoff

Thuốc thử Hager: Dung dịch acid picric bão hòa trong nước Thuốc thử cho kết tủa vàng với alcaloid

Thuốc thử: Bouchardat: I, 2,52

Nước cất 100ml Thuốc thử cho kết tủa màu nâu với alcaloid khi nhỏ từng giọt thuốc thử vào

dịch acid của alcaloid

Thuốc thử Bertrand:

Acid Silicotungstic 5g

Thuốc thử cho kết tủa vàng với alcaloid

Thuốc thử Dragendoff gồm hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B

Dung dịchA : Bi(NO3)3 2g | Hòa tan vào nhau, loc

HNO; đậm đặc 30ml

Dung dich B: Hoa tan 68g KI vào 60m] nước

Hòa tan dung dich A vào dung dịch B, để yên 24 giờ, lọc, thêm nước cho

đủ 250ml]

Thuốc thử cho trầm hiện màu vàng cam với dịch có alcaloid

Chúng tôi điểu chế dung dịch thử theo phương pháp Harold St lond

Phương pháp này gồm có 2 bước:

Bước I1: Trích 5g mẫu bằng dung dịch HCI 1%, ở 80°C trong 1 giờ Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm, chia dịch lọc ra ống nghiệm, cho từ 3 đến 5 giọt thuốc thử, quan sát ống nghiệm

Bước 2: Trích 5g mẫu khô với dung dịch Prollius (eter etyl, cloroform, alcol

etyl 95% và amoniac đậm đặc với t lệ thể tích 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong

vòng 24 giờ, lắc thường xuyên Sau đó lọc dịch chiết và cô cạn, thu cặn Hòa tan

cặn trong HCI 1% ở 80°C, khoảng 1 giờ Lọc, thu được dung dich thử

Khi cho thuốc thử vào dung dịch thử đều không có trầm hiện

Kết quả: là, thân, rễ cây atisô không có alcaloid

f) Glicosid®’

Để xác định sự hiện diện của glycosid, chúng tôi thực hiện phương pháp ly

trích theo sơ đổ sau:

Sơ đồ 3 Ly trích glicosid

Mẫu nguyên liệu thô

I Trích kiệt bằng alcol etyl 20°C trong

Soxhlet 2.Lọc

1 Chế hóa với dung dịch Pb(CH3COO), 10%

2 Loc

1 Dung dich Na2SO, bao hoa

2 Loc

Cô cạn ở áp suất kém

Hòa tan cặn vào alcol etyl 95%

Dịch alcol

Dịch alcol sau cùng dùng để định tính glicosid với các thuốc thử

Thuốc thử Baljet:

Acid picric 1% trong alcol etyl (20ml)

NaOH 5% (10ml)

Phản ứng dương tính nếu có màu vàng cam hoặc hồng sẫm khi cho thuốc

thử vào dịch trích alcol

Thuốc thử Molish:

Thimol xanh 2% (1-2 giọt)

H;SO¿ đậm đặc (Iml)

Với thuốc thử Baljet, dùng 2 ống nghiệm

Ống 1: Cho vào 2ml thuốc thử làm ống đối chứng

Ống 2: Chỉ chứa 2ml dịch alcol dùng để thử Cho từ từ thuốc thử vào, một

vòng màu vàng xuất hiện, sau đó chuyển sang màu vàng đậm, rồi đồ cam

Với thuốc thử Molish: thuốc thử có màu tím hồng khi cho dịch alcol vào,

sau đó chuyển sang đỏ tía rồi nâu đen

Kết quả: Lá, thân, rễ của cây atisô đều chứa glicosid

Saponin®:

Để xác nhận sự hiện diện của Saponin, chúng tôi thử sơ bộ bằng cách xác

định chỉ số tạo bọt của mẫu thử

Đun sôi 1 gam bột nguyên liệu trong 100ml nước cất trong 30 phút Lọc, để

nguội, thêm nước cất cho đủ 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiểu cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt là 1,2,3 1Ôml nước sắc, thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10ml Lắc mỗi ống nghiệm theo chiều dọc khoảng 15 giây Để yên 15 phút rồi đo chiều cao các cột bọt Nếu

chiều cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm dưới 1cm, chỉ số bọt dưới 100 thì

xác định sơ bộ là không có Saponin

Kết quả: Lá, thân, rễ cây atisô không có Saponin

4.3 Điều chế acid quinic và acid caffeic từ cynarin

Cho vào bình cầu (250ml) 50ml dung dich alcol etyl 90° Tiép theo, thêm vào 51,64mg (10mol) cynarin, đun nóng nhẹ cho tan hết, Cho thêm vào bình cầu đã đựng dung dịch cynarin 5ml dung dịch NaOH 0,3M (15.107

mol) Lắp hệ thống đun hoàn lưu Đun hỗn hợp phản ứng bằng hệ thống máy

khuấy từ ở 80°C trong 4 giờ Để nguội bình phản ứng, sau đó nhỏ từng giọt dung dịch HCI IM vào bình cầu đến khi dung dịch có pH =2, cô cạn dung dịch ở áp suất kém 40°C thu được cặn Rửa cặn bằng nước lạnh đến khi dung

dịch nước rửa thu được có pH =7 Hòa tan cặn thu được trong alcol metyl

Tách hỗn hợp san pham acid quinic va acid caffeic bằng sắc ký bản mỏng

điểu chế, hệ dung môi khai triển là acetat etyl — acid acetic — alcol metyl

(10:1:1) Giải hấp phụ sản phẩm bằng alcol metyl-nước 1 ;1 Cô cạn dung

môi, thu được 31,8mg acid caffeic và 15,0mg acid quinic Các acid này được

nhận danh bằng các phương pháp phổ nghiệm

Hiệu suất phản ứng điều chế là 81,18%

4.4 Các qui trình ly trích cynarin từ lá atisô

Qui trình 1: Ly trích cynarin bằng dung môi nước nóng

Sơ đồ 4 Ly trích cynarin thô

Lá khô atisô

(đã ổn định bằng hơi alcol etyl)

Trích bằng nước sôi

Dịch nước atisô

1 Cô cạn, để nguội

2 Thêm alcol etyl 96°, làm lạnh

3 Lọc, lấy phần cặn

1 Hòa tan trong dung dịch NaOH 20%,

thêm nước đến pH=9

2 Lọc bỏ cặn

Dịch NaOH

1 Thêm HCI 10% đến pH=2, làm lạnh

2 Lọc lấy tủa

Cặn cynarin thô

Sơ đồ 5: Điều chế cynarin từ sẳn phẩm thô

Cynarin thé

Hòa tan vao alcol etyl

Dịch alcol etyl

1 Cô cạn đến khi có tủa, thêm nước

2 Để nguội, làm lạnh

3, Lọc thu cặn

Cynarin thô

Sơ đô 6: Phương pháp kết tỉnh lại cynarin

Cynarin

1 Hòa tan bằng 1 lượng vừa đủ acid acetic-

alcol etyl (1:1)

2 Loc

Dich cynarin

1 Thêm nước

2 Làm lạnh

3 Lọc thu cặn Cynarin tỉnh khiết

Qui trình 2 : Ly trích cynarin bằng dung dich Na,CO; 20%

Sơ đồ 7: Ly trích cynarin

Lá khô atisô (đã ổn định bằng hơi alcol ety])

1.Ngâm kiệt bằng dung dịch NazCO; 20%

2.Lọc

Dung dich Na,CO;

1.Acid hóa bằng dung dịch HCI 10% đến

khi dung dịch có pH=3

2 Trích bằng acetat etyl

Dịch acetat etyl

1 Thu hồi dung môi ở áp suất kém thu

được cặn

2 Hòa tan cặn vào nước nóng, lọc nóng

Dịch nước

1 Acid hóa bằng HCI 10% đến pH=2

2 Trích bằng acetat etyl

3 Thu hồi dung môi

Cặn cynarin thô

Từ sản phẩm cynarin thô, kết tính lại theo sơ đồ 6, chúng tôi thu được

cynarin tỉnh khiết

khiết

Từ cynarin thô, két tinh |

Qui trình 3: Ly trích cynarinbằng dung dich alcol etyl 70°

Sơ đồ 8 Ly trích cynarin

Lá khô atisô (đã ổn định bằng hơi alcol ety])

1.Ngâm kiệt bằng dung dich alcol ety]

70°, pH=7

2 Loc

Dich alcol etyl

1.Loai tanin bing dung dich NaHCO3

bão hòa 6 pH=8

2 Loc bé tua tanin

Dich loc

1 Thêm HCI 10% đến khi pH=5-6

2 Lọc bỏ tủa (anbumin, chat nhay)

Dịch HCI

1 Thêm từ từ NaOH 10% đến pH=7

2 Cô cạn, để nguội

3 Thêm alcol ety1 90°, làm lạnh 2

ngày

Cặn cynarin thô

ại theo sơ đồ 6, chúng tôi thu được cynarin tính

Qui trình 4: Ly trích cynarin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều

chế (preparative thin layer chromatography)

Sơ đồ 9

Lá khô atisô

(đã ổn định bằng hơi alcol ety])

1.Trích bằng nước nóng

2 Cô cạn ở 60°C, áp suất kém

Dịch đậm đặc

1.Rửa bằng aceton

2 Thu hồi dung môi ở áp suất kém

Cặn

1 Hòa tan vào alcol mety]

2 Sắc ký bản mỏng điều chế( silicagel),

acetat etyl -acid acetic-alcol mety] (8:1:1)

3 Giải hấp phụ bằng alcol metyl-nước

Cynarin tinh khiết

Phương pháp 5: Ly trích cynarin bằng phương pháp tạo tủa với

Ca(OH);

Sơ đồ 10 Ly tr

Lá Atisô

ích cynarin

1.Trich ban

2.Lọc nóng

ø nước sôi

Dịch nước

1.Tác dụng với dd Ca(OH); đến khi

pH=12

2 Lọc lấy tủa

Cặn

1 Hòa tan vào EIOH 96°

2 Acid hóa bằng H;SO¿x 10% đến pH=3

3 Lọc, bỏ tủa

Dịch lọc

1 Kiểm hóa bằng dd NaOH 10% đến

pH=7

2 Cô cạn

Dịch nước

_— _—

——————

Cặn cynarin thô

1 Thêm alcol etyl 90°

2 Làm lạnh 2 ngày

y 3- Loc lấy cặn

Từ cynarin thô, kết tinh lai theo sơ dé 6, chúng tôi thu được cynarin tinh

khiết

4.5 Sắc ký bản móng”:

4.5.1 Sắc ký bản mỏng:

Điều kiện: dùng bản mỏng Silcagel 60 Faz¿ có kích thước 3x12cm

Hệ dung môi khai triển là hỗn hợp acetat etyl — alcol mety] — acetic acid

với các tỉ lệ khác nhau

Thuốc thử hiện vết là acid sunfuric đậm đặc

Để khai triển sắc ký trên bản mỏng, sản phẩm thô được hòa tan trong alcol

metyl

4.5.2 Sắc ký bản mồng điều chế:

Thực hiện sắc ký bản mồng điều chế với điều kiện sau:

Ban mong Silicagel loai TLC glass Silicagel (Merck); 0,25mm (Hoạt hóa 1

giờ, 110°C) Giữ nguội bản trong bình hút Ẩm

4.6 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu:®”

Acetat etyl: Đun hoàn lưu acetat e(yl thương mại với anhydrid acetic

khoảng 2 giờ Sau đó chưng cất phân đoạn Lấy sản phẩm ở phân đoạn 77C,

làm khan bằng MgSO,

Alcol metyl: Đun hoàn lưu alcol metyl thương mại với bột Mg (khoảng hai

giờ) trên bếp cách thủy để loại nước Chưng cất phân đoạn, lấy sản phẩm ở phân

đoạn 64 đến 65”C

Alcol etyl: Alcol etyl thương mại được xử lý tương tự như alcol metyl Sau

đó chưng cất phân đoạn, lấy sản phẩm ở phan doan 78°C.