Nghiên cứu khảo sát hóa học cây lá xuyên tâm liên

Nghiên cứu khảo sát hóa học cây lá xuyên tâm liên

Luan án Thac sĩ Khoa học Hoa hoa

3.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ DITERPENOID LACTON [23]

Các hợp chất diterpenoid lacton đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực y học và nông nghiệp, do chúng có tính kháng ung thư, kháng khuẩn, diệt côn trùng

và điệt nấm Trong cơ cấu của diterpenoid lacton, hệ thong nối đôi carbon-carbon -C= ¿- không no ở œ, § đối với nhóm carbonil— -C= O_ của vòng lacton kết hợp với các nhóm —SH, -OH, -NH- của amino acid và protein trong vỉ khuẩn, biến chúng thành chất độc và làm rối loạn quá trình sống của vi khuẩn

Về mặt cấu trúc, diterpenoid lacton có bộ khung cơ bắn 20 nguyên tử carbon Về lý thuyết, chúng là tổ hợp gồm 4 đơn vị isopren

Phản ứng định tính diterpenoid lacton dựa vào sự có mặt của vòng lacton bất bão hòa Các hợp chất có vòng lacton bất bão hòa cho phản ứng có màu với các thuốc thử sau đây:

- LEGAL (nitroprussiat natri): màu hồng

- BALJET (acid picric): màu vàng cam

- KEDDE (acid 3,5-dinitrobenzoic trong alcol metil): màu hồng

3.2 XỬ LÝ MẪU CÂY NGHIÊN CỨU

Cây Xuyên Tâm Liên, Andrographis paniculata, Acanthaceae, sử dụng trong nghiên cứu đã được nhận danh bởi PGS Lê Công Kiệt, Bộ môn Thực Vật, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh

Để thực hiện việc nghiên cứu trên cây Xuyên Tâm Liên, chúng tôi đã thu hái cây mọc hoang ở xã Chánh Nghĩa, thị xã Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương vào tháng 9, tháng 10 trong năm

Sau khi thu hái mẫu cây, tách riêng phần lá không bị sâu và đập nát Rửa sạch lá và phơi khô lá ngoài trời, sau đó sấy lá ở 60°C Lá cây khô được xay thành bột thô Đây là mẫu nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu

3, PHAN NGHÊN CỨU

3 Pa cuong vé diterpencid lacton

Trang Th

luận án Thao si Khoa hoc Hea hoc

3.3 KHẢO SÁT SỰ HIỆN ĐIỆN CỦA CÁC CẤU TỬ HỮU CƠ CÓ TRONG CÂY XUYÊN TÂM LIÊN

3.3.1 Điều chế các loại cao

Trong cây cỏ, thường có sự hiện diện của một số cấu tứ hữu cơ như sterol, alealoid, glicosid, tanin, flavon, saponin Mỗi cấu tử này được định tính bởi những thuốc thử đặc trưng cho phần ứng có mầu hoặc cho phần ứng trầm hiện,

Sự khảo sát này được thực hiện trên bột khô, cao eier dầu hóa (60-90°C), cao benzen, cao cloroform và cao alcol metil của lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm

- Phơi dưới ánh nắng mặt trời

-Sấy khô ở 60° đến khi trọng

lượng không thay đối

-Xay nhuyễn,

Bột khô

-Jan trích với các dung môi khác

nhau trong dụng cụ Soxhiet

-Cô cạn dung môi ở 40°C

3, PHAN NGHEN CUU

33, KhBo sát sự Hiện đền của các cấu tô hữu cơ cd trong cây Xuyên TÂm Liên Trang 2

uuận án Thạc øĩ Khoa học Hĩa hoc

aleol metil của lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên chứa sterol

Kết luận: Bột khơ, cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform và cao

3, PHAN NGHEN CÚU

33, Khao sat su hiện đện của oÁc cấu tử hữu cơ cơ trong cây Xuyên Tâm Liên Trà 12

Auda an thac af Khoa hoc Hoa hoa

3.3.2.2 Alcaloid

Alcalold được xác định bởi phẩn ứng trầm hiện với các thuốc thử

BOUCHARDAT, MAYER, HAGER, BERTRAND và DRAGENDOREF,

Kết quả định tính alcaloid trong lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên được trình bày trong bang 2

Bảng 2: Kết quả định tính alcaloid trên bột khô, cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform và cao alcol metil của lá, thân và rễ

cây Xuyên Tam Liên

3, PHAN NGHEN COU

55 Khảo sát sự Hiện đện của các cấu tử hữu cơ có trong cay Xuyên Tâm Liền Trang 4

Luan an Thac sf Khow hoc Hoa họa

3.3.2.3 GHecosid

Để xác định sự hiện điện của glicosid, chúng tôi thực hiện phương pháp SOOS theo sơ để 2 Dịch alcol eHl thu được sau cùng dùng để trắc nghiệm với các thuốc thử TOLLEN vA MOLISH

Sơ để 2: Định tính gicosid theo phương pháp SQOS

- Chế hóa với dung dịch acetat chì 20%

- Lọc

- Chế hóa với dung dịch Na,SO, bao hoa

5, PHAN NGHEN CUU

5/5 Khảo sắt sự hiện đên của các cấu tử trữu cơ có trạng cây Xuyên Tâm Liên Trang B

Luan an thac sf Khoa hoc Hoa hoc

Bảng 3: Kết quả định tính glicosid trên bột khô, cao eter dầu hóa,

cao benzen, cao cloroform và cao aleol metil của lá, thân và rễ

¿tuân án Thao sĩ K hơn họa Hóa hoa

Bảng 4: Kết quả định tính tanin trên bột khô, cao eter đầu hóa, cao benzen, cao cloroform và cao alcol metil của lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên

Flavon được xác định bởi phản ứng có màu với thuốc thử SHIBATA

Kết quả định tính Havon trong lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên được trình bày trong bang 5

3, PHAN NGHEN QUU

3.3 Khao sát s/ hiện đện của các cấu tử hữu cơ cô trong cây Xuyên Tâm Liên Trang 17

Luan én thc sf Khoa hoc fide hoc

Định tính saponin bằng cách xác định chỉ số tạo bọt của mẫu thử

Các kết quả thực nghiệm cho thấy lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên không có chứa saponin (chỉ số bọt dưới 100)

3.3.3 Khảo sát định lượng

Trong phần này, chúng tôi chỉ tiến hành xác định hàm lượng một số cấu

tử hữu cơ tiêu biểu như alcaloid, glicosid và tanin trên lá, thân và rỄ cây Xuyên Tâm Liên

3, PHAN NGHÊN CÚU

33, KhBo eat ey hién đện của các cấu tử hữu cơ cô trong cây Xuyên Tâm Liên Trang ©

Luéa 6n Thac sf Khoa hoc Hoa hoc

3.3.3.1 Alcaloid

Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng alcaloid theo phương pháp SCHREIBER [24] (so dé 3, trang 20)

Kết quả định lượng alcaloid được trình bày trong bảng 6

Bảng 6: Hàm lượng alcaloid trong cây Xuyên Tâm Liên

Kết quả định lượng tanin được trình bày trong bắng 8

Bảng 8: Hàm lượng tanin trong cây Xuyên Tâm Liên

3, PHAN NGHEN CUU

BB Khdo oat sy hiện đện của cÁc cấu \ tử hữu cơ có trong cAy Xuyén Tâm Liên Trang 9

quận ân Thac si Khoa hoo Hoa hoo

Sơ để 3: Xác định hàm lượng alcaloid trên lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên theo phương pháp SCHREIBER [24]

- Tdm v6i NH,OH 50% trong 48 gid

- Ngam trong eter etil-cloroform (3:1), trong 24 giờ Lọc,

- Tận trích với alcol nz-butil ị

- Lam khan dich alcol n-butil bing Na;SOa, | - Lam khan bling Na,SQ,

i Cô cạn dung môi ở 40°C

Dich cloroform

| - Rửa với nước cất,

y - Cô cạn dung môi

LUGN AN (NaC & Aloe hoc Hoa hoc

Sa do 4: Xác định hàm lượng glicosid trên lá, thân và rễ

cây Xuyên Tâm Liên

Tận trích với alcol n-buHlL

- C6 can dung mdi d 40°C

- Làm khan dich alcol 2-butil véi Na2SO

y- C6 can dung méi 6 40°C

¥ Monoglicosid

quan an thac 4F Khoa học Hóa hoc

%@ để 5: Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp TAKASHI YOSHIDA [25]

- Trích với hỗn hợp aceton-nước (7:3 theo thể tích)

Tận trích với eter ebl,

- Lam khan vdi Na2SOx

- Cô cạn dung môi Ở 40°C

5, PHAN NGHEN CUU

AS, Kido s&t sự hiện dén của các cấu tử hữu cơ cô trong cây Xuyên Tâm Liên ig Cay Auy rang 22

Xuân an Thao 87 Khoa hoc Hoa họa

3.3.4 Tóm tắt các kết quá định tính và định lượng một số cấu tử

hữu cơ trong lá, thân và rễ cây Xuyên Tâm Liên

Kết quả xác định định tính các cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ cây

Xuyên Tâm Liên được tóm tắt trong bắng 9,

Bảng 9: Kết quả định tính các cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ

cây Xuyên Tâm Liên

3, PHAN NGHEN CUU

5.5 KhÃo oát sư hiện đện của các cấu tử hữu cơ cô trong cây Xuyên Tâm Liên Trau 25

LUG OA 1NAC & Koes hoo toa hoc

Kết quả xác định định lượng một số cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ cây

Xuyên Tâm Liên được tom tit trong bang 10

Bằng 10: Kết quả định lượng một số cấu tử hữu cơ trong lá, thân và rễ

cây Xuyên Tâm Liên

Tâm Liên, dùng dụng môi alcol etil 95%, kế tiếp cloroform Làm bay hơi

cloroform cho diterpenoid lacton thé

ALAN BALMAIN [20] ding dung môi acetat etil để ly trích điterpenoid lacton thô từ lá khô cây Xuyên Tâm Liên

Phương pháp để nghị

Chúng tôi để nghị 2 phương pháp ly trích điterpenoid lacton như sau:

4) Phương pháp 1: (sơ đỗ 6, trang 25)

Khử chất béo, sterol, triterpen trong lá khô cây Xuyên Tâm Liên bằng cách tận trích lá với eter dầu hỏa (60-90°C) Tận trích bã lá với cloroform Để nguội dung môi cho trầm hiện vàng lục với hiệu suất là 4,5% tính trên trọng

lượng lá khô Trầm hiện trên cho trắc nghiệm dương tính với các thuốc thử

LEGAL, BALIET và KEDDE, thuốc thứ đặc trưng của y-lacton bất bão hòa ở a, 8

Sắc kí bản mồng silicagel của trầm hiện vàng lục, với hệ dung ly là

cloroform-alcol metil 9:1, thuốc thử HạSO¿ 50% cho 1 vết với Ry = 0,38 chinh 2,

trang 26)

5, PHẨN NGHIÊN CLL

Trau 24

Luan an Thao sĩ Khoa họa Hóa hoơ

Se đề 6: Qui trình ly trích diterpenoid lacton thé ti lá khô cây

Xuyên Tâm Liên dùng các dung môi eter đâu hỏa (60-90°C) và cloroform

Bột lá khô cây

iki Xuyên Tâm Liên 0k)

-Tân trích với cloroform (10110 trong ì ở 40C,

dung cy Soxhlet, trong 55 gid,

b) Phương pháp 2: (sơ đỗ 7, trang 27) Đầu tiên, khử các chất béo, sterol, triterpen trong lá khô cây Xuyên Tâm Liên bằng cách tận trích lá với eter đầu hỏa (60-90°C) Phần bã lá tiếp tục được tận trích với alcol eiil 95% Sau khi thu bồi dung môi ở áp suất kém, tận trích cặn alcol etl thu được với acetat eHl, cô cạn dung môi cho cặn acetat cHl Cặn này được tận trích với cloroform nóng, thu hổi cloroform ở ấp suất kém cho cặn cloroform với biệu suất là 15% tính trên trọng lượng lá khô Cặn này chứa y-lacton bất bão hòa ở œ, B vì cho kết quả trắc nghiệm dương tính với các thuốc thử LEGAL, BALJET và KEDDE

Sắc kí bản móng silicagel của cặn cloroform, với hệ dung ly là cloroform-alcol metil 9:1, thuốc thy H,SO, 50% cho 4 vết: R; = 0,11 (vết nhỏ, tròn), R; = 0,35 (vết đài, R; = 0,52 (vết rõ, đầu và R; = 0,61 (vết rõ, tròn, mầu tím) (hình 3, trang 26)

5, PHẨN NGHÊN QÚU

Trang 25

Luan an {hac sf Khoa hoc Hoa hoa

Hình 2: Kết quả sắc kí bản mỏng silicagel trên trầm hiện vàng lục (phương pháp 1)

Cloroform-alcol metil 9:1 Thuốc thử HạSOx 50%

R= 0,38

Hình 3: Kết quả sắc kí bản mỏng silicagel trên cặn cloroform (phương pháp 2)

quân án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

Sơ đồ 7: Qui trình ly trích điterpenoid lacton thô từ lá khô cây Xuyên Tâm Liên, dùng lần lượt các đụng môi eter đâu hóa (60-90°C), alcol etil 95%,

acetat etil va cloroform

-Tận trích với alcol eHl 95% (10H

trong dụng cu Soxhlet, trong 55 gid

-Lọc, thu hồi dung môi ở 40°G

ở 40C

Cặn cloroform (165g)

3, PHAN NGHIEN CUU

Luén an thec af Khoa hoc Hoe hoc

3.4.2 Tach chiét va cô lập 4 diterpenoid lacton Ay, Ao, As va Ag

3.4.2.1 Cé lip diterpencid lacton A;

Trầm hiện vàng lục (45g) thu được từ sơ đồ 6 (trang 25), được kết tỉnh lại nhiều lần trong alcol metil và khứ mầu địch alcol metil với than hoạt tính thu được tỉnh thể không màu, hình phiến (20g), đặt tên là Ấy, với hiệu suất là 3% tính _ trên trọng lượng lá khô Sắc kí bẩn mỏng silicagel trên Ái, với hệ dung ly là cloroform-alcol metil 9:1, thuốc thử làm biện vết là H;SO¿ 50% cho 1 vết mầu nâu với R;= 0,38, chứng tổ A; là một chất tính khiết (hình 4, trang 29)

3.4.2.2 Tách chiết và cô lập diterpenoid lacton Á¿, A; va Ay

Sự tách chiết và cô lập điterpenoid lacton từ cặn cloroform của lá khô cây Xuyên Tâm Liên (sơ đổ 7, trang 27) được thực hiện bởi phương pháp sắc kí trên cột alumin trung tính, dùng dung môi giải ly là benzen, cloroform và hỗn hợp của chúng Kết quả của tiến trình sắc kí trên cột alumin trung tính được tóm tắt trong

bằng 11 (rang 32)

3.4.2.2.1, C6 lap diterpenoid lacton Az Kết quả sắc kí trên cột ahưnin trung tính thực hiện trên cận cloroform (bang 11, trang 32) thu được 8 phân đoạn Phân đoạn 2, giải ly với benzen- cloroform 19:1 (4700mÙ, sau khi cô cạn dung môi, cho chất rắn mầu vàng nhạt (0,08g) Kết tính sản phẩm trong alcol metil thu duge tinh thé tring (0,045g), dat tên là A¿, hiệu suất là 0,06% tính trên trọng lượng lá khô Á¿ cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuốc thử LEGAL, BALJET và KEDDE Sắc kí bản mồng silicagel cho một vết tròn mầu nâu có R;ị = 0,61, với hệ dung ly là cloroform-alcol metil 9:1, thuốc thử làm hiện vết là HạSOx 50% (hình 5, trang 30)

3.4.2.2.2 Cé lép diterpenoid lacton A;

Phân đoạn 3 cia bang 11 (trang 32), gidi ly vdi benzen-cloroform 9:1 (13200m)), thu hổi dụng môi cho chất rắn mầu vàng nhạt (9,78) Sắc kí bản mồng cho một vết đài mầu nâu cé Ry = 0,52 với dung ly là cloroform-alcol mebl 9:1, thuốc thử làm hiện vết là H;ạSO, 50% Tuy nhiên, sắc kí bẩn mỏng cho vết còn chưa sạch lắm nên chúng tôi thực hiện sắc kí trên cột alumin trung tính lần thứ 2 với hệ dung môi giải ly là benzen, cloroform và hỗn hợp của chúng Kết quả sắc

kí trên cột alamin trung tinh lân thứ 2 được tóm tất trong bảng 12 (trang 33)

Theo bang 12 (rang 33), phân đoạn 3”, giải ly với benzen-cloroform lá:1 (1290m)), sau khi cô cạn dung môi cho bột trắng (0,05g) Kết tinh san phẩm trong alcol metl thu được tĩnh thể trắng (0,03g), đặt tên là A;, hiệu suất là 0,04% tính

5 PHẪN NGHIÊN CỬU

Trang 2&

Luan an thac si Khoa học Hóa hoc

trên trọng lượng lá khô A; cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuốc thử LEGAL,

BALJET và KEDDE Sắc kí bản mồng cho một vết tròn màu nâu có R;= 0,50 với hệ dung ly là cloroform-alcol metil 9:1, thuốc thử làm hiện vết là H;ạSO; 50%

(hình 6, trang 30)

3.4.2.2.3 Cô lập diterpenoid lacton Âu Phân đoạn 4 (bảng l1, trang 32), giải ly với benzen-cloroform 3:1

(21000ml), sau khi cô cạn dung môi cho chất rắn vàng nhạt (2,13g) Kết tinh san

phẩm trong alcol metil dưới dạng tỉnh thể hình phiến, lóng lánh, không màu

(1,50g), đặt tên là A¿, hiệu suất là 2,05% tính trên trọng lượng lá khô A¿ cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuốc thử LEGAL, BALIET và KEDDE Kết quả sắc kí bản

mỏng silicagel trên A¿ cho một vết tròn màu nâu có R;= 0,38 với hệ dung ly là

cloroform-alcol metil 9:1, thuốc thử làm hiện vết là H;ạSO¿ 50% (hình 7, trang 31)

Hình 4: Kết quả sắc ki ban méng silicagel trên san phẩm A¡

uuuan an 1hac 6ï Khoa hoc tọa hog

Hình 5: Kết quả sắc kí ban mong silicagel trén san phẩm Az

Cloroform-alcol metil 9:1

Thuốc thử H;SOx 50%

R= 0,61

Hình 6: Kết quả sắc kí bản mồng silicagel trên san phém A;

Luan án {hac si Khoa hoc Hoa hoơ

£060 fn Nac &f Knoe hoc Hoa hoe

3.4.3 Khảo sát cơ cấu của 4 hợp chất cô lập Ai, As, As va Ag

3.4.3.1, Khảo sát cơ cấu của Ai

3.4.3.1.1 Đặc điểm của A,

a) Điểm nóng chdy: San phẩm Ai kết tính trong alcol metil đưới đạng tỉnh thể hình phiến, không màu, nóng chảy 6 226°C

T.=226°C (MeOH) b) Sdic ki ban méng silicagel (hình 4, trang 29): Sản phẩm A¡ cho một vết duy nhất, có R;= 0,38, với hệ dung ly là cloroform-alcol meul 9:1, thuốc thử làm

e) Phổ UV (phụ lục số 3, trang 75): Có 2 vạch hấp thu cực đại Od

Amax (EtOH)= 20inm, e=16300 va 225nm, e=13300 (-C=C-C=0 )