Phần thực nghiệm khảo sát hóa học cây lá xuyên tâm liên

Phần thực nghiệm khảo sát hóa học cây lá xuyên tâm liên

31 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

5.1.1 Nguyên liệu

Mẫu cây Xuyên Tâm Liên nghiên cứu là loại cây mọc hoang ở xã Chánh

Nghĩa, thị xã Thủ Dâu Một, tính Bình Dương Thu hái cây vào khoảng tháng 9

và tháng 10 trong năm, Nhận danh cây có tên khoa học là Andrographis Paniculata, Acanthaceae bởi PGS, Lê Công Kiệt, Bộ Môn Thực Vật, Trường Đại

Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phế Hồ Chí Minh

5.1.2 Hóa chất

-Hóa chất dùng trong quá trình chiết xuất: eter dầu hoa (60-90°C), alcol

et 95%, acetat etil, cloroform va benzen

-Hóa chất dùng trong quá trình sắc kí cột: slumin trung tính hiệu Merck,

benzen, cloroform và alcol metil

-Hóa chất dùng trong quá trình sắc kí bản móng: bằng mỏng siicagel loại TLC plastic roll 0,2mm-silicagel 60 Fa54, cloroform, alcol metil va acid H;SO, 50%

-Hóa chất dùng trong quá trình acetil hóa các sân phẩm cô lập: anhidrid acetic, clorur kém va piridin

Tình chế và xử lý các hóa chất trước khi làm thí nghiệm [33]

Eter dầu hỏa (60-90”C); sử dụng phần chưng cất phẩm ở phân đoạn 60-90°C, làm khan bằng sợi Na

Benzen: làm khan sơ bộ bằng CaCl;; sau đó lọc để loại CaCH; Chưng cất

phân đoạn, lấy phân đoạn ở 80-81°C N gâm dụng môi với sợi Na

Cloroform: cloroform thương phẩm thường chứa trên 1% alcol etil Để loại lượng alcol, lắc cloroform với lượng nước bằng 1⁄2 lượng cloroform (thực hiện

_ khoảng 5-6 lần) Dùng bình lóng tách bổ phần nước Làm khan dung môi với CaCl, khan; dé yên 24 giờ Lọc, chưng cất phân đoạn Lấy sản phẩm ở phân đoạn 61C Bảo quản dung môi tỉnh chế trong bóng tối

Chưng cất phân đoạn các dung môi: alcol medHl (64-65°C), alcol etil (78°C), acetat etil (77°C), anhidrid acetic (140°C) va piridin (115°C)

Alumin: ria alumin voi dung dịch HCI 5%; sau đó, rửa lại với nước cất

đến khi đạt pH = 7, tiếp đó rửa với alcol etil 95% Sấy khô dưới 150C Trước khi

sử dụng, sấy alumin ở 150C, trong 2 giờ

5, PHAN THC NGHEM

Trang G2

AMR a0 thee 6? Khoa hoc Hoe boo

3.1.3 Thiét bi -Dụng cụ dùng để ly trích là thiết bi Soxhlet loai 2lt và 10t

Dung cy ding dé thu hồi dụng môi dưới ấp suất kém là máy cô quay

hiéu BUCHI 461,

"Cột sắc kí có đường kính lcm, 1,5cm và 3em,

"Dụng cụ dùng để đo nhiệt độ nóng chảy là khối Maquenne,

-Phổ khối lượng được thực hiện trên máy 5989B MS của phòng Khối

Phố, Viện Hóa, Nghĩa Đô, Từ Liêm, Hà Nội,

-Phân tích nguyên tố được thực hiện trên máy phân tích nguyên tố tự

động của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm, số 2 Nguyễn Văn Thủ, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

-Phổ hồng ngoại được thực hiện trên máy quang phổ hồng ngoại IR-470 SHIMADZU của Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chi Minh va BRUKER-IFS48 * CARLO ERBA-GC6130 cda Trung Tâm Dịch

Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm

-Phổ tử ngoại được thực hiện trên máy quang phố tử ngoại KONTRON INSTRUMENTS UVIKON 922 của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm,

-Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR được thực biện trên máy cộng

hưởng từ hạt nhân 200 MH¿ hiệu BRUKER-AC2000 của Trung Tâm Dịch Vụ

Phân Tích và Thí Nghiệm

-Phổ cộng hướng từ hạt nhân “C-NMR được thực hiện trên máy cộng

hưởng từ hạt nhân 50 MH¿z biệu BRUKER-AC2000 của Trung Tâm Dịch Vụ

Phân Tích và Thí Nghiệm

5.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ CẤU TỬ

HỮU CƠ TRONG LA, THAN VÀ RỂ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN

5.2.1 Điều chế cao eter dầu hòa, cao benzen, cao cloroform và

cao alcol metil từ lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên

Nguyên liệu thô (1á, thân và rễ) được tận trích với các dung môi eter đầu hỏa, benzen, cloroform và alcol metil (2 lit) trong Soxhlet Loc, cd can dung mdi

ở 40°C thu được các loại cao Cho các cao này vào bình hút Ẩm chân không đến

khi trọng lượng không thay đổi, thu được các loại cao: cao eier đầu hỗa, cao

benzen, cao cloroform và cao alcol metil (sơ để 1, trang 12)

6, PHAN THC NGHEM

4 1h wi % wh

52 Phương pháp dinh tivh va dirh tong mot số cấu tử Wu co trong lá, thân và rễ cây

Trau 65

sual an thac sf Khoa hoc Hoa hoc

Bảng 41: Khối lượng các mẫu

Lá Cao eter dầu hỏa (60-90°C) 0,86

RE Cao eter dầu héa (60-90°C) 0,92

5.2.2 Định tính [23](34][35][36][37]

5.2.2.1 Sterol Điêu chế dung dịch thử:

- Hòa tan mẫu khô (1g) trong cloroform (20ml), lọc

- Hòa tan mẫu cao (0,1g) trong cloroform (30ml), lọc

Thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARD: Thuốc thử SALKOWSKI:

Phản ứng dương tính khi xuất hiện khi xuất hiện màu đỏ màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc đỏ

5, PHAN THJC NGHEM

52 Phương pháp dinh tinh va dinh Lrạng một số cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ cây

Trang 64

EN a thac 6? Khoa hoc Hoa hoe

5.2.2.2, Alealoid Điều chế dung địch thử: theo 2 phương pháp

- Trích mẫu (Šg) với dung dich Prollius (eter etil, cloroform, alcol etil 95% và NHẠOH, tỉ lệ 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lắc thường xuyên Lấy lớp hữu cơ Cô cạn dung môi cho cặn Hòa tan cặn trong HƠI 1% trong HO 6 80°C, trong Í giờ Lấy dịch lọc,

- Hòa tan mẫu (5g) trong dung dich HCl 1%, dun nhẹ 3 80°C trong

1 giờ Lọc

Phản ứng dương tính khi xuất Phần ứng đương tính khi xuất

hiện trầm hiện mầu nâu hiện trầm hiện mầu vàng nâu Thuốc thử BERTRAND: : Thuốc thử HAOGER:

- Acid silicotungstic Sg ~ Acid picric bao hoa trong

nước

- Nước cất 100ml

Phần ứng đương tính khi xuất

hiện trầm hiện mâu trắng đục,

Phản ứng dương tính khi xuất

hiện trầm hiện màu vàng

Thuốc thử DRAGENDORFF:

Đung dịch Á: BiNOab; 0,&5g, Dung dịch B: KĨ Sg

Nước cất 40ml

Phần ứng đương tính khi xuất hiện trầm hiện mầu đồ,

Š.2,2.3 GHcosid Điều chế dụng dịch thử:

Trích mẫu (5g) trích với alcol eul 60% (20ml) trong 24 giờ Lọc, chế hóa

dịch lọc với dung dịch acetat chì 20% (20ml) Lọc, chế hóa dịch lọc với dung dịch Na;SOx bão hòa (10ml) Lọc, cô can dung dich 6 40C, thu được cặn, Hòa tan cin nay trong alcol etil 95% va loc

52 Phương pháp ainh tính và đrh trợng rrột số cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ cây -

Trang OS

LU, an thac 67 Khoa hoc Hoa hoo

Thuốc thử TOLLEN:

Thuốc thử MOLISH:

-A iain, 0,05N 10ml

-Thimol xanh 2% 1-2 giọt

1ml

-Thêm NH,OH vừa đú để trầm hiện ma

4

tan,

Phan ting dương tính khi xuất

Phần Ứng đương tính khi xuất hiện lớp — hiện màu đổ

tráng bạc

5.2.2.4, Tanin

Điều chế dung dịch thử:

-Nấu mẫu khô (5g) với nước cất (100m]) trong 20 phút Lọc

Thuốc thử STIASNY: Thuốc thử gelatin mặn:

- Formol 36% 20ml - Gelatin

2g

- HCI đậm đặc 10ml - Dung dịch NaCl bão hòa 100m]

Phan ứng dương tính khi xuất Phản ứng dương tính khi xuất hiện trầm

hiện trầm hiện màu đỏ hiện màu vàng nhạt, để lâu hóa nâu

-Dung dịch FeCl; 1% trong nước:

Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu xanh với 2 giọt FeCl; 1% trong nước

5.2.2.5 Flavon Điều chế dung dịch thử:

- Nấu mẫu (5g) với nước cất (100ml) trong 30 phút Để nguội, lọc

Phần ving SHIBATA:

- Ống nghiệm kiểm chứng: 2ml dung dịch thử

- Ong nghiệm phản ứng: 2ml dung dịch thử, thêm HCI đậm đặc (5ml)

và bột Mg Để yên đến lúc hết sủi bọt; thêm từ từ alcol ¿so-amil theo thành ống nghiệm Ðun nóng nhẹ

Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu hồng chuyển sang màu đỏ tím

5.2.2.6 Saponin Dun sôi 1g bột nguyên liệu trong 100ml nước cất trong 30 phút Lọc, để

nguội, thêm nước cất vào cho đủ 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiêu cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 10ml nước sắc thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10ml Lắc mỗi ống theo chiểu dọc của ống trong 15 giây Để yên 15 phút rồi đo chiều cao các cột bọt Nếu chiều

6, PHAN THJC NGHEM

52 Phuong phap dirh tinh va dinh Lượng một số cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ cÂy

Trang 66

C19 cột bọt trong tất cá các ống nghiệm dưới lem, chỉ số bọt dưới 100, nghĩa là

không có Sâponin,

csp =10x4

€

CSB: chi s6 bot

d: chiều cao cột bọt, cm

€: lượng mẫu trong ống nghiệm, g

5.2.2.7 Binh tinh lacten bất bão hòa

Thuốc thi LEGAL:

Hòa tan mẫu trong 2-3 giot piridin, thém 1 giot nitroprusiat natri 0,5% mới pha, rồi cho từng giọt NaOH 2N,

Phần ứng dương tính khi xuất hiện mầu hồng

Thuốc thử KEDDE:

- Dung dich A: acid 3,5-dinitrobenzoic 2% trong alcol etil

Dung dich B: KOH 5% trong nude

Phản ứng dương tính khi xuất hiện mầu hồng

Thuốc thử BALIET:

~ Acid picric 1% trong alcol eHl 20%

- NaOH 59%

Phần ứng dương tính khi xuất hiện mầu vàng cam hoặc màu hồng thẫm 5.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP ĐITERPENOID LACTON

TỪ LÁ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN

5.3.1 Gui trình ly trích điterpenoid lacton

Phương pháp Í

Tận trích bột lá khô cây Xuyên Tâm Liên (1k với eter đầu hóa

(60-90°C) (12 HQ trong dụng cụ Soxhiet đến khi dịch trích mất màu xanh (khoảng 60 giờ) Thu hổi dung môi ở 40”C dưới áp suất kém cho cặn eter dẫu

hỏa (28,5g) Phơi khô phẩn bã lá để loại hết dung môi Tận trích bã khô với

cloroform (101 trong dụng cụ Soxhlet, Để nguội dịch trích, lọc cho trầm hiện màu vàng xanh (45g) Qui trình điều chế được trình bày trong sơ dé 6 (trang 25)

Phương pháp 2

¬ trích bột lá khô cây Xuyên Tâm Liên (1,lkí) với eter dầu hỏa

(60-20 C) (12lit) trong dung cu Soxhlet đến khi dịch trích mất màu xanh (khoảng

60 810) Thu hổi dung môi ở 40°C dưới áp suất kém trong máy cô quay cho cặn ter dầu hỏa (30g) Phơi khô phần bã lá để loại hết dung môi Tận trích bã khô

VỚI alcol cul 95% (10lít) trong dụng cụ Soxhlet đến khi dịch trích không màu

(khoảng 55 giờ) Thu hồi dung môi ở 40°C dưới áp suất kém cho cặn alcol etil

(248g) Đun hoàn lưu cách thủy cặn alcol với acetat etil (2líU) Cô cạn dung môi

cho cặn acetat etil (178,9g) Tận trích cặn acetat etil với cloroform (2lít) Thu hồi dung môi ở 40°C dưới áp suất kém cho cặn cloroform (165g) Qui trình điều chế cặn cloroform được trình bày trong sơ đồ 7 (trang 27)

5.3.2 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính

5.3.2.1 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính trên cặn

cloroform Thực hiện sắc kí cột alumin trung tính với điều kiện như sau:

- kích thước cột: 3cm x 35cm

- khối lượng alumin sử dụng: 295g

- khối lượng cặn cloroform để nạp cột: 11g

- hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dân: benzen, benzen-

cloroform, cloroform va alcol metil

- hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc kí: 100ml

5.3.2.2 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính thực hiện trên

phân đoạn 3 thu được từ sắc kí cột alumin trung tính trên

cặn cloroform Thực hiện sắc kí cột alumin trung tính với điểu kiện như sau:

- kích thước cột: lem x 15cm

- khối lượng alumin sử dung: 20g

- khối lượng sản phẩm thô (phân đoạn 3) nap cot: 0,78

- hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dẫn: benzen,

benzen-cloroform, cloroform va alcol metil

- hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc kí: 15ml

9.3.3 Phương pháp sắc kí bản mỏng silicagel

Thực hiện sắc kí bản mồng silicagel với điều kiện như sau:

- loại bảng mỏng sử dung: TLC plastic roll 0,2mm-silicagel 60 Fosq

- hệ dung ly triển khai sắc kí bản mỏng: cloroform-alcol metil 9:1

- thuốc thử làm hiện vết là H;ạSO„ 50% Sau khi chấm mẫu, phun thuốc

thử, sấy bảng ở 150C trong 2 phút

- sản phẩm thô được hòa tan trong alcol metil

5.4 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP DITERPENOID

GLUCOSID TỪ LÁ CÂY XUYÊN TÂM LIÊN

5.4.1 Qui trình ly trích diterpenoid glucosid

Tận trích bột lá khô cây Xuyên Tâm Liên (Ikí) với eter dầu hỏa

(60-90°C) (12 lít) trong dụng cụ Soxhlet đến khi dịch trích mất màu xanh

(khoảng 60 giờ) Thu hồi dung môi ở 40°C dưới áp suất kém cho cao eter dầu

hỏa (28,5g) Phơi khô phần bã lá để loại hết dung môi Tận trích bã khô với cloroform (10lít) trong dụng cụ Soxhlet Để nguội, lọc, cô cạn cloroform ở 40°C cho cặn cloroform (90g) Đun hoàn lưu cách thủy cặn trên với benzen (1lit) Phin không tan trong benzen được hòa tan trong alcol etil 95%, khử

màu dịch alcol bằng than hoạt tính, cô cạn dung môi dưới áp suất kém cho

cặn alcol etil (2g) Qui trình điều chế cặn alcol etil được trình bày trong sơ

đồ 8 (trang 50)

5.4.2 Phương pháp sắc kí cột alumin trung tính trên cặn alcol

etil Thực hiện sắc kí cột alumin trung tính với điều kiện như sau:

- kích thước cột: 1,5cm x 30cm

- khối lượng alumin sử dụng: 50g

- khối lượng cặn alcol etil để nạp cột: 2g

- hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dân: benzen, benzen- cloroform, cloroform, cloroform-alcol metil va alcol metil

- hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc kí: 50ml

5, PHẨN THỰC NGHỆM

Traạ 69

SUSU A LOU Sf ANOS NOC MOR foc

9.4.3 Phương pháp sắc kí bản mỏng silicagel

Thực hiện sắc kí bản móng silicagel với điều kiện như sau:

- loại bằng mồng sit dung: TLC plastic roll 0,2mm-silica gel 60 Fas¿

- hệ dung ly triển kbai sắc kí bắn mong: cloroform-alcol metil 8:2

cử thuốc thử làm hiện vết là H;SO¿ 50% Phun thuốc thử (sau khi chấm

mâu), sấy bảng ở 150C trong 2 phút

- sản phẩm thô được hòa tan trong alcol metil

5.5, PHƯƠNG PHÁP ACETH HÓA CÁC SẲN PHẨM CÔ LẬP

5.5.1 Acetil héa san pham A,

Đun nhẹ hỗn hợp gồm có sản phẩm Ai (100mg), anhidrid acetie

(0,5m]) và một lượng nhỏ clorur kẽm trên bếp cách thủy trong 5 phút, Làm nguội dung dịch vàng nhạt tạo thành Thêm nước Lắc mạnh thu được cặn dầu

mầu vàng Kết tinh cặn dầu trong aleol medHil thu được sản phẩm là chất rắn

mầu trắng (90mg) và được đặt tên là AÁi

5.5.2 Acetil hóa sản phẩm N

Hòa tan sản phẩm N (45mg) trong piridin (0,5ml) Thêm anhidrid acetic (1ml) vào hỗn hợp trên Để yên hỗn hợp trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng

Thêm nước cất (15ml) và làm lạnh hỗn hợp cho trầm hiện trắng Lọc và kết

tỉnh trầm hiện trong alcol etil 95% cho tinh thể trắng (30mg) Sản phẩm này

được đặt tên là AN

6, PHAN THJC NGHEM

Trang 70