Thực nghiệm : xác định tổng ARSEN vô cơ bằng tổng ARSEN hữu cơ trong thủy hải sản

Thực nghiệm : xác định tổng ARSEN vô cơ bằng tổng ARSEN hữu cơ trong thủy hải sản

CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất

- Dung dịch chuẩn arsen (V) (AsO4)3- 1000 mg/L (Merck)

- Arsenic trioxide As2O3 (Riedel de-Haen)

- Dung dịch chuẩn dimethylarsinic acid (DMA)(Chem Service)

- Dung dịch chuẩn arsenobetaine (AB) (Fluka)

- Sodium tetrahydroborate (NaBH4) (Kanto Chemical)

- Chloroform (Prolabo)

- Sodium hydroxide (NaOH) (Merck)

- Acid ascorbic (C6H8O6) (Merck)

- Potassium iodide (KI) (Merck)

- Hydrazine sulfate (Merck)

- Hydrogen peroxide 30 % (H2O2) (Merck)

- Acid hydrobromic 47 % (HBr) (Merck)

- Acid hydrochloric 36 % (HCl) (Prolabo)

- Acid nitric 68 % (HNO3) (Merck)

- Acid sulfuric 98 % (H2SO4) (Prolabo)

- Magnesium nitrate (Mg(NO3)2) (Prolabo)

Tất cả hóa chất thuộc loại tinh khiết phân tích

Chuẩn bị hóa chất

2.1.1 Dung dịch chuẩn gốc As(V) 1000 mg/L

- Dung dịch chuẩn As (V) trung gian 1 (10 mg/L): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L vào bình định mức 100 mL, định mức đến vạch bằng dung dịch HNO3 1%

- Dung dịch chuẩn As (V) trung gian 2 (100 μg/L): hút 1 mL dung dịch chuẩn trung gian 1 vào bình định mức 100 mL, định mức bằng dung dịch HNO3 1 %

2.1.2 Dung dịch chuẩn gốc As(III) 1000 mg/L

Cân chính xác 0.132 g As2O3, hòa tan bằng một lượng thể tích nhỏ nhất NaOH 20%, acid hóa bằng HCl 1:1, định mức đến 100 mL bằng nước cất [3]

- Dung dịch chuẩn As (III) trung gian 1 (10 mg/L): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc As (III) 1000 mg/L vào bình định mức 100 mL, định mức đến vạch bằng HCl 0.24M

- Dung dịch chuẩn As (III) trung gian 2 (100 μg/L): hút 1 mL dung dịch chuẩn 2.2.1 vào bình định mức 100 mL, định mức đến vạch bằng HCl 0.24 M

- Dung dịch chuẩn As(III) làm việc (1, 5, 10, 20, 30 μg/L): lần lượt hút 1, 5, 10,

20, 30 mL chuẩn 2.2.2 vào các bình 100 mL, định mức đến vạch bằng HCl 0.24 M

2.1.3 Hỗn hợp dung dịch khử KI/Acid ascorbic 5% (m/v): cân 5 g KI và 5 g acid

ascorbic cho vào becher, khuấy đều cho tan, cho hỗn hợp vào bình định mức 100

mL, định mức đến vạch bằng nước cất

2.1.4 Dung dịch NaBH 4 0.6% (m/v): hòa tan 3 g NaBH4 bằng NaOH 0.5%, định mức đến 500 mL Sử dụng trong ngày

2.1.5 Dung dịch hydrazine sulfate 1.5 % (m/v): cân 1.5 g hydrazine sulfate cho vào

becher, khuấy đều cho tan, định mức đến 100 mL bằng nước cất

2.1.6 Dung dịch HCl 5 M chạy hydride: lấy 210 mL HCl đậm đặc pha loãng đến

500 mL bằng nước cất

2.1.7 Dung dịch trợ nung: cân 20 g Mg(NO3)2 cho vào becher khuấy đều cho tan, định mức đến 100 mL bằng nước cất

2.2 Thiết bị và dụng cụ

2.2.1 Máy quang phổ phát xạ ICP-OES hãng Varian model 720-ES series kết hợp

với bộ hydride (hệ VGA-77)

2.2.2 Bộ phá mẫu Tecator 6 ống kết hợp với bình đuổi khí chứa dung dịch NaOH

5 % (m/v) và bơm chân không

2.2.3 Máy ly tâm

2.2.4 Lò nung

2.2.5 Bếp cách cát

2.2.6 Ống nhựa ly tâm có nắp

2.2.7 Pasteur pipet

2.2.8 Bình định mức, pipet các loại và các dụng cụ thủy tinh thông thường trong

phòng thí nghiệm

2.3 Nội dung khảo sát

2.3.1 Khảo sát các thông số trên hệ ICP-OES

Việc tối ưu hóa các thông số hóa lý rất cần thiết để thu được kết quả phân tích tốt nhất trên hệ thống HG-ICP-OES Để thu được kết quả phân tích có độ nhạy cao nhất và độ lệch chuẩn thấp nhất, chúng ta phải kiểm soát nhiều thông số thí nghiệm Arsen có thể được xác định ở cả hai dạng : As(V) và As(III) Tuy nhiên tốc độ tạo thành hydride của As(V) rất chậm, làm giảm độ nhạy phép phân tích Do đó, cần thiết phải khảo sát quá trình khử hoàn toàn dạng As(V) về As(III) Ngoài ra, các thông số khác trên thiết bị ICP và trong quá trình tạo hydride cũng phải được kiểm soát như: dòng bổ trợ, dòng plasma, nồng độ HCl, nồng độ NaBH4 Trong giai đoạn khảo sát này, tín hiệu được ghi nhận ở cả hai bước sóng 188.980 nm và 193.696 nm

Để khảo sát các thông số trên hệ ICP-OES, chúng tôi dùng chuẩn As(III) 10 μg/L (2.2.3) Các nội dung khảo sát bao gồm:

- Tốc độ dòng bổ trợ

- Tốc độ dòng plasma

- Áp suất dòng tạo sương

- Nguồn cấp tần số vô tuyến (RF)

2.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hydride

Kỹ thuật tạo hydride là kỹ thuật tách nguyên tố cần phân tích ra khỏi nền mẫu bằng cách chuyển thành dạng hóa hơi của nguyên tố đó Đây là kỹ thuật phân tích

hàm lượng vết đối với một số nguyên tố gặp khó khăn khi phân tích theo phương pháp thông thường như: Sb, As, Bi, Se và Sn

Các yếu tố cần kiểm soát trong kỹ thuật này là: nồng độ NaBH4, nồng độ HCl, nồng độ KI/acid ascorbic, tốc độ dòng mẫu, tốc độ dòng HCl và tốc độ dòng NaBH4 Tuy nhiên, đối với hệ ICP-OES kết hợp với bộ hydride mà chúng tôi thực hiện trong đề tài này, chúng tôi không thực hiện phần khảo sát tốc độ dòng mà chỉ khảo sát các thông số còn lại ảnh hưởng đến quá trình tạo hydride

2.3.2.1 Khảo sát nồng độ HCl

Nồng độ HCl là thông số quan trọng vì nó ảnh hưởng lớn đến hiệu suất của quá trình tạo hydride Thực hiện khảo sát ở các nồng độ HCl sau: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 M

2.3.2.2 Khảo sát nồng độ NaBH 4

Việc tối ưu hóa nồng độ NaBH4 được thực hiện trong khoảng nồng độ từ 0.2 % đến 1.0 % trong 0.5 % (w/v) NaOH

2.3.2.3 Khảo sát quá trình khử As(V) về As(III) [16]

Ở điều kiện nhiệt độ phòng và pH thấp (pH<1), dạng oxy hóa As(V) bị khử rất chậm bởi NaBH4 trong khi As(III) nhanh chóng chuyển thành arsine ngay sau khi phản ứng với NaBH4

BH4 - + 3 H2O + H+ → H3BO3 + 8 H

6 H + AsO33- + 3 H+ → AsH3↑ + 3 H2O

Để tăng tốc độ phản ứng và tăng độ nhạy phương pháp, tất cả As(V) phải chuyển về As(III) trước khi phản ứng NaBH4 Có nhiều chất khử dùng để khử As(V) về As(III) như: KI trong acid HCl đậm đặc, sodium sulfite, thiourea, L-cystine, hỗn hợp KI và acid ascorbic

Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy, KI riêng lẻ phản ứng với As(V) trong acid HCl đậm đặc mất thời gian từ 4 đến 5 giờ ở nhiệt độ phòng L-cysteine có thể khử As(V) về As(III) và tăng độ nhạy phương pháp Trong phạm vi nghiên cứu này,

chúng tôi chọn hỗn hợp khử là KI và acid ascorbic nồng độ 5 % (w/v) Acid ascorbic khi kết hợp với KI có thể ngăn cản sự oxy hóa I- thành I2 bởi oxy không khí hay Fe3+

AsO43-+ 2 I -+ 2 H+ → AsO33- + I2 + H2O

C6H8O6 + I2 → C6H6O6 + 2 I- + 2 H+

Để kiểm tra tính ổn định của quá trình khử và hiệu suất khử As(V) về As(III) khi dùng KI/acid ascorbic 5 % (m/v), chúng tôi thực hiện thí nghiệm khử As(V) ở nồng độ từ 1 μg/L đến 30 μg/L Qui trình cụ thể như sau:

Lần lượt cho vào bình định mức 100 mL dung dịch chuẩn As(V) 100 μg/L với các thể tích: 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 30.0, 50 mL Thêm vào 5 mL HCl đậm đặc, 5 mL KI/Acid ascorbic 5 %, để yên một giờ, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất rồi đem đi phân tích Nồng độ các dung dịch đem đi phân tích tương ứng là : 1, 5, 10,

20, 30, 50 μg/L

2.3.3 Khảo sát qui trình phân tích arsen tổng [11,14,22]

™ Mục đích

Hải sản là một trong những nguồn chứa arsen nhiều nhất trong khẩu phần ăn Arsen tồn tại trong hải sản ở những dạng hóa học khác nhau Để xác định tổng hàm lượng arsen trong mẫu sinh học, mẫu phải được vô cơ hóa hoàn toàn Việc phá mẫu bằng acid có tính oxy hóa sẽ cắt đứt liên kết cộng hóa trị As-C trong hợp chất arsen hữu cơ để tạo thành arsen vô cơ Tuy nhiên, đối với hợp chất arsen hữu cơ có nhiều nhóm methyl như AB, hợp chất arsen hữu cơ chiếm đa số trong hải sản, có tính bền vững cao Phương pháp vô cơ hóa mẫu khô hay ướt đều có thể oxy hóa chất hữu cơ

Vô cơ hóa mẫu khô có thể oxy hóa hoàn toàn chất hữu cơ ở nhiệt độ 450 – 800 0C, nhưng khả năng mất mẫu rất lớn do tạo thành các chất dễ bay hơi như chloride hay oxychloride Phương pháp phá mẫu ướt có thể thực hiện ở cả hai hệ kín và hở Nhiệt độ phá mẫu càng cao càng làm tăng cường độ oxy hóa Đối với AB, nhiệt độ phá mẫu có thể lên đến 320 0C

Trong các phương pháp phân tích arsen, phương pháp phổ phát xạ kết hợp với

kỹ thuật tạo hydride cho giới hạn phát hiện thấp, được áp dụng trong hầu hết các lĩnh vực như môi trường, thực phẩm, công nghiệp Tuy nhiên, một số arsen hữu cơ

có độ ổn định hóa học khác thường, gây khó khăn trong quá trình chuyển hóa định lượng về dạng hydride trong bước xử lý mẫu như arsenobetaine, arsenocholine, tetramethylarsonic acid, một số dạng phenyl độc hại như phenylarsonic acid, tetraphenylarsonium chloride Do đó, hiệu suất của qui trình phá mẫu có tầm quan trọng lớn trong việc xác định chính xác các dạng arsen hữu cơ trong kỹ thuật hydride

™ Qui trình chung xác định tổng arsen

Cân chính xác (đến 0.1 mg) khoảng 1 g mẫu ướt cho vào ống phá mẫu, thêm 5

mL HNO3 đậm đặc, 3 mL H2SO4 đậm đặc Phá mẫu trong bộ phá mẫu Tecator kiểm soát nhiệt độ Khí bay ra được hấp thu vào dung dịch NaOH 5 % (m/v) kết nối hệ thống bơm Nhiệt độ tăng từng bước đến 350 0C trong 1 giờ 30 phút và giữ ở nhiệt

độ đó trong 3 giờ Sau khi làm nguội ống, thêm 3 mL H2O2 và tăng nhiệt độ đến

400 0C và giữ trong 4 giờ Chuyển mẫu vào bình định mức 25 mL, định mức bằng nước cất (nếu mẫu còn cặn thì lọc bằng giấy lọc)

Lấy 5 mL mẫu vừa phá xong cho vào bình định mức 25 mL, thêm 5 mL dung dịch khử KI/Acid ascorbic, 2.5 mL HCl đậm đặc, để yên 60 phút, định mức đến vạch bằng nước cất rồi đem đi phân tích Dung dịch mẫu được đưa vào hệ ICP thông qua 2 bơm nhu động tạo thành arsine AsH3 Dạng hydride được tạo thành và tách ra từ hỗn hợp khí-lỏng cùng với khí argon đi vào plasma qua quá trình nguyên

tử hóa và cho tín hiệu arsen

2.3.3.1 Khảo sát nhiệt độ khử As (V) về As(III) bằng KI/acid ascorbic

Để đảm bảo quá trình khử As(V) về As(III) đạt hiệu suất cao nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ khử trên mẫu Sau khi phá mẫu bằng bộ phá mẫu Tecator, chuyển tất cả mẫu vào bình định mức 250 mL, định mức bằng HCl 1 M Dùng mẫu này để thực hiện khảo sát quá trình khử As(V) về As(III) như sau :

- Lấy 4 becher, cho vào mỗi becher 5 mL mẫu, 5 mL KI/Acid ascorbic 5 %, 5

mL acid HCl đậm đặc, để 4 becher ở bốn điều kiện khác nhau:

• Để yên 1 giờ ở nhiệt độ phòng

• Đun cách thủy 50 0C trong 1 giờ

• Đun cách thủy 70 0C trong 1 giờ

• Đun cách thủy 90 0C trong 1 giờ

Chuyển mẫu vào bình định mức 25 mL, định mức đến vạch bằng nước cất

- Để khảo sát hiệu suất thu hồi của các quá trình trên, chuẩn bị thêm 12 becher, lần lượt thêm chuẩn As(V) vào trong mẫu với các nồng độ khác nhau: 8 μg/L, 16 μg/L, 20 μg/L (tương ứng với 2 mL, 4 mL, 5 mL chuẩn As(V) 100 μg/L), thực hiện các điều kiện phản ứng tương tự như trên

Bảng tóm tắt các thí nghiệm khảo sát hiệu suất khử:

Điều kiện khử Mẫu Mẫu + 2 mL chuẩn Mẫu + 4 mL chuẩn Mẫu + 5 mL chuẩn

Nhiệt độ phòng Bình 1 Bình 5 Bình 9 Bình 13

2.3.3.2 Thể tích H 2 SO 4 phá mẫu

Trong mẫu hải sản chứa hàm lượng lớn AB, do đó cần thiết phải khảo sát lượng acid phá mẫu để quá trình vô cơ hóa mẫu xảy ra hoàn toàn

Thay đổi lượng acid H2SO4 thêm vào : 1.0 ; 2.0 ; 3.0 ; 4.0 ; 5.0 ; 6.0 mL, thực hiện quy trình phá mẫu như trên, ghi nhận kết quả

2.3.3.3 Thể tích dung dịch đem khử

Từ các kết quả phân tích arsen tổng qua các thí nghiệm khảo sát trên cho thấy hàm lượng arsen khá thấp Thông thường kết quả này dao động trong khoảng từ 0.99 – 3.6 mg/kg [14] tùy loài hải sản Chúng tôi nhận thấy theo qui trình trên, sau

khi phá mẫu bằng bộ phá mẫu Tecator, lọc mẫu và định mức đến 25 mL, lượng mẫu đem đi khử là 5 mL Với lượng mẫu này có thể không đại diện cho toàn bộ lượng mẫu vì các chất phải tham gia quá trình khử Do đó chúng tôi quyết định dùng toàn

bộ lượng mẫu đem đi khử Qui trình khử lúc này như sau:

- Sau khi phá mẫu trên bộ Tecator, để nguội mẫu trong ống phá mẫu Thêm 5

mL HCl đậm đặc, 5 mL KI/acid ascorbic, để yên một giờ Lọc mẫu cho vào bình định mức 100 mL, định mức bằng nước cất rồi đem đi phân tích

2.3.3.4 Hiệu suất thu hồi arsen tổng

Để xác định hiệu suất thu hồi của qui trình xác định arsen tổng, mẫu phải được chuẩn bị đồng nhất Qui trình chuẩn bị mẫu như sau:

Lấy khoảng 1kg mẫu cá thu phi lê xay nhuyễn Thêm 10 mL HCl đậm đặc, trộn đều Để yên mẫu khoảng một giờ để mẫu hoàn toàn đồng nhất

Cân chính xác 1 g ± 0.1mg mẫu, thêm vào mỗi mẫu 0.5 mL chuẩn DMA nồng

độ 2.912 μg/mL, 0.5 mL chuẩn AB 2.58 μg/mL, thêm tiếp 5 mL HNO3 đậm đặc, 1

mL H2SO4 đậm đặc, thực hiện qui trình phá mẫu như trên, ghi nhận kết quả

Thực hiện song song mẫu trắng

2.3.3.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Để xác định LOD, LOQ của phương pháp phân tích tổng arsen, chuẩn bị mẫu trắng không chứa chất phân tích Chạy mẫu trắng 10 lần, tính độ lệch chuẩn các lần chạy lặp lại, từ đó suy ra LOD và LOQ

2.3.4 Khảo sát qui trình phân tích arsen vô cơ [22,23]

Hải sản là một nguồn chứa lượng arsen nhiều nhất trong các loại thực phẩm, hầu hết arsen được tìm thấy trong cơ thể người là do dùng hải sản Arsen trong hải sản tồn tại ở nhiều dạng hóa học khác nhau, do đó mức độ độc tính và khả năng gây bệnh cũng khác nhau

Trong cơ thể sinh vật, As(III) liên kết với nhóm –SH của các protein và các thành phần phân tử lượng lớn Do đó, để chiết định lượng As(III) cần phải thủy phân các protein để cắt đứt liên kết S-As Một số phương pháp xác định arsen vô cơ được nghiên cứu trước đây thực hiện chiết arsen vô cơ bằng các dung môi hữu cơ Tuy nhiên, phương pháp này không thu được kết quả định lượng, hiệu suất thu hồi thấp Đó là do dung môi hữu cơ không thể phá vỡ liên kết giữa As(III) và nhóm thiol trong protein để giải phóng As(III) Trong trường hợp này, cần thiết phải dùng một acid không có tính oxy hóa (như HCl) làm biến tính hoàn toàn các protein trong mẫu mà không làm thay đổi cấu trúc hóa học của các dạng arsen hữu cơ Để chiết chọn lọc As(III) từ pha HCl về pha dung môi hữu cơ, nồng độ HCl phải từ 9

M trở lên Trong điều kiện này sẽ tạo thành As(III) halide được chiết định lượng bằng chloroform

Chúng tôi thiết lập phương pháp xác định arsen vô cơ như sau : thủy phân mẫu bằng HCl, khử mẫu trước bằng hydrazine sulfate và HBr, tiếp đó chiết bằng chloroform, chiết ngược lại bằng HCl, tro hóa mẫu, khử mẫu bằng KI/acid ascorbic, định lượng bằng ICP-OES kết hợp với bộ hydride

™ Qui trình xác định arsen vô cơ

Mẫu phải được đồng nhất kỹ trước khi phân tích Cân chính xác 1g mẫu (đến 0.1 mg) cho vào ống ly tâm nhựa có nắp đậy Thêm 15 mL HCl đậm đặc, đậy nắp

và lắc trong 1 giờ (hoặc đánh siêu âm) Để yên trong 12-15 giờ (hay để qua đêm) Thêm vào ống 2 mL HBr, 1 mL hydrazine sulfate (1.5% m/v), lắc trong 1 phút Thêm tiếp 10 mL CHCl3, lắc tiếp trong 3 phút Ly tâm ống trong 5 phút (2000 vòng/phút) Tách pha chloroform (ở lớp dưới) cho vào một ống khác Lặp lại qui trình chiết thêm 1 lần Gộp các pha chlorofom thu được và ly tâm một lần nữa Dùng pasteur pipet hút lượng acid còn dư ra

Chiết ngược lại arsen vô cơ trong pha chloroform bằng cách lắc với 10 mL HCl 1 M trong 3 phút Ly tâm, tách pha nước ở lớp trên Thực hiện qui trình chiết thêm một lần nữa, tất cả cho vào chén sứ

Thêm vào chén sứ 2.5 mL chất trợ nung (Mg(NO3)2.6H2O 20%), 5 mL HNO3

đậm đặc Làm bay hơi mẫu đến khô trên bếp cách cát và chuyển vào lò nung trong 2 giờ ở 450 0C

Hòa tan mẫu trở lại bằng 5 mL HCl 50%, chuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 25 mL đã có sẵn 5 mL dung dịch khử (KI/Acid ascorbic 5% m/v), để yên 1 giờ, định mức bằng nước cất rồi đem đi phân tích

2.3.4.1 Khảo sát nồng độ acid dùng thủy phân mẫu

Nồng độ HCl là một yếu tố quan trọng cần khảo sát để bảo đảm mẫu được thủy phân hoàn toàn Thí nghiệm khảo sát được tiến hành như sau :

- Chuẩn bị 6 ống nhựa phá mẫu, cân chính xác cho vào mỗi ống khoảng 1g mẫu, lần lượt cho vào lượng nước cất và thể tích HCl đậm đặc như sau :

STT V HCl (mL) V nước cất (mL)

- Sau khi thêm nước và acid, đậy nắp ống phá mẫu, cho vào bể đánh siêu âm trong 1 giờ, sau đó tiếp tục để mẫu qua đêm

- Thêm tiếp vào ống 2 mL HBr, 1 mL hydrazine sulfate (1.5% m/v), thực hiện qui trình phân tích mẫu như trên, ghi nhận kết quả