Thực nghiệm về thành phần hóa học của rễ cây nhàu, họ pha chè

Thực nghiệm về thành phần hóa học của rễ cây nhàu, họ pha chè

53.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng

Š.1.1.Hóa chất

s Eter đầu hỏa chưng cất lấy phân đoạn 60 ~ 90°C, làm khan với sợi

® Benzen làm khan sơ bộ bằng CaCl;, lọc loại CaCl;, chưng cất lấy phan doan 80°C, làm khan với sợi Na

e Cloroform được lắc với nước 3 lần để loại alcol etl, sau đó làm khan

sơ bộ bằng CaCl;, lọc loại CaCl;¿, chưng cất lấy phân đoạn 61°C, làm khan

vii CaCl

e Aceton chung cat ldy phan doan 56°C

e Alcol etil chưng cất lấy phân đoạn 78°C

ø& Alcol metil chưng cất lấy phân đoạn 64°C

« Ngoài một số thuốc thứ phục vụ cho phần khảo sát định tính, chúng

tôi còn sử dụng thuốc thử hiện vết là KOH 10% trong metanol va acid phosphomolibdic bão hào trong meftanol,

5.1.2 Thiết bị

%, Soxhlet loai 21it

% Máy cô quay hiệu Heidolph

$ Cột sắt ký: 2 x60 cm

2,5 x 50 cm

3x70 cm

S Silicagel 60 silanized (0,063 ~ 0,200 mm), Merck

$ Silicagel 60 Fas¿ 25 TLC aluminium sheets 20 x 20 cm, Merck

% Silicagel 60 Fy54, 2 mm, PLC plates (glass) 20 x 20 cm, Merck

% Diém nóng chảy xác định trên khối Maquenne

$ Phổ MS (ED được thực hiện trên may Acq Method N-DIP, 5989B

MS, Viện hóa học, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia, Hà Nội

t Phổ LC-MS được thực hiện trên máy đo khối phổ, Trung tâm dich

vụ phân tích và thí nghiệm, TP Hồ Chí Minh

8Ú Phổ UV được thực hiện trên máy KONTRON INSTRUMENTS UVIKON 922, Trung tâm dịch vụ và phân tích và thí nghiệm, TP Hồ Chí Minh

% Phố IR được thực hiện trên máy BRUKER-IPS48*CARLO ERBA- GC6130, Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm, TP Hề Chí Minh

t> Phố 'H-NMR được thực biện trên máy BRUKER-AC2000, tần số cộng

hudng 200 MHz, Trung tam dịch vụ phân tích và thí nghiệm, TP Hồ Chí

Minh và máy AV-500, tân số cộng hưởng 500 MH¿, Viện hóa học, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia, Hà Nội

"2

% Phổ C-NMR và DEPT được thực hiện trên máy BRUKER- AC2000, tần số cộng hưởng 50 MH¿, Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm, TP Hồ Chí Minh và máy AV-500, tần số cộng hưởng 500MH¿, Viện hóa học, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia, Hà Nội

5,2 Xác định độ ẩm, độ tro và các nguyên tố vô cơ

trong tro của rễ Nhàu

5.2.1 Xác định độ ẩm

Cân một lượng nguyên liệu tươi (xay nhỏ) Say khé 3 110°C cho dén khi trọng lượng không đổi Cân nguyên liệu khô

Độ ẩm được tính như sau:

a là trọng lượng nguyên liệu trước khi sấy

b là trọng lượng nguyên liệu sau khi sấy

5s 22, Xác định độ tro

Cân một lượng mẫu khô, sau đó nung mẫu trong lồ nung 6 200°C trong | gid tiếp tục tăng nhiệt độ lên đến 600°C cho đến khi toàn bộ mẫu biến thành tro có mâu trắng xám Cân trọng lượng tro

Độ tro được tính như Sau:

Độ tro = 4} 100

B

A la trong lugng tro

B là trọng lượng mẫu khô

3.2.3 Xác định các nguyên tố vô cơ trong rễ Nhàu

Các nguyên tố vô cơ trong rễ Nhàu được xác định bằng phương pháp phân tích quang phổ phát xạ nguyên tử trên mẫu tro của rễ Nhàu

5.3 Diéu ché cao eter dau héa và cao alcol etil

của rễ Nhàu

Bột rễ Nhàu khô được tận trích với eter dầu hóa (60 ~ 90°C ), sau đó tiếp tục được tận trích với alcoi eHl trong đụng cu trich Soxhlet C6 can các

dịch trích này ở 40°C dưới áp suất kém, thu được cao eter đấu hỏa và cao

alcol etl

5,4 Khảo sát sự hiện điện của các cấu tử hữu cơ trong

các loại cao của ré Nhau

5.4.1 Sterol và triterpen

Sterol và triterpen có phản ứng dương lính với các thuốc thử:

+ Liebermann-Burchard: | ml anhidric acetic + 1 m} CHC); + I giot

H;SO¿,

® Salkowski: HạSO¿ đậm đặc

Chất thứ được hòa tan trong CH:CI, lấy 1 ml cho vào ống nghiệm để

lầm mẫu thử,

Cho vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm chứa mẫu thử:

_ Với thuốc thứ Liebermann-Burcbard nếu xuất hiện các màu xanh nhạt, lục, hồng, cam hoặc đỏ, mầu này bền vững trong một thời gian là phần ứng dương tính

_ Với thuốc thử Salkowski nếu xuất hiện các mầu xanh, xanh tứn, đỗ xẩm hoặc đỏ, màu này bến vững trong một thời gian là phản ứng dương tính

5.4.2 Alcaloid

Alcaloid tạo kết tủa với các thuốc thử sau:

s Thuốc thử Bouchardat:

_b oo: 258

_KI: Sg

_ HO cat 100 ml

Thuốc thứ Bouchardat phản ứng với alcaloid cho trầm hiện màu nâu

s Thuốc thử Mayer:

HeCh : 1,35 8

_ KĨ : Sg

90

_ HO cất 100 mI

Thuốc thử Mayer phản ứng với alcaloid cho trầm hiện màu vàng nhạt

* Thuốc thử Hager: dung dịch acid picric bão hòa trong nước

Thuốc thử Hager phản ứng với alcaloid cho trầm hiện màu vàng

Chất thử được hòa tan trong HCI 1%, đun nhẹ ở 80°C trong 1 giờ, lọc lấy dung dich, cho 1 ml dung dich chất thử vào ống nghiệm để làm mẫu thử

Cho vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm chứa mẫu thử Nếu xuất hiện kết tủa là phản ứng dương tính

5.4.3 Flavonoid

Flavonoid có phản ứng dương tính với thuốc thử:

¢ Wilstatter: HCl dam dac + bét Mg

Chất thử được nấu sôi trong nước cất khoảng 10 phút, để nguội, loc, lấy dịch lọc cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml để làm mẫu thử

~ Ống 1: lam đối chứng

_ Ong 2: thêm 0,5 ml HCI đậm đặc + 3 - 5 hat Mg Quan sat trong 10

phút Nếu có màu từ vàng, đỏ đến xanh là có flavonoid

5.4.4 Coumarin

Coumarin cho các phần ứng:

——————

90

_ HạO cất 100 ml

Thuốc thử Mayer phần ứng với alcaloid cho trầm hiện màu vàng nhạt

se Thuốc thử Haser: dung dịch acid picric bão hòa trong nước

Thuốc thứ Hager phản ứng với alcaloid cho trầm hiện màu vàng

Chất thử được hòa tan trong HCI 1%, đun nhẹ ở 80°C trong I giờ, lọc

lấy dung dịch, cho 1 ml dung dich chất thử vào ống nghiệm để làm mẫu thử

Cho vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm chứa mẫu thử Nếu xuất hiện kết tủa là phần ứng dương tính

5.4.3 Flavonoid

Flavonoid có phản ứng dương tính với thuốc thử:

s Wilstatter: HCI đậm đặc + bột Mg

Chất thử được nấu sôi trong nước cất khoảng 10 phút, để nguội, lọc, lấy dịch lọc cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống Iml để làm mẫu thử

_ Ống 1: làm đối chứng

— Ống 2: thêm 0,5 ml HCl đậm đặc + 3 ~ 5 hat Mg Quan sat trong 10

phút Nếu có màu từ vàng, đỏ đến xanh là có flavonoid

5.4.4 Coumarin

Coumarin cho các phản ứng:

® Diazo héa:

Chất thử được đun hỗi lưu với alcol etil 90”, lọc, lấy 1 ml dich loc cho

vào ống nghiệm để làm mẫu thứ,

Cho 2 mi dụng địch Na;CO; 10% và 4 ml nước cất vào ống nghiệm

chứa mẫu thứ, đun hổi lưu 10 phút, để nguội Sau đó, cho vào 3 ~ 5 giọt p-

nitroanilin Néu có màu đó thẩm là có coumarin,

* Vị thăng hoa: Chất thử được đun hồi lưu với alcol eul 90”, lọc, lấy dich loc cho bốc hơi trong chén sứ đến cắn Trên chén sứ đậy một phếu lọc thủy tỉnh, bao ở đầu cuống phéu và bên ngoài phễu bằng những miếng bông

tẩm ưới Nung nóng chén sứ bằng bếp điện, coumarin sẽ thăng hoa bám vào

mặt trong của phêu thủy tỉnh

5.4.5 Saponin

Có nhiều cách xác định saponin, dựa trên các tính chất đặt trưng của

nó Đơn giản nhất là dựa trên tính tạo bọt, để sơ bộ xác định sự có mặt của saponin trong nguyên liệu

Để định tính saponin trong nguyên liệu, có thể dựa vào chỉ số bọt, Chỉ

số bọt là độ pha loãng nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao 1 cm sau khi lắc trong ống nghiệm, tiến hành trong điều kiện qui định như sau: Cho | g bột nguyên liệu vào erlen 500 mi đã chứa sẵn 100 mÍ nước sôi Đun cho sôi nhẹ

trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cất cho đúng 100 ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao l6 em và đường kính 16 mm, cho vào các ống nghiệm

đó lẫn lượt 1 ml, 2 ml, 3 ml 10 ml nude sắc Thêm nước cất vào mỗi ống

10 ml Bit miéng cac ống nghiệm và lắc theo chiêu dọc của

cho đủ

TÀI x RA a a ^ z a: +a A

Ông trong 15 giây, mỗi giầy 2 lần Đề yên 15 phút rối đo chiều cao của cột

bọt trong các ống nghiệm

ø Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức: CSH = 108

C đ: chiều cao cột bọt, cm

c: lượng mẫu trong ống nghiệm, g

e Nếu chiều cao của cột bọt trong các ống nghiệm thấp đưới 1 cm: chi

số bọt là dưới 100

e Nếu ống nghiệm có chiều cao cột bọt Ì cm là ống ở giữa ống số 2 và ống số 10, thí dụ là ống số 4, thì chỉ số bọt được tính như sau: ống nầy có 4

ml nước sắc 1% nghĩa là tương đương 0,04 g bột nguyên liệu, chỉ số bọt là:

10——=250,

0,04

e Nếu ống nghiệm có chiều cao cột bọt 1 cm là ống số l hoặc số 2: cân pha loãng nước sắc và làm lại để có chỉ số chính xác

e Nếu chiều cao cột bọt trong cả 10 ống nghiệm đều cao hon | cm, nghĩa là ngay từ ống số 1 mà chiều cao cội bọt đã cao hơn | cm, thi chi so bọt trên 1000 Cần pha loãng và làm lại thí nghiệm

5.4.6 Tanin

Tanin cho phần ứng dương tính với các thuốc thứ sau:

e Dung dịch gelain mặn:

_ Gelatin: 2g

_ Dung dich NaCi bdo hoa: 100 mi

Dung dịch gelauin mặn phần ứng với tanin cho trầm hiện mầu vàng

nhạt, để lâu hóa nâu,

* Dung dich FeCl, 1% trong nước

Cho vài giọt thuốc thử FeCh 1% vào dung dich chifa tanin, dung dich nay sé chuyén Ci ang mau xanh

Chất thử được nấu sôi trong nước cất khoảng 10 phit, dé ngudi, loc, lấy 1 mi dịch lọc cho vào ống nghiệm để làm mẫu thử

Cho vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm chứa mẫu thử Nếu xuất hiện kết tủa hoặc biến đổi màu là phản ứng dương tính

5.4.7 Glicosid

Glicosid cé phan tng đương tính với các thuốc thử:

e Molish: dung dịch 1% a-naphtol trong etanol 80%

Cách thử: Trong ống nghiệm có chứa 1 - 2 mg mẫu thử, thêm I ml H;,SO, đậm đặc, nhỏ dọc thành ống nghiệm 2 — 3 giọt thuốc thử, nếu xuất hiên tai mặt phân cách l vòng màu tím là phản ứng dương tính

ố Tollens: 0,5 ml dung dich AgNO; 10% + 0,5 ml dung dich NaOH 10%, sau đó thêm từng giọt NHẠOH cho đến khi tan hết tủa

Cách thử: Trong ống nghiệm có chứa 1 ~ 2 mg mẫu thứ, thêm 5 giọt pmidin, thêm vào 4 giọt thuốc thử Tollens mới pha, nếu có gương bạc bám lên thành ống nghiệm hoặc tủa mầu đen Ag kim loại là phản ứng dương tính 5.4.8 Antraglicosid va antranoid

Antraglicosid và antranoid được xác định bằng phản ứng Borntraeger:

_ Trong ống nghiệm, cho vài mẹ chất thử hòa trong | ml dung dich KOH 2 - 5% Đun nóng 10 phút, để nguội Acid hóa dung dịch với HCI

loãng và chiết với đietll eter

_ tách lớp eter cho vào ống nghiệm khác, thêm vào dé 1 ml KOH 5% hay NH,OH 10% Nếu dung địch có mầu đó là phần ứng đương tính

5,5 Tách chiết mật số cấu tử hữu co trong cao eter đầu

hóa của rễ Nhàu

Tiến hành sắc ký cột silicagel trên cao eter đầu hóa của rễ Nhâu với điều kiện như sau:

$ Kích thước cột sắt ký: 3 x 70 cm

t5 Trọng lượng silicagel sử dụng: 100 ø

Trọng lượng cao để nạp cột: 3 g

$ Hệ dung môi giải ly la eter dầu hỏa, benzen, cloroform và hỗn hợp của chúng có độ phân cực tăng dân

t> Hứng mỗi phân đoạn từng 50 mí

Tiên trình của sắc ký cột silicagel được theo đối bằng sắc ký lớp móng

silicagel với hệ dung ly la: benzen — cloroform — acid acetic (75 : 20 : 5),

thuốc thử hiện vết là KOH 10% trong metanol

$ Tách chiết hợp chất A1, A2

Hợp chất A1, A2 được cô lập bằng sắc ký bần dày điều chế với điều

kiện nhữ sau:

% Ban day silicagel: 20 tam 20 x 20 cm

% Hé dung ly là: benzen — cloroform — acid acetic (75 : 20 : 5)

Cạo lớp siHcagel và hòa tan trong chloroform Sau d6 loc lấy dung dich, đuổi dung môi, thu cặn

Kết tỉnh lại cặn trong aceton cho tỉnh chất có đạng tính thể hình kim

màu vàng

56 Tách chiết một số cấu tử hữu cơ trong cao alcol etil

của rễ Nhàu

Tiến hành sắc ký cột silicagel trên cao alcol etil của rễ Nhàu với điều

kién nhu sau:

t» Kích thước cột sắt ký: 3 x 79 cm

% Trọng lượng silicagel sử dụng: 200 ø

t Trọng lượng cao để nạp cot: 5 g

96

CC —_ễễễ—ễề-ễềễềễễ£ốễốệốệ

S Hệ dung môi giải ly là benzen, cloroform, metanol và hỗn hợp của chúng có độ phân cực tăng dần

Š Hứng mỗi phân đoạn từng 50 ml

Tiên trình của sắc ký cột silicagel được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng

silicagel với các hệ dung ly là:

® benzen — cloroform ~ acid acetic (7 : 2 : 1), thuốc thử hiện vết là

KOH 10% trong metanol

© hexan — acid acetic (7 : 3), thuốc thử hiện vết là KOH 10% trong

metanol

% cloroform — metanol (9 : 1), thuốc thử hiện vết là acid phosphomolIibdic bão hòa trong metanol

% benzen — metanol — acid acetic (5 : 4 : 1), thuốc thử hiện vết là KOH 10% trong metanol

5.6.1 Tách chiết hợp chất A3

Hợp chất A3 được cô lập bằng sắc ký cột silicagel với điều kiện như

sau:

%& Kich thudc cét sat ky: 2 x 60 cm

% Trong lugng silicagel sử dụng: 30 g

% Trọng lượng cao để nạp cột: 150 mg

97

¬———ễễễỄỄỄỄỄỄỄ -ễ

$ Hệ dung môi giải ly là benzen, cloroform và hỗn hợp của chúng có

độ phân cực tăng dần

Hứng mỗi phân đoạn từng 50 ml

Tiến trình của sắc ký cột silicagel được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng

silcagel với hệ dung ly là: hexan — acid acetic (7 : 3), thuốc thử hiện vết là KOH 10% trong metanol

Sau khi sắc ký cột thu được 100 mg bột màu đỏ cam Sau đó kết tỉnh bột trong aceton cho tỉnh chất có dạng tinh thể hình kim màu đỏ cam

5.6.2 Tách chiết hợp chất A4

Hợp chất A4 được cô lập bằng kết tinh lại trong alcol etil cho tỉnh chất

có dạng bột màu trắng

5.6.3 Tách chiết hợp chất A5

Hợp chất A5 được cô lập bằng sắc ký cột silicagel với điểu kiện như

sau:

% Kich thude cot sat ky: 2,5 x 50 cm

% Trong lugng silicagel sử dụng: 50 ø

% Trọng lượng cao dé nap cot: | g

% Hé dung mdi giai ly 14 chloroform, metanol va hỗn hợp của chúng

có độ phân cực tăng dần

—————>—ễ———mmr Mr.