Kết quả và thảo luận : xác định tổng ARSEN vô cơ bằng tổng ARSEN hữu cơ trong thủy hải sản

Kết quả và thảo luận : xác định tổng ARSEN vô cơ bằng tổng ARSEN hữu cơ trong thủy hải sản

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các thông số trên hệ ICP-OES và hệ hydride

Trong giai đoạn khảo sát này, tín hiệu được ghi nhận ở cả hai bước sóng 188.980 nm và 193.696 nm Đây là hai vạch nhạy nhất của arsen trong phổ phát xạ plasma ghép cặp cảm ứng

3.1.1 Khảo sát tốc độ dòng bổ trợ

Dùng chuẩn As(III) 10 μg/L để khảo sát dòng bổ trợ Ở ba tốc độ dòng được khảo sát là 0.75 L/phút, 1.5 L/phút, 2.25 L/phút, tín hiệu đạt cao nhất ở tốc độ 0.75 L/phút Càng tăng tốc độ dòng lên, tín hiệu thu được càng giảm Điều này có thể do lượng khí Ar tăng lên đã pha loãng chất phân tích trong khí plasma làm giảm cường

Hình 3.1 - Đồ thị khảo sát dòng bổ trợ

3.1.2 Khảo sát tốc độ dòng plasma

Dòng plasma là dòng khí có nhiệm vụ làm mát thành thạch anh của đuốc ICP Khảo sát dòng plasma ở các tốc độ khác nhau, kết quả từ đồ thị cho thấy tín hiệu cao nhất ở tốc độ dòng 13.5 L/phút

Khảo sát dòng plasma

300 350 400 450 500 550

Hình 3.2 - Đồ thị khảo sát dòng plasma

3.1.3 Áp suất dòng tạo sương

Khảo sát áp suất dòng tạo sương trong khoảng từ 120 kPa đến 220 kPa Từ đồ thị cho thấy ở áp suất 140 kPa, cường độ phát xạ đạt cực đại, áp suất càng cao cường độ phát xạ càng thấp Điều này có thể giải thích do dòng tạo sương là dòng đưa mẫu trực tiếp vào trong plasma Trong plasma mẫu sẽ lần lượt bị hóa hơi, nguyên tử hóa, kích thích và ion hóa bởi plasma Khi áp suất dòng tăng nhanh thì khả năng mẫu chưa kịp ion hóa đã bị đẩy ra ngoài tức là thời gian lưu của mẫu trong quang lộ giảm dẫn đến cường độ phát xạ giảm đi

Khảo sát áp suất dòng tạo sương

250 350 450 550 650

Hình 3.3 - Đồ thị khảo sát áp suất dòng tạo sương

3.1.4 Nguồn cấp tần số vô tuyến (RF)

Khảo sát nguồn cấp tần số vô tuyến từ 1 đến 1.5 kW, nhận thấy công suất càng

tăng thì cường độ phát xạ cũng tăng theo Đồ thị khảo sát nguồn cấp RF được thể

hiện ở hình sau:

Khảo sát nguồn cấp RF

200 400 600 800 1000

Hình 3.4 - Đồ thị khảo sát nguồn cấp RF

Trong hệ ICP-OES, sự ổn định của plasma, cường độ đường nền, tỉ lệ tín

hiệu/nhiễu bị ảnh hưởng từ sự cài đặt nguồn cấp RF Thông thường, nguồn cấp RF

được cài đặt trong khoảng từ 1.00 – 1.30 kW Nếu mẫu ở dạng dung dịch hữu cơ,

chúng ta có thể tăng công suất cài đặt từ 1.20 – 1.45 kW Cần lưu ý rằng, khi dùng

nguồn cấp công suất cao (1.5 kW), khả năng làm nóng chảy đuốc ICP sẽ tăng theo

Một số ví dụ về cài đặt nguồn cấp RF đối với một số dạng mẫu khác nhau:

Dạng mẫu Nguồn cấp RF (kW)

Mẫu dạng muối 1.3

Mẫu chứa chất hữu cơ dễ bay hơi 1.5

Từ những lý do trên, chúng tôi nhận thấy công suất 1.3 kW phù hợp để xác

định arsen tổng và arsen vô cơ trong mẫu hải sản

3.1.5 Khảo sát nồng độ HCl

Khảo sát nồng độ HCl trong khoảng từ 0.5 M – 6 M Kết quả khảo sát như sau:

Khảo sát nồng độ HCl

200 300 400 500 600

Hình 3.5 - Đồ thị khảo sát nồng độ HCl

Trong hệ hydride xảy ra phản ứng oxy hóa khử và tạo thành hợp chất arsine dễ bay hơi:

H3AsO3 (aq) + BH4- (aq) + H+ (aq) → AsH3 (g) + H2 (g) + H3BO3 (aq)

Cường độ phát xạ tăng đáng kể khi nồng độ HCl tăng từ 1 đến 5 M Ở nồng độ HCl cao hơn, tín hiệu tăng rất ít Để giảm thiểu sự hao mòn thiết bị và tiêu tốn hóa chất, nồng độ HCl 5 M được chọn để thực hiện các thí nghiệm về sau

Khảo sát nồng độ NaBH4

0 500 1000 1500 2000 2500

Hình 3.6 - Đồ thị khảo sát nồng độ NaBH 4

Ghi chú: Các khảo sát trên cho thấy tín hiệu ở bước sóng 188.980 nm luôn

cao hơn tín hiệu ở bước sóng 193.696 nm (là bước sóng thường dùng để phân tích

arsen đối với hệ AAS) Do đó, chúng tôi chọn bước sóng 188.980 nm để thực hiện

các thí nghiệm về sau (xem phụ lục 1)

3.1.7 Khảo sát quá trình khử As(V) về As(III)

Kết quả khảo sát hiệu suất khử As(V) về As(III) bằng KI/acid ascorbic 5%

được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 - Khảo sát hiệu suất khử As(V) về As(III)

bằng KI/Acid ascorbic 5%

Int (c/s) Nồng độ lý

Đường chuẩn As(V) đến 30 μg/L

y = 126.54x + 30.338

R 2 = 0.9999

0 1000 2000 3000 4000 5000

Hình 3.7 - Đồ thị đường chuẩn As(V) đến 30 μg/L

y = 113.66x + 161.56

R 2 = 0.9937

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

0 10 20 30 40 50 60

Hình 3.8 - Đồ thị đường chuẩn As(V) đến 50 μg/L

Trong khoảng nồng độ từ 5 đến 30 μg/L, hiệu suất khử As(V) về As(III) đạt trên 95% Ở đây, chúng tôi không khảo sát nồng độ khử KI/acid ascorbic vì nồng độ khử là nồng độ phần trăm, lớn hơn rất nhiều so với nồng độ chất cần khử (ở nồng

độ 10-9) Từ đồ thị hai đường chuẩn trên, nhận thấy độ tuyến tính khá tốt, KI/acid ascorbic 5% được dùng làm chất khử khá ổn định trong khoảng nồng độ từ 1 đến 50 μg/L Ở nồng độ 50 μg/L, hiệu suất khử thấp hơn Tuy nhiên, kết quả này thấp không hẳn là do hiệu suất khử thấp Nguyên nhân có thể khi nồng độ mẫu tăng thì

độ nhớt và sức căng bề mặt của mẫu cũng tăng, ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình đưa mẫu vào trong plasma [6]

Bảng 3.2 - Tóm tắt các điều kiện thí nghiệm trên hệ ICP-OES kết hợp hydride

3.2 Khảo sát qui trình phân tích arsen tổng

3.2.1 Khảo sát điều kiện khử As (V) về As(III) bằng KI/Acid ascorbic

Trong một số tạp chí nghiên cứu qui trình phân tích arsen, hầu hết quá trình

khử As(V) về As(III) được thực hiện ở nhiệt độ phòng [14,22,24] Một số tạp chí

khác đặt điều kiện khử ở nhiệt độ 50 0C [27] Để có điều kiện khử tốt nhất, chúng

tôi thực hiện khảo sát quá trình khử ở những nhiệt độ và nồng độ khác nhau

Kết quả khảo sát hiệu suất khử được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 - Khảo sát nhiệt độ khử As (V) về As(III) bằng KI/Acid ascorbic

Hiệu suất khử (%) (n=5) Điều kiện khử

Mẫu + 8 μg/L Mẫu + 16 μg/L Mẫu + 20 μg/L TB Nhiệt độ phòng 96.1 ± 2.0 96.2 ± 2.7 95.8 ± 1.3 96.0 ± 3.6

50 0C 95.1 ± 3.5 96.0 ± 2.0 95.8 ± 1.6 95.6 ± 4.6

70 0C 103.0 ± 2.7 106.1 ± 1.5 104.2 ± 1.4 104.4 ± 3.4

90 0C 107.7 ± 2.7 114.2 ± 2.3 111.9 ± 2.65 111.3 ± 4.4

Nhận xét:

Từ bảng kết quả trên cho thấy hiệu suất khử As(V) về As(III) ở nhiệt độ phòng

và ở 50 0C trong một giờ là gần bằng nhau (trên 95%) Ở những nồng độ khác nhau, hiệu suất khử không thay đổi nhiều Acid ascorbic thêm vào có tác dụng ngăn cản

sự oxy hóa I- thành I2 bởi oxy không khí hay Fe3+ Tuy nhiên, khi khử ở nhiệt độ cao hơn, hiệu suất khử vượt quá 100%, dung dịch đem đi phân tích có màu vàng nhạt Có thể giải thích hiện tượng này như sau:

AsO43-+ 2 I -+ 2 H+ → AsO33- + I2 + H2O

C6H8O6 + I2 → C6H6O6 + 2 I- + 2 H+

Acid ascorbic là chất nhạy với nhiệt độ và ánh sáng, ở nhiệt độ cao có thể bị phân hủy chuyển thành C6H6O6, mất tác dụng phản ứng với I2 sinh ra I- làm lượng I2

dư trong dung dịch tăng lên Khi phân tích bằng phổ phát xạ nguyên tử, lượng I2 dư

có thể phát ra những vạch cộng hưởng gây cản nhiễu phổ ảnh hưởng đến quá trình phân tích arsen làm kết quả sai số dương [33]

Bảng 3.4 - Khảo sát thể tích H 2 SO 4 phá mẫu cá thu

Thể tích

H2SO4

(mL)

Khối lượng mẫu (g) Int (c/s)

Hàm lượng As (μg/kg)

Hàm lượng As (μg/kg)

(CH2O)n + 4nHNO3 → nCO2 + 4nNO2 + 3nH2O Đối với hệ ICP-OES, acid có nhiệt độ sôi cao như acid sulfuric có khuynh hướng ngưng tụ lại trong thành đuốc ICP, sau một thời gian sẽ gây ra hiện tượng

bao phủ làm torch bị quá nhiệt Ngoài ra, đuốc ICP bằng thạch anh với cấu hình hướng trục mà chúng tôi dùng phân tích arsen đặc biệt bị ảnh hưởng khi tiếp xúc với dung dịch chứa nồng độ acid lớn Đó là lý do chúng tôi dùng acid sulfuric ở mức thấp nhất trong quá trình phá mẫu.[18]

3.2.3 Thể tích dung dịch đem khử

Từ các kết quả phân tích arsen tổng qua các thí nghiệm khảo sát trên cho thấy hàm lượng arsen khá thấp Thông thường kết quả này dao động trong khoảng từ 0.99 – 3.6 mg/kg [14] tùy loài hải sản Chúng tôi nhận thấy theo qui trình trên, sau khi phá mẫu bằng bộ phá mẫu Tecator, lọc mẫu và định mức đến 25 mL, lượng mẫu đem đi khử là 5 mL Để phần mẫu phân tích đại diện cho lượng mẫu rắn ban đầu đã được đồng nhất, chúng tôi quyết định dùng toàn bộ lượng mẫu đem đi khử Qui trình khử lúc này như sau:

- Sau khi phá mẫu trên bộ Tecator, để nguội mẫu trong ống phá mẫu Thêm 5

mL HCl đậm đặc, 5 mL KI/Acid ascorbic, để yên một giờ Lọc mẫu cho vào bình định mức 100 mL, định mức bằng nước cất

Bảng 3.6 - Kết quả phân tích hàm lượng arsen tổng

3.2.4 Hiệu suất thu hồi arsen tổng

Dạng arsen chiếm nhiều nhất trong hải sản và cũng là dạng arsen khó phân hủy nhất, đó là arsenobetaine Phân hủy được AB thì các dạng khác cũng sẽ bị phân hủy

Do đó, hiệu suất phân hủy AB đại diện cho hiệu suất thu hồi phương pháp Để xác định hiệu suất thu hồi của qui trình xác định arsen tổng, chúng tôi dùng một chuẩn

khó phân hủy là AB và một chất dễ phân hủy là DMA thêm vào mẫu và thực hiện qui trình phân tích tương tự như mẫu

Kết quả hiệu suất thu hồi được thể hiện ở bảng 3.7 và 3.8

Bảng 3.7 - Hiệu suất phân hủy DMA trên mẫu

m (g) Int (c/s)

As trong mẫu

và chuẩn (μg/kg)

As trong mẫu (μg/kg)

Nồng độ chuẩn DMA(μg/kg)

Hiệu suất (%)

Hiệu suất

TB (%) 1.0332 2969.02 2685.24 1409.21 81.07

As trong mẫu (μg/kg)

Nồng độ chuẩn DMA(μg/kg)

Hiệu suất (%) Hiệu suất TB (%) 1.1844 3098.51 2445.03 1089.16 82.84

Bảng 3.9 - % As được tìm thấy khi vô cơ hóa mẫu bằng HNO 3

AB

TMAO 23 ± 12 94 ± 3 97 ± 4 91 ± 2 21 ± 5TETRA 4.5 ± 2 4 ± 1 3 ± 1 2 ± 1 -

Ở nhiệt độ 100 0C, AB bị phân hủy một ít thành DMA và TMAO Khi nhiệt độ lên đến 180 0C, AB giảm chỉ còn 17%, ngược lại TMAO lên đến 71% Ở nhiệt độ

200 0C, không tìm thấy dạng AB trong dung dịch phá mẫu, còn TMAO chiếm trên 90% Khi nhiệt độ lên đến 240 0C, TMAO mới bắt đầu bị phân hủy Ở nhiệt độ 300

0C trong 30 phút, TMAO vẫn còn được tìm thấy khoảng 20 %, và acid arsenic là 76%

Ngoài DMA và AB, các dạng arsen hữu cơ khác cũng không chuyển hóa hết 100% về acid arsenic Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi dùng bộ phá mẫu Tecator gia nhiệt đến 350 0C rồi 400 0C kết hợp với hệ thống đuổi khí để tránh khí

NO2 bay ra ngoài môi trường Việc kết hợp với hệ thống bơm để đuổi khí nhằm đảm bảo an toàn môi trường, nhưng đồng thời làm tăng khả năng lôi cuốn mẫu bay hơi theo dòng khí làm giảm hiệu suất thu hồi Chúng tôi thực hiện thêm thí nghiệm kiểm tra hiệu suất thu hồi của DMA và AB trên chuẩn trong điều kiện phá mẫu ướt tương tự như qui trình xác định arsen tổng

Lấy 0.5 mL chuẩn DMA 2.912 μg/mL và 0.5 mL chuẩn AB 2.58 μg/mL cho vào ống phá mẫu, thực hiện qui trình phá mẫu như trên, ghi nhận kết quả Mỗi thí nghiệm lặp lại 5 lần, song song với mẫu trắng

Bảng 3.10 - Hiệu suất phân hủy DMA trên chuẩn

Int (c/s)

Nồng độ As tính toán (μg/L)

Nồng độ DMA

lý thuyết

Hiệu suất trung bình (%)

Bảng 3.11 - Hiệu suất phân hủy AB trên chuẩn

Int (c/s)

Nồng độ As tính toán (μg/L)

Nồng độ AB

lý thuyết

Hiệu suất trung bình (%)

Bảng 3.12 - Bảng so sánh hiệu suất phân hủy (%) của DMA và AB

trên chuẩn và mẫu

DMA AB

Nhận xét:

Kết quả so sánh hiệu suất phân hủy của DMA và AB trên chuẩn và mẫu không

sai lệch nhiều Mặc dù kết quả phân tích AB đã đủ để kết luận về hiệu suất thu hồi

nhưng chúng tôi vẫn thực hiện khảo sát với một chất dễ phân hủy là DMA để so

sánh Hiệu suất phân hủy của DMA và AB gần tương đương nhau, dù AB là chất

khó phân hủy hơn DMA rất nhiều Do đó, qui trình phá mẫu này khá ổn định, có thể

áp dụng để xác định hàm lượng arsen tổng trong các dạng mẫu hữu cơ khác nhau

3.2.5 Định trị phương pháp xác định arsen tổng

3.2.5.1 Đường chuẩn As(III)

Phương trình đường chuẩn As(III) được dùng để xác định hàm lượng arsen

tổng và arsen vô cơ Tùy thuộc vào hàm lượng arsen có trong mẫu mà chúng tôi sẽ

chuẩn bị mẫu sao cho nồng độ cuối nằm trong khoảng tuyến tính Khảo sát đường

chuẩn As(III) trong khoảng từ 0 μg/L đến 30 μg/L, kết quả khảo sát đường chuẩn được thể hiện ở bảng 3.13 và phụ lục 2

Bảng 3.13 - Số liệu xây dựng đường chuẩn As (III)

Chuẩn Nồng độ ( μg/L) (trung bình) Int (c/s)

Hình 3.9 - Đồ thị đường chuẩn As(III)

Phương trình hồi qui: y = 106.57x + 12.357

Hệ số tương quan : R2 = 0.9999

3.2.5.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD) được dùng để đánh giá độ nhạy của phương pháp phân tích Đối với thiết bị, giá trị LOD càng thấp nghĩa là hàm lượng tối thiểu của chất phân tích được phát hiện càng thấp và độ nhạy của thiết bị càng cao

Đối với hệ ICP, LOD được tính theo công thức sau:

LOD = 3σnềnGiới hạn định lượng (LOQ) là hàm lượng nhỏ nhất có thể định lượng một cách chính xác theo phương pháp đã chọn LOQ được tính như sau:

LOQ = 10σnềnTrong đó: σnền : độ lệch chuẩn cường độ phát xạ của 10 mẫu trắng đo lặp lại

Từ phương trình đường chuẩn As(III) suy ra nồng độ LOD, LOQ tương ứng

Cụ thể, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng trên mẫu được tính như sau:

m: khối lượng mẫu (g)

Kết quả khảo sát LOD và LOQ của phương pháp xác định arsen tổng như sau:

Bảng 3.14 - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

3.3 Khảo sát qui trình phân tích arsen vô cơ

Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu qui trình xác định tổng arsen vô cơ bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ sau khi thủy phân mẫu trong môi trường acid đậm đặc Tóm tắt phương pháp xác định arsen vô cơ: hòa tan mẫu bằng HCl đậm đặc, khử bằng hydrazine sulfate và HBr, tiếp đó chiết bằng chloroform, giải chiết bằng HCl pha loãng, tro hóa mẫu, khử mẫu bằng KI/acid ascorbic và định lượng bằng ICP-OES kết hợp với bộ hydride

Thủy phân mẫu bằng acid không có tính oxy hóa như HCl vừa làm biến tính hoàn toàn các protein trong mẫu, cắt đứt liên kết giữa As(III) với nhóm thiol để giải phóng As(III) tự do, vừa không làm thay đổi cấu trúc hóa học của các dạng arsen hữu cơ khác Sau khi bị thủy phân trong môi trường HCl đậm đặc, As(III) tồn tại ở dạng AsCl3 hòa tan tốt trong CHCl3 Ở giai đoạn này, chúng tôi tiến hành giải chiết mẫu bằng HCl mà không đun đuổi CHCl3 vì quá trình đun đuổi có thể lôi cuốn cả AsCl3 gây mất mẫu Sau khi giải chiết mẫu bằng HCl, trong quá trình cô cạn mẫu, chất trợ nung và HNO3 được thêm vào nhằm hạn chế đến mức thấp nhất sự bay hơi của AsCl3

3.3.1 Khảo sát thể tích acid dùng thủy phân mẫu

Đầu tiên, khảo sát ở nồng độ HCl phá mẫu là 9 M Thêm 5 mL nước và 15 mL HCl đậm đặc vào 1 g mẫu Ngay lập tức, mẫu bị keo tụ khi tiếp xúc với acid, vì thế acid không thể thâm nhập vào các protein để cắt đứt các liên kết giữa As(III) và nhóm thiol Để tránh hiện tượng này, cần phải làm ướt đều mẫu trước khi cho HCl đậm đặc vào

Sau khi bị thủy phân, mẫu sẽ được chiết bằng 10 mL dung môi chloroform Quá trình này thường tạo nhũ tương gây khó khăn trong việc tách pha Nguyên nhân là do các protein trong mẫu không bị thủy phân hoàn toàn Do đó, chúng tôi kéo dài thời gian thủy phân mẫu từ 15 giờ đến 20 giờ ở nhiệt độ phòng (để qua đêm) Bằng cách này, chúng tôi đã thành công trong việc làm biến tính các protein,

giảm hiện tượng tạo nhũ tương trong suốt quá trình tách chiết As(III) ra khỏi nền protein

Kết quả khảo sát nồng độ HCl thủy phân mẫu được thể hiện ở bảng 3.15

Bảng 3.15 - Khảo sát nồng độ HCl thủy phân mẫu

VHCl

(mL) V (mL) nước Nồng độ HCl (mol/L) Khối lượng mẫu (g) Int (c/s)

Arsen vô cơ (μg/kg)

vô cơ từ pha acid Từ đồ thị khảo sát cho thấy, nồng độ acid 10.8 M (tương ứng với thể tích HCl là 18 mL) đủ để làm biến tính hoàn toàn protein để giải phóng arsen vô

cơ

3.3.2 Khảo sát giai đoạn khử trước

Để thu được phương pháp xác định arsen vô cơ có tính chọn lọc cao, cần thực hiện bước khử trước As(V) về As(III) Chất khử thường dùng nhất là KI Một số nghiên cứu trước đây đã dùng KI làm chất khử trước khi chiết arsen vô cơ bằng chloroform

Vì đây là giai đoạn quan trọng quyết định hiệu suất thu hồi phương pháp, chúng tôi dùng chất chuẩn DMA và AB để xem xét khả năng các arsen hữu cơ này

có bị chiết cùng hay không khi phản ứng với chất khử KI Lần lượt khảo sát phản ứng khử của DMA và AB với 5 mL hỗn hợp KI/acid ascorbic 5 % (m/v), thời gian phản ứng khử trong 1 giờ Thêm 15 mL HCl đậm đặc, thực hiện chiết bằng chloroform, chiết ngược lại bằng HCl 1M

Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.16

Bảng 3.16 - Kết quả khảo sát hiệu suất chiết khi dùng chất khử KI/acid ascorbic

Int (c/s) Chất

bình

Nồng

độ (μg/L)

Nồng độ

lý thuyết (μg/L)

Hiệu suất chiết (%)