Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học cây an điền lá dầy, họ cà phê

Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học cây an điền lá dầy, họ cà phê

2 PHAN NGHIEN CUU

KET QUA

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây An điển lá dây được thực hiện trên các phương tiện kỹ thuật như sau:

** Phân lập các cấu từ hữu cơ bằng:

- Trích pha rắn silica gel 60H loại dùng cho sắc ký lớp mông, Merck

- Sắc ký cột nhanh với silica gel 60 (0,040 — 6,063mm), Merck

- Sắc ký lớp mỏng loại 25DC — Alufolein 20x20cm, Kiesel gel G0F.54,, Merck

- Sắc ký điều chế loại Art 5715; DC — Fertigplatten; Resel gel 60F 5,

Schichtdicke 0,25mm, Merck

- Một số thiết bị thí nghiệm khác:

Máy cô quay (thu hổi dụng môi dưới áp suất kém) RE — 111 Rotavapor kèm bếp đun cách thủy Buchi 461 Water Bath, b&p dun cách thủy LW ~ 8 Water Bath, phễu Buchner kết hợp bình tam giác có cổ ngang tạo hệ thống chân không

để sắc ký cột nhanh khô, cột sắc ký cổ điển, bình lóng,

s* Khảo sát cấu trúc của hợp chất báa học bằng:

- Đo điểm nóng chấy trên khối Maquenne

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy quang phổ hồng ngoại IR - 470 SHIMADU

của Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên,

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H - NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân

BRUKER AC 200, tần số cộng hưởng 500 MHz (hoặc 200 MH¿)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ''C ~ NMR kết hợp kỹ thuật DEPT ghi trên máy cộng hướng từ hạt nhân BRUKER AC 200, tần số cộng hưởng 125 MHz (hoặc 50

MHz)

-Phé LC-MS được ghi trên máy sắc ký lồng ghép khối phố LCQ-FINIGANT, cột

nhéi ADSERBPHERE UHF Ci8

in tim hiéu thanh piuẩn hóa học của câu cấn điện (d dâu 14

Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo tại Phòng phân tích cấu trúc hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18-Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu

Giấy - Hà Nội

2.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Thụ hái và xử lý mẫu

Cây An điền lá dây được thu hái ở các khu vườn ẩm gần sông, rạch thuộc

địa phận (khu vực chợ) xã An Nhựt Tân - huyện Tân Trụ - tỉnh Long An vào khoảng tháng 10 năm 2002

Cây tươi sau khi thu hái, loại bỏ những lá sâu bệnh, vàng úa, rửa sạch, để

ráo, làm khô, xay nhuyễn Riêng một số cây dùng để chuẩn bị định tính thì được

chọn riêng từng bộ phận hoa, lá, thân, rễ trước khi làm khô

2.1.2 Xác định độ ẩm

Cân rễ, thân, lá, hoa - trái (ở dạng tươi), mỗi bộ phận 20 gam, sấy ở nhiệt

độ 110°C đến khi trọng lượng không đổi, cân lại trọng lượng mẫu khô Kết quá

xác định độ ẩm được trình bày trong bảng 1

Độ ẩm = (Trọng lượng tươi — trong lượng khô) x100

2.1.3 Xác đỉnh hàm lượng tro

Cân rễ, thân, lá, hoa - trái (ở dạng khô), mỗi bộ phận 20 gam, nung mẫu

bằng bếp điện được đặt trong tủ hút để bay hết khói khi phá mẫu Sau đó, cho

lêm Lá đâu 15

mẫu vào th nung ở 150°C khoảng 2 giờ rồi tăng tiếp nhiệt độ đến 600°C khoảng 2

giờ nữa Quá trình nung được kết thúc khi mẫu biến thành tro trắng hoàn toàn,

Kết quá xác định hàm lượng tro được trình bày trong bảng 2

2.3 KHẢO SÁT ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY

AN DIEN LA DAY

Trong cây có nói chung, thường có sự hiện điện của một số hợp chất hữu

cơ như: sterol, trierpen, alcaloid, flavon, tanin, glicosid, saponin Mỗi loại hợp

chất hữu cơ này có khả năng tạo màu hoặc kết tủa với những thuốc thử đặc trưng

Dựa vào đặc điểm đó, chúng tôi tiến hành khảo sát sự hiện diện của một số nhóm

hợp chất hữu cơ trong cây, nhằm làm cơ sở cho việc trích ly, cô lập các hợp chất

hữu cơ sau nay

2.2.1 Điều chế các loại cao

Bột cây khô được trích kiệt bằng etanol theo phương pháp ngâm dầm, lọc,

cô quay thu hổi dung môi, thu được cao etanol Cao etanol được trích pha rắn trên

silica gel, giải ly lần lượi bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân

cực: eter dầu hỏa, cloroform và metanol, dung địch giải ly qua cột được hứng vào

các lọ, mỗi lọ 100ml Cô quay, tiến hành sắc ký lớp mỏng Các lọ có sắc ký lớp

mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn, Kết quả thu được 4 phân đoạn

là: cao eter đầu hóa (1,35 g), cao cloroform A (1,35 g), cao cloroform B (3,96 g)

Và cao metanol (45 45g) Tổng thu suất cột là 68,84%,

Qui trình điều chế các loại cao nói trên được trình bày trong sơ đề 1, và thu suất điều chế các loại cao đó được trình bay trong bang 3

2.2.2 Khảo sát bằng phé héng ngoai (IR)

Các loại cao eter dầu hỏa, cao cloroform và cao metanol diéu chế như sơ

để 1, được khảo sát bằng phố IR nhằm thu thập những số liệu cơ sở ban đầu dựa trên các mũi phổ đặc trưng Kết quả phổ hông ngoại đo trên các loại cao được

trình bay trong bang 4

Bảng 4: Kế! quả phổ hông ngoại ảo trên các loại cao eter dầu hỏa, cao cloroform

A, B vé cao metanol

vem" (cwdng 46 mili)

Sự đồ 1: Qui trình điều chế các loại cao trên cây An điên lá dây bằng phương

pháp trích pha ran trén silica gel

Các bộ phận phần trên mặt đất của cây

- Phơi khê

- Xay nhuyễn

- Thu hồi dung môi

- Trich bing metanol

- Thu héi dung môi

ne của cầu cên điện (lá dầu 18

2.2.3 Khao sat bing sic ky lép méng

Sắc ký lớp mồng áp dụng trên cao eter đầu hổa, cao cloroform A, cao cloroform B và cao metanol giải ly bằng các hệ dung môi benzen : cloroform (1 : 1); benzen : cloroform : metanol (1: 9 :1 giot) va cloroform : metanol (9:1), phun

thuốc thứ hiện hình là H;ạSO, đậm đặc, sấy bản ở 110°C trong vài phút, Kết quả hiện hình các vết có giá tri Ry được trình bày trong hình 3,

** Nhân xét:

Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy cao cloroform và cao metanol đêu cho các vết rõ hoặc ít vết, hoặc tuy nhiều vết nhưng các vết cách xa nhau, nên chúng tôi sẽ lần lượt khảo sát các loại cao này Riêng cao eter dầu hỏa cho nhiều vết liền nhau, chúng tôi tạm thời không kháo sat

2.2.4 Khảo sát đỉnh tính một số hợp chất hữu cơ bằng các thuốc thử tham

gia phan ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa

e Định tính sterol và trierpen dựa trên phản ứng màu với các thuốc thứ LIEBERMANN - BURCHARD, SALKOWSKI và NOLLER

e Định tính alcaloid dựa trên các phân ứng trầm hiện với các thuốc thử

BOUCHARDAT, BERTRAND, DRAGENDORFF, HAGER, MAYER

e Binh tinh cdc hdp chat flavonoid dựa trên cdc phan ting mau với thuốc thử

SHIBATA

e Dinh tinh tanin difa trên các phần ứng tạo mầu va phan ứng trầm hiện với các thuốc thử STLASNY, gelaun mặn, dung dịch acetat chì bão hòa, dụng dich FeCh 1% trong nước

e Dinh tinh iridoid bing phan tng TRIM — HILL”,

® Binh tinh glicosid trén cao alcol dude điểu chế theo sơ đồ 2 với các thuốc thử BALIET và MOLISH

e Binh tinh saponin difa trén phan ting tao bot

lân từm lểu thànk phần hdah của câu cầu điển (dá dâu, 19

Kết quả định tính các cấu tử hữu cơ trong cây An điển lá đẩy được trình

Hình 3 : Kết quả sắc ký lớp mỏng trên các cao của sơ đồ 1

Cg : Cao eter đầu hỏa (dung môi giải ly eter đầu hỏa: ben zen (1:1)) C,.Cao cloroform A (dung môi giải ly ben zen : cloroform :

Cz : Cao cloroform B } metanol (1: 9: 1 giot)) Cue: Cao metanol (dung môi giải ly cloroform : metanol (9:1) )

Thuốc thử hiện hình : H;SO¿ đậm đặc

rắn, cô Lữ đồng, cô Bạch hoa xà thiệt thảo, cây An điển hai hoa và cây Hoa kưn

cương) và dựa vào nguyên tắc chung của quá trình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên để tiến hành trích ly, cô lập một số hợp chất hữu cơ có trong cây An điển lá day

2.3.1 Xứ lý cao cloroform A của sơ để 1

Cao cloroform A thu được, rửa nhiều lần bằng benzen rồi bằng cloroform, lọc đưới áp suất thấp, làm khô được bột trắng A (1,35 ø) Sắc ký lớp mông, giải ly bằng hệ dung môi cloroform : metanol (9:1) cho hai vết mỡ và hai vết mầu đỏ

cánh sen (1 rõ, đậm ; | hơi mờ) tách không xa Làm sạch bằng bột than Kiểm

tra bằng sắc ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu đổ cánh sen, gọi là mẫu CRAS-1 (0,955 8).

“âu nhận im hitu think ehin hba bọc của củu cận điền lú dậu 22

Hình 4 : Kết quả sắc ký lớp mỏng cao cloroform A và hợp chất CRAS-1

Ca Cao cloroform A của sơ đồ 1

C, : Hop chat CRAS-1

Dung môi giải ly benzen : cloroform : metanol (1 : 9: 1 giọt)

Thuốc thử hiện hình : HạSO¿ đậm đặc

Siáu phấn tìm hiểu thành chân báo “ha của của cên điện lá dâu 23

2.3.2 Sắc ký côt cao cloroferm B của sơ đề 1

Cao cloroform B (3,96 g) được nạp vào đâu cội silica gel Lần lượt giải ly

bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dẫn từ benzen đến metanol Đùng dịch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lo 50 ml Theo đối bằng sắc ký lớp móng, Các lọ có kết quả sắc ký lớp móng giống nhau được gom thành một phân

đoạn Thuốc thử hiện hình vết sắc ký là acid sulfuric đậm đặc Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 6

* Khảo sát phân đoan G của bảng 6

Phân đoạn G của bảng 6 là chất bột, màu trắng (1,8749 g), sắc ký lớp mồng cho 2 vết rõ (1 vết to, Ì vết nhỏ) và 1 vết mờ, tất cả đều có màu đó cánh

sen Vì vậy, chúng tôi quyết định sắc ký cột lần hai trên phân đoạn này,

- Nạp cột cao thu được từ phân đoạn G (1,8749 g) Giải ly cột bằng các hệ

dung môi tăng dân tính phân cực từ eter dầu hỏa đến metanol Dung dịch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml, theo đối bằng sắc ký lớp mông, những lọ cho kết quả sắc ký lớp mồng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 7

ne Số thứ tự Dung méi lượng | Dung môi ; Ghỉ chú

lọ giải ly cao gidily | Kết quả

> 0 iD 94 C:Me nhiều vết | không khảo

đáp phân tìm hiéu think phiin bóa học của câu cfn điện lá dâu 25

Phân đoạn E; của bảng 7 là chất bột màu trắng (1,209 g) sắc ký lớp mỏng

trên nhiều hệ dung ly khác nhau cho một vết tròn duy nhất, màu đỏ cánh sen

Chúng tôi tạm đặt tên nó là CRAS-3

Bảng 7: Kết quả sắc ký cột silica gel áp dụng trên phân đoạn G bảng 6

No Số thứ |_ Dung môi lượng | Dung môi Ghi chú

(mg)

B, | 14-45 (1:3) 13,1 (9:1:1giot) vết không khảo s

2.3.3 Sắc ký cột silica gel áp dụng trên cao metanol ở sơ đồ 1

Cao metanol (45,45g) được nạp vào đầu cột silica gel Lần lượt giải ly

bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ cloroform đến metanol Dung dịch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50ml Các lọ có kết quả sắc ký lớp mồng giống nhau được gom thành một phân đoạn Thuốc thử hiện hình vết sắc ký

‘GVHD : PGS.TS, Aguyén Kim Dhi Dhyng

26

là acid sulfuric đậm đặc Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 8

* Kết quả thu được gồm 7 phân đoạn, sắp xếp theo thứ tự từ A; đếnG;,

Trong đó, chỉ có phân đoạn C:,Da và F¿ là có lượng cao nhiều và sắc ký lớp mồng

cho ít vết, rõ rằng, nên chúng tôi chọn khảo sát tiếp

* Khảo sát phân đoan Л của bảng 8,

Phân đoạn D của bảng 8 có dạng cao, màu lục (205 mg) Chúng tôi tiến

hành sắc ký cột nhiều lần và sắc ký điều chế, giấi ly bằng dung môi

cloroform : metanol (9 : 1), thu được bột trắng (15,5 mg) Kiểm tra bằng sắc ký lớp móng trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất, tròn, mầu tím bồng đậm, chúng tôi đặt tên là hợp chất CRAS-ME1

* Khảo sát phân đoạn C¡ của bang 8

Phân đoạn C; của bảng 8 có dạng cao, màu vàng cam (316 mg) Chúng tôi

tiến hành sắc ký cột nhiều lần và sắc ký điều chế, giải ly bằng dung môi

eter dầu hóa : acetat etil (1:1), thu được 2 loại bột trắng : bột A (15,8 mg ) và bột B (9 mg) Kiểm tra bằng sắc ký lớp mống trên nhiều hệ dung ly khác nhau loại bội AÁ chỉ cho một vết duy nhất, tròn, mầu tím đậm , loại bột B chỉ cho một

vết tròn, mầu tím than, chúng tôi đặt tên lân lượt là hợp chất CRAS-ME2 và CRAS-ME3

* Khảo sát phân đoạn F, cha bang 8

Phân đoạn Fa của bang 8 c6 dang cao, mau cam (203,4 mg) Chúng tôi tiến

hành sắc ký cột nhiều lấn và sắc ký điểu chế, giải ly bằng dung môi

cloroform : metanol : acid acetic (9: 1:1 giot), thu được hai loại bột trắng (3,7

mg và 12mg) Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung ly khác nhau mỗi loại bột chỉ cho một vết duy nhất, tròn, mầu tím ngã sang xanh đương, chúng

tôi đặt tên là hợp chất CRAS-ME4 và CRAS-ME5

se phan tim hiéu thank phin hda hee cia ety An dién ld day 27

Bảng §: Kết quả sắc ký cột silica gel áp dụng trên cao metanol

No Số thứ Dung môi | lượng | Dung môi Ghi chú

F; | 357-421 (1:9) | 203,4 (9:1:1 hồng CRAS-ME 4

CRAS-ME5 Ea:Me (1 : 9) C:Me: Aa nhiều không khảo

* Kết quả:

Từ phân đoạn D; của cao metanol của cây An điển lá dây được điều chế theo sơ đỗ 1, sắc ký cột silica gel thu được hợp chất tình khiết là CRAS-MEI (thu

suất trên cao metanol là 0,034%)

Từ phân đoạn C¿ của cao metanol của cây An điển lá dây được điều chế theo sơ đồ !, sắc ký cột silica gel thu được 2 hợp chất tỉnh khiết là CRAS-ME2 và

CRAS-ME3 (thu suất trên cao metanol là 0,035% và 0,02%)

Từ phân đoạn F; của cao metanol của cây An điển lá dây được điều chế theo sơ đồ 1, sắc ký cột silica gel thu được hợp chất tính khiết là CRAS-ME4 và

CRAS-MES5 (thu suất trên cao metanol là 0,0004% và 0,0013%)

Phần khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất CRAS-MEI, CRAS-ME2

được trình bày trong mục 2.4.

Wink phan hde bọc của câu cên điện tá dâu 29

2.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC

Hợp chất CRAS-1 thu được từ cao cloroform AÁ, có các đặc điểm như sau:

* Chất bột màu trắng

# Điểm nóng chảy: 290-292°C (Kết tỉnh trong cloroform) (Lý thuyét 291°C)?"

* Sác ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung môi cloroform : metanol (9 : 1 ), phun

thuốc thử hiện hình là acid sulfuric đậm đặc, sấy bản ở 110°C cho một vết màu

đỏ cánh sen có giá trị R:ị= 0,56 (hình 4)

* Phổ LC.MS, ESI, (phụ lục số 1): có mỗi mẹ z,/z = 456 vậy hợp chất có khối

lượng phân tử M = 456 ngoài ra còn có các mũi ; 248 (100); 203 (100); 159 (48);

133 (100); 55(89)

* phé IR, KBr (phu lục số 2), v em” : 3428 (O-H), 2928, 2868 (C-H); 1691

(C=O của COOH); 1033 (C-O)

+ Phổ H-NMR, CDCl, (phu luc số 3), Sppm : 5,24 (1H, mỗi ba, -CH=); 3,20

(1H, mai đôi - đôi, I=8 Hz, >CH-OH) ; 1,08 4H, mũi đơn, H-27); 0,96 GH, mỗi đơn, H-26); 0,94 (3H, mũi đôi, H-30); 0,92 (3H, mũi đơn, H-25); 0,85 (3H, mãi đôi, H-29); 0,81 (3H, mũi đơn, H-23) và 0,77 (3H, mũi đơn, H-24),

* phổ 2C-RMN kết hợp với DEPT-135 RMN và DEFT-90 RMN, CDC,, (phụ

lục số 4 và 5), 5 ppm, : 180,80 (COOH); 138,31 (=C<) va 125,64 (CH=), 79,02 (-CH-OH) Ngoai ra cén c6 5 nguyên tử carbon tứ cấp, 9 carbon loại -CH-,

5 carbon loại >CH- va 7 carbon loại -CH¡

$ Biện luận cấu trúc

- kết quả sắc ký lớp mông hợp chất CRAS-1 cho vết màu đó cảnh sen khi hiện vết

bởi acid sulfic đậm đặc và có tính chất phân cực Dựa vào các mãi đặc trưng

trên các phổ IR (3428; 1691; 1033 cm"); °C-RMN (180,80 ppm) thuộc vùng từ trường thấp, chúng tơi dự đốn hợp chất CRAS-1 là một acid triterpen,

- Ngồi ra, từ các mũi đặc trưng thể hiện trên các phổ IR (3428 cm”), TH-RMN (3,48 pp) va 1C RMN (79,02 ppm) cho thấy hơn chất CRAS-I cịn cĩ một nhĩm -QH riêng (khơng phải -OH của nhĩm carboxyl)

- Phổ ÌC.RMN kết hợp với phổ DEPT-90 RMN cho 2 mũi cộng hưởng Ở vùng từ

trường thấp 138,31 ppm (loại carbon >C=) và 12564 ppm (loại carbon

-CH=), thể hiện trong hợp chất CRAS-1 cĩ chúa một nối đơi ở dạng -CH=C<

Từ các kết quả thu được, chúng tơi cho rằng CRAS-I là một bợp chất trierpen mà trong cấu trúc phân tử cĩ chứa l nhĩm -COOH, 1 nhĩm -OH và | nối đơi ở dạng -CH=C< Ngồi ra, nhận thấy hợp chất CRAS-1 cĩ điểm nĩng

chảy gần với điểm nĩng chấy của acid ursolic (2912C), nên chúng tơi chọn acid

ursolic làm chất chuẩn để đối chiếu

Tiến hành so sánh các số liệu trên phổ '”C-RMN của hợp chất CRAS-I với hợp chất chuẩn acid ursolic””, phổ MS của hợp chất CRAS-1 với hợp chất chuẩn

acid ursolicf”!, chúng tơi nhận thấy cĩ sự trùng khớp Kết quả so sánh được trình bay trong bang 9 va bang 10

Hợp chất CRAS-1 duge để nghị là acid 3ÿ-hidroxinrs-12-en-2B-ọc

( acid ursolie) với cấu trúc hĩa học phư sau:

tim hiéu thanh héa hoe cia eéy An dién li dầu 31

Bang 9: So sánh phổ !?C—RMN kết hợp với DEPT-135 RMN va DEPT-90 RMN của hợp chất CRAS-1 với chất chuẩn acid ursolicl?6)

242 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất CRAS-4 :

Hợp chất CRAS-4 thu được từ phần đoạn Đi của bảng 7 của cao cloroform

có các đặc điểm như sau :

* Chất kết tính trong metanol, dang bOt Tan trong hễn hợp cloroform - metanol

# Điểm nóng chảy: 161 - 163°C (kết nh trong metanol)

#* Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung môi benzen : cloroform: metanol (1 : 2:

1 giọt), phun thuốc thứ hiện hình lR acid sulfuric đậm đặc, sấy bản ở 120°C cho

một vết màu hồng cánh sen có giá trị Rị = 0,7 (hình 5).