Thực nghiệm nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây cóc hành , họ xoan

Thực nghiệm nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây cóc hành , họ xoan

3 THUC NGHIEM

3.1 Các điều kiện tiến hành thí nghiệm

Sc ki ban mong: Loai silicagel pha thuong (Merck, Kielselgel 60F254, 250um) Sắc kí cột: Loại silicagel pha thường thực hiện trên silicagel (Scharlau, 40-60 nm)

Thuốc thử cho sắc kí bản mong: H.SO, dam dac, lot, FeCl, trong metanol

Dung môi thực nghiệm là dụng môi đã được chưng cất lại

Eter dầu hỏa (60-90°C)

Cloroform (61-62°C)

Acetat etil (76-78°C)

Metanol (64-65°C)

May phd NMR hiéu Brucker Avance 500 (S00MHz cho 'H va 125MHz cho '°C)

Dung môi chạy phổ (với TMS là chất nội chuẩn)

CDCI:

McOD

Aceton-d6é

Điểm nóng chảy đo trên máy BÚCHI B-545

Quá trình cô lập các câu tử hóa học được thực hiện bằng phương pháp SKC kết hợp với sắc kí bản mỏng

3.2 Thu hái, xử lí và điều chế các loại cao

Lá cây cây cóc hành (4zadirachta excelsa) thu hái ở huyện Ninh Phước tỉnh Ninh

Thuận vào tháng 5 năm 2006 Lá được phơi và sấy ở 60°C đến khối lượng không đổi, nghiền nhỏ thu được 2 kg mẫu khô Lấy mẫu ngâm trong metanol, lọc lây địch,

cô quay dưới áp suất thấp thu được cao metanol (177.438)

_—

3.3 Cô lập chất

3.3.1 Khao sat cao cloroform

Lay cao metanol chiết với các dung môi eter dau hỏa sau đó chiết tiếp với dụng môi

cloroform thu được cao cloroform Cao cloroform (28.15 ø) được SKC trén silicagel pha thường (300 g) với hệ dung môi giải H CHC1;-CH:OH với độ phân cực tầng

đân Dựa trên sắc kí bán mỏng thụ được 7 phân đoạn và lần lượt kí hiệu là AECL,

AEC2, AEC3, AEC4, AECS, AEC6, AEC7

Thực hiện SKC AEC3 (200 mg) trên silicagel pha thường hệ dung hi eter dầu hóa- acetat ctil với độ phân cực tăng dẫn thu được 7 phân đoạn

Bang 3.1 Kết quả sắc kí cột phân đoạn AEC3 (200 mg) của lá cây cóc hành

(silicagel, cloroform:mmetanol có độ phân cực tang dân)

Phân đoạn Tên mã hoá Khối lượng (mg)

|

3.3.1,1 Phân đoạn AEC32

Phân đoạn AEC22 (30 mg) SKC pha thường hệ dụng lí eter dầu héa-acetat etil voi

độ phân cực tang dân Dựa trên sắc kí bản móng gom thành 4 phân đoạn, Khảo sát phân đoạn AEC32] bang SKC pha thường hệ dung lí cfer dâu hỏa- acetat chi (Ó- 25%) thu được Dó (10 mạ)

À

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ cô lập D6 từ phân đoạn 2, cao cloroform của lá cây cóc hành (Azadirachta excelsa)

Cao cloroform

(28.15 g)

Sac ki cét, silicagel

Cloroform-metanol (0-100%)

7 phan doan (AEC1-7)

AEC3 (200 mg)

Sắc kí cột, silicagel Cloroform-metanol (0-100%)

6 phân đoạn (AEC31-7)

y

AEC32 (30 mg)

Sắc kí cột, silicagel

Eter dau héa-acetat etil (0-100%)

4 phan doan (AEC321-4)

AEC321

Sắc kí cột, silicagel

Eter dầu hỏa-acetat etil (0-25%)

r

D6 (10 mg)

3.3.1.2 Phan doan AEC33

Phân đoạn AEC33 (60 mg) thực hiện sắc kí cột pha thường với hệ dung môi giải li

eter dầu hỏa-acetat etil với độ phân cực tăng dân, dựa trên kết quả sắc kí bản mỏng

gom thành 7 phân đoạn, trong đó phân đoạn AEC336 (37 mg) có kết tủa Lọc lấy kết tủa và tiếp tục thực hiện SKC pha thường với hệ dung môi giải li eter dầu hỏa-

acetat etil thu dugc 4 phan doan Tiép tục kháo sát phân đoạn AEC3362 (9 mg) bằng SKC pha thường hệ dung môi giải H eter dầu hóa-acetat edil ( 0-30%) thu được

DỊ O mẹ) Khảo sát phân đoạn AEC23361 (15 mg) bằng SKC pha thường hệ dụng

môi giải H eter dầu hỏa-aceion (0-20%) thu được D2 (7 mg)

Sơ đề 3.2 Sơ đồ cô lập DI và D2 từ phân đoạn 3, cao cloroform của lá cây cóc

hành (Azadirachita excelsa)

AEC3

Sắc kí cột, silicagel Cloroform-metanal (0-100%)

6 phan doan (AEC31-7)

AEC33

Sắc kí cột, silicagel Eler dầu hỏa-acetat eHl (0-1004)

7 phân đoạn (AEC331-7)

v

AEC336

Sắc kí cột, silicagel

Eter dau héa-acetat etil (0-40%)

4 phan doan (AEC3361-4)

Š

¥

Eter dầu hỏa-acetat cũl (0-30) Eter dau héa-aceton (0-20%)

:

3.3.2 Khao sat cao acetat etil

Lay cao metanol chiết lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform sau đô

chiết tiếp với đụng môi acetat cũl thu được cao acetat etil Cao acetat etil (1.94g) được thực hiện SKC trên silicagel pha thường với hệ dung môi giai li eter dau héa- acetat etil với độ phân cực tăng đần kết hợp với sắc kí bán mỏng gom thành 4 phân

đoạn kí hiệu lần lượt là AEAI, AEA2, AEA3, AEA4

3.3.2.1 Khảo sát phân đoạn AEA2

Thực hiện SKC AEA2 (159 mg) trên silicagel pha thường với hệ dung môi giải li eter dầu hỏa-acetat ctil với độ phân cực tăng dân, kết hợp với kết quá thu được từ sắc kí bản móng gom lại thành 7 phân đoạn, trong đó AEA23 G4 mg) xuất hiện tỉnh

thể màu vàng dạng vô định hình, đem tiếp tục thực hiện SÉC pha thường với hệ

dụng môi giải lí cloroform- metanol (9:1) thu được Dễ (21mg)

Sơ đề 3.3 Sơ đồ cô lập D8 từ phân doan 2, cao acetat etil cla lá cây cóc hành (Azadirachta excelsa)

Cao acetat etil (1.94g)

Sắc kí cột, silicagel

Eter dau héa-acetat etil (0-1060%)

=> 6 phân đoạn (AEAI-6)

x

AEA2 (159 mg)

Sac kí cột, silicagel

Eter dau héa-acetat etil (0-50%)

=> 7 phan doan (AEA21-7)

AEA23 (34 mg)

Sắc kí cột, silicagel

Clorofoarm:metanol= 9:1

3.3.2.2.Khao sat phan doan AEA3

Thực hiện SKC AEA3 (230 mg) trén silicagel pha thuéng với hệ dụng môi giải H eter đầu hỏa-acetat ctil với độ phân cực tăng dần, kết hợp với kết quả thu được từ sắc kí bản móng gom lại thành 6 phân đoạn, trong đó AEA34 (42 mg) xuất hiện tính

thể màu vàng đậm dạng vô định hình, đem tiếp tục thực hiện SKC pha thường với

hệ dung môi giải lí cloroform- metanol (85:15) thu được D9 (28 mg)

Sơ đề 3.4 Sơ đã cô lập D9 từ phân đoạn 3, cao acetat eil của lá cây cóc hành (Azadirachta excelsa}

Cao acetat etil (1.94g)

Sắc kí cột, silicagel Eter dau héa-acetat etil (0-100%)

=> 6 phân đoạn (AEAI-@)

v

AEA3

(230 mg)

Sắc kí cột, silicagel

Eter dau héa-acetat etil (0-50%)

=> 6 phan doan (AEA31-6)

ká

ABA34 (42 mg)

Sắc kí cột, siicagel

Cloroform:metanol= 85:15

D9 (28 mg)

3.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu

- Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm: các chủng vi khuẩn trên được giữ trong môi trường BHI + 5% glicerol ở nhiệt độ -26°C trong các ống eppendorf và được cay truyền 2

tháng một lần

- Môi trường kháng sinh đồ: sử dụng môi trường Nutrient agar

Cao thịt: 3g

Pepton: 5g

NaCl: 5g

Agar: 20g

Nước: llit

- Mẫu thử nghiệm là các mẫu cao và các chất đã được cô lập Các mẫu này được giữ

ở nhiệt độ 4°C trong các lọ có nắp vặn chặt

- Dụng cụ: các đĩa giấy có đường kính 6mm được tiệt trùng qua nồi hấp Autoclave

ở 121°C, latm, trong 30 phút và sấy khô hoàn toàn, các hộp Petri thủy tỉnh có đường kính 1 lÔmm vô trùng, que cấy tam giác (để trải vi khuẩn) vô trùng

3.4.2 Phương pháp tiễn hành

3.4.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn thứ nghiệm

Từ các ống eppendorf giữ chủng, vi khuẩn được cấy chuyền ra trên mặt thạch dinh dưỡng

Ủ các hộp thạch có vi khuẩn ở nhiệt độ 37°C qua đêm Sau khi các khuẩn lạc (vi

khuẩn sinh sản mọc thành khóm) xuất hiện, chọn 3-5 khuẩn lạc riêng lẻ, giống nhau

để làm một huyền địch vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lí sao cho đạt độ đục 0.5MecF (tương đương với 10” CFU/ml)

3.4.2.2 Chuẩn bị các hộp thạch thử nghiệm

Đun cách thủy hỗn hợp Nutrient agar đến tan hoàn toàn Khử trùng bằng nồi hấp (Autoclave) ở 121°C trong 30 phút Sau khi để nguội đến 50°C bắt đầu phân phối ra

các đĩa Petri vô trùng, Trong một đĩa Petri có 22ml thạch tương đương với độ dày

4mm Cac hộp thạch này được ủ qua đêm để kiêm tra sự vô trùng Loại bó các hộp thạch bị nhiễm

Ding que cây tam giác vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên

rồi trải đều chúng vi khuẩn thử nghiệm trên mặt thạch của môi trường Nutrient agar

3.4.2.3 Lam khang sinh dé

Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch

Dùng kẹp vô khuẩn kẹp đĩa giấy đường kính 6mm đã tắm mẫu thử với nồng độ 1mg/ml đặt lên mặt thạch thử nghiệm làm tương tự với rnẫu trắng là đĩa giấy tâm

nước cất lật ngược hộp thạch và ủ trong 372C Sau 20 giờ đọc kết quả đường kính

vòng võ khuẩn là vòng không có vi khuẩn mọc xung quanh đĩa giấy tâm mẫu chất thử nghiệm