Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây rau tàu bay

Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây rau tàu bay

cay Rau tau day -14- Nghiên cứu và kết quả

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây Rau tầu bay được thực hiện trên các phương tiện kỹ thuật như sau

% Phân lập các cấu tử hữu cơ

- Trích pha rắn silica gel 60H loại dùng cho sắc ký lớp mồng, Merck

- Sắc ký cột nhanh với silica gel 60 (0,040 — 0,063mm), Merck

- Sắc ký lớp mỏng loại 25DC — Alufolein 20x20em, Riesel gel 60Fa¿¿, Merck

- Sắc ký điều chế loại Art 5715; DC — Fertigplatten; Resel gel 60Fy54,

“ Khảo sát cấu trúc của hợp chất hóa học

- Phổ EI-MS ghi trên máy Hewlett Packard 3989B MS, Vanan MÁT 445

- Phổ LC-MSD-Trap-SL

- Đo điểm nóng chấy trên khối Maquenne

- Phổ hồng ngoại (R) ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BRUKER -IFS48-

+: Ca y Kau tau bay -15- Nghiên cứu và kết quả

2.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Thu hái và xứ lý mẫu

Cây Rau tau bay được thu hái ở huyện Bù Đăng, tính Bình Phước vào khoảng tháng § - 9 năm 2005 Cây đã được nhận danh bởi dược sĩ Phan Đức Bình, Bộ Môn Dược Liệu, trường Đại Học Y Dược TPHCM

Lá Rau tầu bay tươi sau khi thu hái, loại bổ những lá sâu bệnh, vàng da, được rửa sạch, để ráo, sấy khô, xay nhuyễn

2.1.2 Xác định độ Ẩm

Cân chính xác một lượng lá tươi, sấy ở nhiệt độ 110°C đến khi trọng lượng không đổi, cân lại trọng lượng mẫu khô Thực hiện ba lần, lấy giá trị trung bình,

_ (Trong lwong tuoi — trong ludng khd)

ba lần, lấy giá trị trung bình

Gay Kau lau Dây -16- Nghiên cứu và kết quả

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột lá khô được trích kiệt bằng etanol theo phương pháp ngâm dầm, lọc,

cô quay thu hồi dung môi, thu được cao etanol Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, benzen, cloroform và metanol, dung dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml Cô quay, tiến hành sắc ký lớp mồng Các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom chung lại với nhau Kết quả thu được 9 loại cao

Qui trình điều chế các loại cao nói trên được trình bày trong sơ đồ 1, va

thu suất điều chế các loại cao đó được trình bày trong bảng 1

Kết quả sắc ký lớp mỏng ở hình 10 cho thấy cao B, cao AE, tủa E và tủa

AE đều cho các vết rõ, nên được lựa chọn để khảo sát trong luận văn

Bảng 1: Lượng cao và thu suất của các loại cao trong sơ đồ 1

Loại cao Ký hiệu cao | Lượng cao (g) | Thu suất (%)

“vay sau Lau Day -17- Nghiên cứu và kết quả

Hình 10: Sắc ký lớp mỏng các loại cao của sơ đồ 1 1: Cao alcol ban đầu 5: Cao acetat etyl AE2

2: Cao eter dầu hỏa 6: Cao acetat etyl AE3

4: Cao cloroform

Hệ dung ly cloroform : metanol (9:1)

Thuốc thử hiện hình H;SO¿x đậm đặc

vay Kau lau Dây -18- Nghiên cứu và kết quả

Sơ đồ 1: Qui trình điều chế các loại cao trên cây Rau tàu bay

- Trích pha rắn trén silica gel,

giải ly bằng eter dầu hỏa

- _ Cô quay, thu hổi dung môi

- Thu hồi dụng môi

‹ V4 Y 4U tau bay -19- Nghiên cứu và kết quả

2.3 TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY

RAU TAU BAY

Hiện nay, có rất ít tài liệu công bố về thành phần hoá học của cây Rau

tàu bay Ở bước đầu khảo sát chúng tôi dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu

về những loài cùng chỉ và nguyên tắc chung của quá trình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên để tiến hành trích ly, cô lập một số hợp chất hữu cơ có trong cay Rau thu bay

2.3.1 Xử lý tủa E trong so 46 1

Trong quá trình thu hồi dụng môi để có cao eter dầu hỏa E, thấy xuất

hiện túa không màu, hình kim, Lọc, rửa nhiều lần bằng eter dầu hỏa, thu được

tủa (400 mg) Sắc ký lớp mồng giải ly bằng hệ dung môi cho một vết màu

hồng cánh sen sau đó chuyển sang tím đen Kết tình lại trong cloroform có xử

lý bằng than hoạt tính, sau đó kiểm tra lại bằng nhiều hệ dung ly khác nhau thấy chỉ cho một vết duy nhất, gọi là CREPI Er (120 mg) Kết quá sắc ký lớp

mong được trình bầy trong hinh 11

2.3.2 S4c ky cét silica gel 4p dụng trên cao benzen của sơ đô 1

Cao benzen (10,5 g) được nạp vào đầu cột silica gel Giải ly cột bằng hệ dụng môi (eter đầu hỗa : acetat eiyl) tăng dẫn tính phân cực từ 0 % acetat etyl đến 100 % acetat etyl Dung địch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50 ml,

theo đối cột bằng sắc ký lớp mông silica gel, những lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn, Kết quả sắc ký cột

được trình bày trong bằng 2

Nhân xét

Kết quả sắc ký cột trên cao benzen thu được 7 phân đoạn, được ký hiệu

từ B1 đến B7 Trong đó, phân đoạn B4 có sắc ký lớp mang cho hai vết đậm,

rõ ràng, nên chúng tôi khảo sát tiếp

vo bay Nau lau Day -20- Nghiên cứu và kết quả

Bảng 2: Kết quả sắc ký cột silica gel áp dụng trên cao benzen (m = 10,5 g)

Ghỉ chú: E: eter dầu hỏa; AE: acetat etyl

Các phân đoạn còn lại tuy cho nhiều vết hoặc vết dài trên sắc

ký lớp mỏng, đã có khảo sát nhưng không thu được hợp chất tỉnh khiết, nên chỉ

ghỉ ngắn gọn là: “Không khảo sát”

way nau iu Day -21- Nghiên cứu và kết quả

® Khảo sát phân đoạn B4 của bảng 2

2.3.3 Xử lý tủa AE trong sơ đề 1

Trong quá trình thu hồi dung môi để có cao acetat ctyl AE3, thấy xuất hiện tủa màu trắng bám trên bình cầu Rửa nhiều lần bằng eter đầu hóa, thu

được tủa AEr (850 mg) Sắc ký lớp mông giải ly bằng hệ dung môi cho một

vết mầu tím đậm Kết tính lại trong metanol có xử lý bằng than hoại tính nhiều lần Sắc ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung ly khác nhau đều cho một vết

tròn duy nhất, đặt tên là CREPI AEr (150 mg) Kết quả sắc ký lớp mông được trình bày trong hình 13

2.3.4 Sắc ký cột silica gel áp dụng trên cao acetat etyl AE2 của sơ đề 1 Cao acetat ety] AE2 (m = 3,8 g) được nạp vào đầu cét silica gel Lan lugt

giải ly bằng hé dung mdi (cloroform : metanol) tang dan tinh phan cuc t¥ 0 % metanol đến metanol 100 %, dung dịch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ

50 ml, các lọ có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bầy trong bằng 3

Nhận xét

Kết quá sắc ký cột trên cao acetat etyl AE2 của sơ để 1, thu được bây phân đoạn, sắp xếp theo thứ tự từ AE2-1 đến AE2-7 Trong đó, chúng tôi chỉ khảo sát phân đoạn AE2-2 vì sắc ký lớp móng thấy có hai vết rõ rằng

ts wuy anau tau Day -22- Nghiên cứu và kết quả

Hình 11 Sắc ký lớp mồng của

CREPI Er so với cao E

Hệ dung ly eter dầu hỏa : cloroform (3 :7)

Thuốc thử hiện hình H;SOa đậm đặc

Hình 12: Sắc ký lớp mỏng của

CREPI B4 so với phân đoạn B4

và cao benzen

Hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl (8 :2)

Thuốc thử hiện hình H;SO¿ đậm đặc

TuAn wan thac sĩ Hóa hoc Huynh Thi Thanh Loan

» Cay Kau tau bay -23- Nghiên cứu và kết quả

Bằng 3: Kết quả sắc ký cột silica gel của cao acetat etyl AE2 (m = 3,8 g)

Ghi chú : C-: cloroform; M: metanol

Các phân đoạn có nhiều vết cũng đã được khảo sát nhưng không

cô lập được chất tỉnh khiết nên chúng tôi ghỉ ngắn gọn là “Không khảo sát”

May Rau tau Day -24- Nghiên cứu và kết quả

® Khảo sát phân đoạn AE2-2 của bảng 3

Phân đoạn AE2-2 của bảng 3 dạng sáp xanh đen (576 mg), sắc ký lớp rỗng cho 2 vết đậm rõ, vì vậy, chúng tôi quyết định sắc ký cột lần hai trên phân đoạn nay Nap cột phân đoạn AE2-2 (576 mg) bằng hệ dung môi giải ly

(cloroform : metanol) tăng dần tính phần cực

Quá trình sắc ký cột phân đoạn AE2-2 thụ được chất dầu vàng (124,3 mg), sắc ký lớp mồng trên nhiều hệ dung ly khác nhau cho Ì vết tròn đậm có

đuôi phía đưới, Nhận thấy hợp chất này chưa thật tính khiết, chúng tôi tiến hành sắc ký điều chế nhiều lần, giải ly với hệ dung môi (cloroform :

metanol), thu được chất dầu không màu (20 mg) Kết quả sắc ký lớp móng qua nhiều hệ dung ly cho một vết tròn mầu cam duy nhất (hình 10) được đặt tên là hợp chất CREPI AE2

2.3.5 Sắc ký cột siHca gel áp dụng trên cao AKE3 của sơ đồ 1

Cao acetat ety! AE3 (m = 2,3 g) được nạp vào đầu cội silica gel Lần lượt gidi ly bang hé dung mdi (cloroform : metanol) tang dan tính phân cực từ metanol 0 % đến metanol 100 %, dung dịch qua cột được hứng vào các lọ, mỗi lọ 50 ml, các lọ có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành

một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bằng 4

Nhân xét

Kết quả sắc ký cột cao acetat eỳyi AB của sơ đồ 1 thu được 5 phân

đoạn, sắp xếp theo thứ tự từ AE3-] đến AE3-5 Trong đó, chúng tôi chỉ khảo sát phân đoạn AE2-2 vì sắc ký lớp mỏng thấy có hai vết rõ rằng

ns Vay wNau lau vay -25- Nghiên cứu và kết quả

Hình 13: Sắc ký lớp mồng của hợp chất CREPI AE2, CREPI AE3 và

CREPI AE; so với cao AE2 và AE3

1 Cao AE2 của sơ đồ 1

2 Hợp chất CREPI AE2

3 Cao AE3 của sơ đồ 1

4 Hợp chất CREPI AE3

5 Hợp chất CREPI AEr

Hệ dung ly cloroform : metanol (8 : 2)

Thuốc thử hiện hình là acid sulfuric đậm đặc

+ vay Kau lau Day

2

-26- Nghiên cứu và kết quả

Bảng 4: Kết quả sắc ký cột silica gel của cao acetat etyl AE3 (m = 2,3 g)

Ghi chú : C: cloroform; M: metanol

® Khảo sát phân đoạn AE3-3 của bảng 4

Phân đoạn AE23-3 của bảng 4 dạng sáp vàng (450 mg), sắc ký lớp mỏng cho 2 vết đậm rõ tách xa Vì vậy, sắc ký cột phân đoạn AE3-3 (m = 450 mg) giải ly bằng hệ dung môi (cloroform : metanol) tăng dần tính phân cực, thu

được chất dầu vàng (94,3 mg), sắc ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung ly khác

nhau cho 1 vết tròn đậm có vệt mờ Nhận thấy hợp chất này chưa thật tính

khiết, chúng tôi tiến hành sắc ký cột nhiều lần, giải ly với hệ dung môi

(cloroform : metanol), thu được chất dầu màu vàng nhạt (10 mg) Kết quả sắc

Cay Kau tau bay -27- Nghiên cứu và kết quả

Ký lớp mỏng qua nhiều hệ dụng ly cho một vết tròn màu nâu đậm duy nhất (hình 10) được đặt tên là hợp chất CREPI AE2

* Kết luận

Từ cao tủa E, cao B, tủa AE, cao AE2 và cao AE3 của cây Rau tàu bay

được điều chế theo sơ đồ 1, sắc ký cột silica gel nhiều lần và sắc ký điều chế

đã thu được các hợp chất tinh khiết đặt tên lần lượt là CREPI E, CREPI B4, CREPI AE, CREPI AE2 và CREPI AE3

Phần khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất này được trình bầy trong mục 32.4

kay Rau tau bay -28- Nghiên cứu và kết quả

2.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1, Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất CREPL Ex

Hợp chất CREPI Er thu được ở cao E của sơ đồ 1, có dang tinh thé hinh kim, màu trắng

* Nhiệt độ nóng chảy: 146 ~ 148°C (CHG;)

* Sắc ký lớp mồng: giải ly bằng hệ dung môi eter dầu hỏa : cloroform (2 :7), thuốc thử hiện hình là acid suifuric đậm đặc, sấy bản ở 110°C cho một vết duy nhất mầu đồ cánh sen có Rƒ = 0,42 (hình 11)

* Phổ 'H-NMR, CDCh, (phụ lục số 1); ổppm: 5,35 (2, 5Hz, -CH=); 5,14 (dd,

8,6Hz; 15,1 Hz, -CH=); 5,03 (dd, 8,8Hz; 15,4Hz; -CH=); 3,52 Gn, >CH - O-); 2,2 ~ 0,6 (proton cba nhóm ~CH, -CH¡¿, -CHạ)

+ Phổ C-NMR, DEPT-NMR CDCh, 6, ppm, (phu luc s6 2, 3): phổ đồ có

các mũi cộng hưởng với độ dịch chuyển hóa học được trình bày trong bang 5, s4 Biện luận cấu trúc CREPI Ey

* Hợp chất có sắc ký lớp mồng hiện mầu đổ cánh sen với thuốc thử acid sulfuric đậm đặc, nên được dự đoán là trierpen hodc sterol

* Ty phé 'H-NMR cho thấy một proton ở vị trí 5,35 ppm (CH=) và hai

proton ở vị tri 5,14 (dd, -CH=); 5,03 (da, -CH=) kết hợp với BC_NMR có thé

dự đoán rằng trong cấu trúc CREPI Er có chứa hai liên kết đôi, trong đó một

liên kết kiểu >C = CHl và liên kết còn lại kiểu -CH = CH-

+ Từ kết quá ''C-NMR phổ kết hợp với phố DEPT-NMR qua bốn mũi cộng

hưởng (140,78; 121,72), (138,33; 129,30) là đặc trưng của nối đôi C=C trong

các hợp chất sigmasterol và ÿ-sitosterol, vì thế chúng tôi chọn làm chất

“bay Rau lau Day -29- Nghiên cứu và kết quả

* Các số liệu phổ 'ÌC-NMR của CREPI Eạ được so sánh với các phổ tương

Ứng của stigmasterol và B-sitosterol Kết quả so sánh được trình bày trong bảng 13 cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai hợp chất

Như vậy CREPI E; là hỗn hợp của stigmasterol và B-sitosterol với tỉ lệ 2:1

2.4.2 Xác định cấu trúc hợp chất CREPI AE

Hợp chất CREPI AE+ thu được từ cao AE3 của sơ đổ 1 có dạng bột, màu trắng, với các đặc điểm sau:

* Điểm nóng chảy: 282 - 284°C (kết tính trong cloroform : metanol, tỉ lệ I:1)

* Sắc ký lớp mỏng hiện hình bằng acid sulfuric đậm đặc, giải ly bởi hệ dung

môi cioroform : metanol (8:2), vài giọt acid acetic cho vết mầu tím, có

Rf = 0,66 (hình 13)

* Phổ ‘H-NMR, CDC], (phu luc sé 4), & (ppm): 5,32 (1H, d, =CH-, H-6);

5,16 (0,5 H, dd); 5,02 (0,5 H, dd, H-23); 4,86 (-CH;OH của phần đường); 4,42

(>CH-OH của phần đường); 4,22 (1H, d, H-1’ 6 vi tri 8); 3,87-3,05 (m,

>CH-OH ctia H-1’, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’, H-6’) va 1,97-0,66 (proton cửa nhóm >CH-, -CH;-, -CH)

oe vay nau lau bay -30- Nghiên cứu và kết quả

Bảng 5: So sánh phổ '*C-NMR của CREPI E+ với B-Sitosterol và Stigmasterol 1%

| CREPI Er Stigmasterol B-Sitosterol

STT_[SC-NMR|_ Vi tri carbon! C- NMR| Loai carbon|Vi tri carbon| '?C- NMR_| Loại carbon