Nghiên cứu và biện luận kết quả về thành phần hóa học trong phân đoạn phân cực từ lá tươi cây trinh nữ hoàng cung

Nghiên cứu và biện luận kết quả về thành phần hóa học trong phân đoạn phân cực từ lá tươi cây trinh nữ hoàng cung

PHẦN NGHIÊN CỮU

YA BIEN LOAN SEC QUA

Phần Nghiên Cứu Trang 15

7

3 PHẦN NGHIÊN CỨU VÀ KET QUA

3.1 Thu hái và xử lý mẫu:

Lá cây Trinh nữ Hoàng Cung được thu hái ở vườn cây thuốc Phân Viện Hoá

học các Hợp chất Thiên nhiên tại Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí minh Loại bổ

những phần sâu bệnh, rửa sạch, để khô ráo Mẫu này dùng cho việc nghiên cứu 3.2 Xác định độ ẩm, hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong lá

Cân chính xác 100 lá tươi Trinh Nữ Hoàng Cung, đặt vào lò nung ở nhiệt độ

600°C trong 3 giờ cho đến khi mẫu trở thành tro trắng Trọng lượng tro là l Ig Như vậy hàm lượng tro của mẫu là 11%

3.2.3 Xác định hàm lượng các nguyên tố vô cơ trong lá

Phân tích các nguyên tố vô cơ trong tro của lá bằng phương pháp phát xạ

nguyên tử thu được kết quả ở bảng 2 Kết quả cho thấy phát hiện được 17 nguyên

tố có trong tro của lá trồng tại Thủ Đức trong đó hàm lugng Si, Al, Mg, Ca, Na va

Fe cao

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cửu Trang 16

Lấy 5kg lá tươi cây Trình Nữ Hoàng Cung xay nhuyễn với 10 lít ELOH 96%,

thỉnh thoảng lắc nhẹ để trong L5 ngày, sau đó lọc, địch lọc được cô cạn dưới áp

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 17

4.3.1 Điều chế các loại cao

3.1.1.1 Điều chế cao ete đầu hoá

2 lít dụng địch mẫu lần lượt trích với dung địch ete dâu hỏa 300mlx 5 =1500

mì sau đó làm khan với Na;SOx¿ cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa

3.3.1.2 Điều chế cao CHCh

Phần dịch nước sau khi đã trích với ete đầu hóa, được tiếp tục tận trích với CHCl, 400x5 =2000m! lam khan véi NaSOu, vA c6 can dung dich duéi 4p suất

thấp thu được cao CHCh

3.3.1.3 Diéu ché cao EtOH

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phân Nghiên Cứu Trang 18

- Cô dưới ấp suất thấp còn 2 lít

- Tận trích với ete đầu hoá 1,5 lít

ete dau hoa

Tan trich vGi CHC), 2 lit - Lam khan với NaaSO,

- Cô cạn dưới áp suất thấp - Cô cạn dưới áp suất thấp

Phần Nghiên Cửa Trang 19

3.4 Cô lập một số hợp chất trong cao CHC];

Thực hiện sắc ký cột trên cao CHƠI, chất hấp phụ silicagel, dụng môi giải

ly là ete dầu hỏa, CHCH,, MeOH và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dẫn

Theo đõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mồng với hệ dung môi giải ly

1a CHCh:MeOH 9:1, thuốc thứ hiện vết là dung địch HạSO„¡0%/ELOH Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại

Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao CHC]; cho 12 phân đoạn

Ở phân đoạn Õ với dung môi giải ly CHCH: MeOH 95:5 sau khi cô cạn dung môi cho cặn mầu vàng nhạt (0,42g) Sắc ký lớp mồng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCI;: MeOH 9:1, thuốc thử hiện vết là HạSO,10%/E:OH cho hai vết mầu vàng, một vết đậm R; = 0,51 và một vết mờ Rr= 0,47,

ở phân đoạn I với dung mdi gidi ly CHCi,; MeOH 90:10 sau khí cô cạn dụng môi cho cặn màu vàng (0,538) Sắc ký lớp móng sHicagel trên cặn này với

hệ dung môi giải ly là CHCH: MeOH 9:1, thuốc thử hiện vết là dung dịch

H,S0,10% / ELOH cho 2 vết màu vàng, một vết đậm với giá trị R; = 0.44 và một vết mờ với Rr= OAI

Kết quả sắc ký cột silicagel trên 4g cao CHC|; được tóm tắt ở bảng 3

Luận Văn ¡ Thạc Si Héa Hoc

Phần Nghiên Cứu Trang 21

E= ete dau hod, C= CHCl, Me = MeOH

3.4.1 Cô lập hợp chất TRụ

Thực hiện sắc ký cột silicagel phân đoạn G, dung mồi giải ly là CHCH,

MeOH va hén hợp của chúng với độ phân cực tăng dan

ý Theo đõi quá trình sắc ký cột bắng sắc ký lớp mồng với hệ dung môi giải ly

là CHCl, MeOH 9:1 thuốc thử hiện vết là HạSO,10%/EIQH, các phân đoạn có

giá trị R; giếng nhau trên sắc ký lớp mỗng được gộp lại

Kết quả sắc ký cột được tóm tất trong bang 4

Kết quả quá trình sắc ký cột phân đoạn G thu được 60 phận đoạn Phân

đoạn 28 ~ 38, hệ dung môi giải ly CHCh: MeOH 96 : 4 (550m)), cô cạn dung môi thu được cặn màu vàng nhạt, kết tính nhiều lần trong aceton cho bột dạng vô định

hình màu trắng (25mg), đặt tên TRỤ,

Tiến hành sắc ký lớp mồng silicagel trên sẵn phdm TR,, hé dung m6i gidi ly

CHCl, MeOH 9: | thuốc thử hiện vết là H;SO,L0%/EIOH, cho một vết mầu vàng R;= 0,55 (Hình Ì)

Luận Văn Thạc Šï Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 22

rr - -Đ-Đ

Hình.I : Kết quả sắc ký lớp mỏng silicagel của hợp chất TRạ

Dung ly : CHCl; - CH30H 9: 1 Thuốc thử hiện vết :H;SO„!10%/EtOH

1 vết, Rị = 0,55

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phan Dung ly Thể tích | Trọng lượng Sắc ký lớp Ghi

Cứu Trang 24

3.4.2 Cô lập hợp chat TR;

Thực hiện sắc ký cột silicagel phân đoạn I, dung môi giải ly là CHCH,

MeOH và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dân

Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mồng với hệ dung môi giải ly

là CHCH: MeOH 9: 1 thuốc thử hiện vết là H;SO¿10%/ELONH, các phân đoạn có

giá trị R; giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại

+

Kết quả sắc ký cột được tóm tắt trong bảng 5

Kết quả quá trình sắc ký cột phân đoạn Ï thu được 60 phận đoạn Phân đoạn 25-38, hé dung môi giải ly CHCH;: MeOH 90: 10 (700m), cô cạn dụng mdi thu

được cặn màu vàng, kết tỉnh nhiều lần trong aceton cho bột đạng vô định hình

màu vàng nhạt (28mg), đặt tên TRạ

“ CHC)1;: MeOH 9:1 thuốc thử hiện vết là HạSO/,10% / ELOH, cho mội vết mầu vang Ry = 0,44 (Hình 2)

Ludn Vin Thac Si Héa Hoc

Phần Nghiên Cứu Trang 25

Hình 2 : Kết quả sắc ký lớp mỏng silicagel của hợp chat TR;

Dung ly : CHCl, - CH,0H 9: | Thuéc tht hién vét :H,SO,10%/EtOH

Phân Nghiên Cứa Trang 26

Phân Nghiên Citu

3.5 Cé lap mat sé hdp chat trong cao thé EtOH

Cao thô ELOH được tính chế qua cột polymer pha đáo Dianion HP-20 Dung môi giai ly 1A H,O, MeOH 50%, MeOH 80%, va MeOH 100% Mỗi phân đoạn tương ứng với từng đụng môi được kiểm tra qua sắc ký lớp mỏng, thuốc thử hiện vết là H;SO,10%/EIOH

Ở phân đoạn MeOH 80% kiếm tra qua sắc ký lớp mỏng thấy xuất hiện nhiều vết đậm và rõ nét Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát phân đoạn này

Kết quả sắc ký cột Dianion HP ~ 20 được tóm tắt theo sơ đồ 2

Sơ đỗ 2:

Sơ đỗ điều chế cao MeOH:

Cao thé EtOH 275g

Phần Nghiên Cứu Trang 28

———————-—ỄễễỄễễễ Ắễ —-— D Ề_—

3.5.1 Khảo sát phin doan MeOH 80%

Thực hiện sắc ký cột silicagel trên phân đoạn này, với hệ dung môi giải ly

là CHCI;, MeOH và H;O và hỗn hợp của chúng

Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi giải ly

là CHCI;:MeOH:HO 65:35:10 thuốc thử hiện vết là HạSO,10%/EtOH các phân

đoạn có giá trị R¡ giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại

Kết quả sắc ký cột được tóm tắt trong bảng 6

Kết quả quá trình sắc ký trên cao MeOH 80% thu được 12 phân đoạn Ở

phân đoạn Mạ với hệ dung môi CHC];: MeOH : HạO 65 : 35 :2, sau khi cô can dung môi thu được cặn màu vàng Tiến hành sắc ký lổng mỏng trên cặn này với

hệ dung ly CHC]; : MeOH : HO 65 : 35 : 10 thuốc thử hiện vết là H;SO¿10% / EtOH, thu dude | vét dam và 2 vết mờ với các giá trị R là 0,49, 0,41 và 0,35

Ở phân đoạn M¿ với hệ dung ly môi CHC]; : MeOH : HO 65:35:6 sau khi

cô cạn cũng thu được chất cặn màu vàng đậm Sắc ký bản mồng trên cặn này với

hệ dung môi CHC]; : MeOH : HO 65 : 35 : 10 thuốc thử hiện vết là H,SO,10%/EtOH, thu dude | vét dim va 2 vét mé vdi cdc gid tri Ry 1a 0,34, 0,30, 0,26

—— —== Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 29

Bảng 6 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao MeOH 80% (5g )

3.5.1.1 Cơ lập hdp chat TR,

Tiếp tục thực hiện sắc ký cột silicagel pha dao RP-18 phan doan Mg (940mg) với hệ dụng mơi HạO và MeOH và hỗn hợp của chúng Kiểm tra quá

trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mồng Các phân đoạn cĩ giá trị R¿ giống nhau

được gộp chung lại

Kết qủa quá trình sắc ký cột silica àel pha đảo RP-18 thu được 60 phân đoạn

Ở phân đoạn HO : MeOH 60:40 sau khi cơ cạn dung mơi thu được chất cặn màu vàng nhạt Kiểm tra lại trên sắc ký lớp mỏng pha đảo RP-1§ cặn này với hệ dụng mơi giải ly là HạO:MeOH 6:4 thuốc thử hiện vết là HạSO,10% / ELOH, cho

2 vết, một vết đậm với giá trị Rr = 0,58 và một vết mờ R; = 0,51, Kết qủa quá trình sắc ký cột siHcagel pha đảo RP-18 được tĩm tất bằng 7

Tiến hành sắc ký cội sHicagel trên phân đoạn 28-37 (220mg) với hệ dung mơi

CHCI, MeOH và H;O Kiểm tra quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với

hệ dung ly CHCI : MeOH : HO 6ã ; 35 : 1Ơ thuốc thử hiện vết là H;SO¿10%/EIOH G phân đoạn với hệ dung mơi giải ly CHCH : MeOH : HO ĩ5 :35 :2 sau khi cơ cạn thu được bột chất rắn mầu vàng, sau khi kết tính lại trong hỗn hợp CHC] và MeOH thu được dang bột vơ định hình màu vàng 43mg, đặt tên TR¿, kiểm tra qua sắc ký lớp mỏng với hệ dung ly CHỚI; : MeOH :HạO 65: 35: 1Ơ thuốc thử hiện vết là dung dịch H;SO,105/HIOH thấy xuất hiện 1 vết mầu vàng với giá trị R; = 0,49 (Hình 3)

Kết qúa sắc ký cột phân đoạn 26-37 (220mg) được tốm tắt trong bảng 8

Luận Văn Thạc Sĩ Hĩa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 33

—_ —ễỄễ

Hình 3 : Kết quả sắc ký lớp mỏng silicagel của hợp chất TR,

Dung ly: CHCl, : CH:OH: HạO 65 :35:10 Thuốc thử hiện vết :H;SO,10%/EtOH

1 vết, Rr= 0,49

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 34

Kết qủa quá trình sắc ký cột silica gel pha đáo RP-18 thu được 6Ó phân đoạn

Ở phân đoạn HO : MeOH 70:30 sau khi cô cạn dụng môi thu được chất cặn màu vàng nhạt Kiểm tra lại trên sắc ký lớp mỏng pha đảo RP-l8§ cặn này với hệ

dụng môi giải ly là HạO:MeOH 6:4 thuốc thử hiện vết là H;SO¿10%/E:OH, cho 2

vết, một vết đậm với giá tri Ry = 0,53 và một vết mờ R; = 0,46 Kết qủa quá trình

sắc ký cột silicagel pha đảo RP-1§ được tóm tắt bang 9

Tiến hành sắc ký cột silicagel trên phân đoạn 19-29 (143mg) với hé dung môi CHCh, MeOH và H;O Kiểm tra quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mồng

v6i hé dung ly CHCl, : MeOH : H,O 65: 35: 10 thuốc thử hiện vết là

H;SO„10%/E:OH Ở phân đoạn với hệ dung môi giải ly CHC|; : MeOH : HạO 65

:35 : 4 sau khi cô cạn thu được bột chất rắn mầu vàng, sau khi kết tình lại trong

hỗn hợp CHCI; và MeOH thu được dạng bột vô định hình màu vàng 2Ìmg đặt tên TR, kiểm tra qua sắc ký lớp mỏng với hệ dung ly CHCH ; MeOH: HạO 65: 35: 10 thuốc thử hiện vết là dung dich H,SO,10%/EtOH thấy xuất hiện 1 vết màu vàng với giá trị R¡ = 0,34 (Hình 4)

Kết qủa sắc ký cột phân đoạn 19-29 (220mg) được tóm tat trong bang 10

dö21oodonnnnrre as GBBEBooODA —

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Hoc

Phân Nghiên Cứu Trang 35

Phân | Dungly | Thể tích | Trọng lượng Sắc ký lớp Ghi chú

Phần Nghiên Cứu Trang 36

Phân Dungly Thể tích | Trọng lượng | Sắc ký lớp mồng | Ghi

Phân Nghiên Cứu Trang 37

— —-

Hình 3 : Kết quả sắc ký lớp mỏng silicagel của hợp chất TRạ

Dung ly: CHCI: CHẠOH: HạO 65 :35:10 Thuốc thử hiện vết :H;SO,10%/EtOH

1 vét, Ry = 0,34

Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 38

3.5.2 Thuy phan san phém TR, va TR, [40]

Thực hiện phẩn ứng thuỷ phân trên sản phẩm TR„ và TRạ với dung dich HCl 2N/MeOH Đun hoàn lưu hỗn hợp phản ứng trong 4 giờ, để nguội, tận trích với CHC];, phần nước được trung hòa với dung dịch Na;CO; đến pH=7, thực hiện sắc

ký bản mỏng trên dịch nước với hệ dung môi giải ly là aceton:2-propanol:axit

acetic: 35:45:3, thuốc thử hiện vết là dung địch anilin phtalat, so với đường glucoz

và galactoz, cho thay R; = 0,33 tring vdi đường glucoz, va R= 0,24 (galatctoz)

Phần Nghiên Cứu Trang 39

==———=

Hình 5: Kết quả sắc ký lớp mỏng silicagel

Phân đường của TR¿, TRe, glucoz va galactoz

Dung môi giải ly: aceton:2-propanol:axit acetic: 35:45:3

Thuốc thử hiện vết là dung dịch amilin phtalat

h ~ Luận Văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 40

3.6 Kết qủa va biện luận

Thực hiện sắc ký cột cao CHC]; và cao MeOH trên cột silicagel pha thường,

pha đảo với nhiều hệ dung ly khác nhau, đồng thời kết hợp với sắc ký cột Dianion HP-20 chúng tôi đã cô lập được bốn hợp chất tinh khiết Từ các kết quả

phân tích phổ nghiệm chúng tôi đã xác định các hợp chất này là: (E) - p-hidroxi cinnamat metyl, (E)-3,4-dihidroxi cinnamat etyl, kaempferol 3- 0 -B -D- glucopyranosid và kaempferol 3,4°-đi-0 -B -D—glucopyranosid

3.6.1 Khảo sát cơ cấu của hợp chat TR,

3.6.1.1 Kết quả nghiên cứu trén hgp chat TR,

TR, thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng, kết tinh trong aceton nhiệt độ nóng chảy 124 - 127 ° C Hợp chất này cho phản ứng màu xanh đậm với dung dich FeCl, /MeOH Vay nó là một dẫn xuất của phenol

* Sắc ký lớp mồng:

Thực hiện sắc ký lớp mỏng trên sản phẩm TRịạ, với hệ dung môi giải ly là CHCl: MeOH 9: I thuốc thử hiện hình là HạSO/10%/EtOH cho một vết màu vàng với giá trị R¡ = 0,55

* Phương pháp phổ nghiệm:

- Khối phổ MS (phu luc 1)

Khối phổ cho thấy mũi ion phan ttt m/z =178 (M’)

- Phổ hồng ngoại IR, v (KBr) em” (phụ lục 2)

Phổ hồng ngoại của TRị cho các mũi hấp thu cực đại ứng với dao động của

các nhóm O-H (3394cm''), nhóm C = O tiếp cách (1708 cm’), C=C huong phương (1600, 1513 cm?) và nhóm C~ O (1034 cm’)

=—=—N =

Luận văn Thạc Sĩ Hóa Học

Phần Nghiên Cứu Trang 41

- Pho °C NMR 8 (ppm) cia TR, két hop véi phé DEPT bang (12), (phu luc 4,5)

Bảng 12: Phổ !C NMR kết hợp với phổ DEPT hợp chat TR,

157,8 Không xuất hiện >C=

168,0 Không xuất hiện >C=

Luận văn Thạc Sĩ Hóa Học