nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phơng pháp chiết pha rắn sử dụng các cột đợc nhồi các chất rắn khác nhau, có cơ chế tơng tác giữa các chất phân tích với dung môi và pha rắn giống nh trong sắc ký lỏng.. Có thể sử dụng c

Đặt vấn đề

Vitamin là nhóm chất thiết yếu đối với sự sống mà cơ thể con ngời không thể tự tổng hợp đợc hoặc tổng hợp ở lợng rất ít không đủ đáp ứng với nhu cầu Các vitamin cần phải đợc cung cấp từ nguồn ngoại sinh Vì vậy phối hợp các vitamin nhằm cung cấp một số vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh lý và bệnh

lý không thể thiếu đợc của cơ thể đã trở thành cách sử dụng thuốc quen thuộc.Hiện nay trên thị trờng, có một số lợng lớn rất đa dạng và phong phú các chế phẩm hỗn hợp vitamin (multivitamin) Việc đảm bảo chất lợng của nhóm chất này đã trở thành nhu cầu cấp thiết

Việc phân tích các vitamin tan trong dầu và trong nớc đã đợc thực hiện thành công bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy nhiên đối với vitamin D thì việc phân tích vẫn là một vấn đề khó khăn Vitamin D có hoạt lực sinh học mạnh nên có hàm lợng rất nhỏ, ở mức tạp so với các vitamin khác trong các chế phẩm hỗn hợp ở nồng độ phân tích đợc vitamin D thì hàm lợng của các tá dợc và tạp phân huỷ của các vitamin khác rất nhiều và tơng đơng với vitamin D Thực tế chỉ có thể định lợng đợc các chế phẩm vitamin D đơn

có hàm lợng cao còn với các chế phẩm hỗn hợp với hàm lợng vitamin D thấp thì chỉ có thể định tính

Vì thế để định lợng đợc các chế phẩm hỗn hợp với hàm lợng thấp đòi hỏi phải có giai đoạn xử lý đặc biệt để làm sạch và làm giàu mẫu Trong luận văn này chúng tôi đề cập đến việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase extraction) để làm sạch và làm giàu mẫu trớc khi tiến hành định lợng bằng ph-

ơng pháp HPLC

Syro Patarvit là một ví dụ về sự phối hợp của các vitamin tan trong dầu với các vitamin tan trong nớc ở dạng bào chế syro thuốc Công thức cho 5 ml : Vitamin B1 2mg

Vitamin B2 1mg

Trong tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm chỉ quy định định tính chứ không

định lợng đợc vitamin D Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng

dụng chiết pha rắn để định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao" với các mục tiêu sau:

• Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu vitamin D trong syro thuốc

• Xây dựng quy trình HPLC để định lợng vitamin D

• áp dụng định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit

Phần 1

Vitamin D cßn cã nguån gèc tæng hîp.

Điều hoà nồng độ calci trong máu: Nếu các quá trình trên không cung cấp đủ calci, làm nồng độ calci máu giảm thì vitamin D (kết hợp với hormon tuyến cận giáp) sẽ huy động calci từ xơng ra.

Ngoài ra vitamin D còn tham gia biệt hoá tế bào biểu mô và gần đây đang nghiên cứu tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung th

Vì thế khi thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm giảm calci huyết, khi đó calci bị huy động từ xơng nên hậu quả là trẻ em chậm lớn, còi xơng, chậm biết đi, chậm kín thóp Ngời lớn sẽ bị loãng xơng, xốp x-

ơng

1.1.5 Chỉ định

Phòng và điều trị còi xơng do thiếu vitamin D

Phòng và điều trị loãng xơng, dễ gãy xơng

Chống co giật do suy tuyến cận giáp

40 UI/ml

Patar Lab LTD

mềm

A, D, B1, B2 400 UI Hàn Quốc

1.1.7 Các phơng pháp định lợng vitamin D

- Phơng pháp hóa học [2, 7, 12, 13]

+ Nguyên tắc: Vitamin D tạo màu vàng với thuốc thử antimon clorid

Đem đo quang ở 500 và 550nm, tiến hành song song với mẫu chuẩn

+ Nhận xét: Quy trình thực hiện rất phức tạp, bao gồm các giai đoạn xà phòng hóa trong điều kiện tránh oxi hóa, chiết tách và tinh chế qua các cột sắc

ký bán điều chế sử dụng các chất nhồi là đất tẩy màu dùng cho sắc ký và đất silic dùng cho sắc ký, sau đó tạo màu và đo quang Do tiến hành qua nhiều giai đoạn nên làm giảm độ chính xác

- Phơng pháp sinh học [2, 7, 12, 13]

+ Nguyên tắc: Hoạt lực vitamin D đợc đánh giá thông qua xác định mức

độ vôi hóa xơng trên thỏ hoặc chuột

+ Nhận xét: Phơng pháp này tiến hành khá phức tạp Kết quả phụ thuộc nhiều vào các cá thể và đòi hỏi ngời thử nghiệm phải đợc đào tạo kỹ lỡng

- Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1, 2, 7, 11, 12, 16]

+ Nguyên tắc: Dựa trên sự phân bố khác nhau của vitamin D giữa pha

động và pha tĩnh so với các thành phần hoạt chất khác

+ Nhận xét: Đây là phơng pháp hiện đại, ngày càng đợc áp dụng phổ biến Tuy nhiên cũng chỉ có thể áp dụng trực tiếp với các chế phẩm đơn hoặc

đa thành phần trong đó vitamin D có hàm lợng cao (>500 UI/1 đơn vị phân liều) còn với các chế phẩm có hàm lợng D thấp thì đòi hỏi phải có biện pháp

xử lý mẫu phù hợp để làm sạch và làm giàu mẫu

1.2 Kỹ thuật Chiết pha rắn [5, 14, 15]

Đây là kỹ thuật chiết đợc ứng dụng ngày càng nhiều Ngày nay, trong thực hành phân tích, nó đã dần thay thế các phơng pháp chiết lỏng-lỏng cổ

điển

Phơng pháp chiết pha rắn sử dụng các cột đợc nhồi các chất rắn khác nhau, có cơ chế tơng tác giữa các chất phân tích với dung môi và pha rắn giống nh trong sắc ký lỏng

Do cơ chế chiết tách trên mà các chất pha rắn đợc sử dụng cũng giống

nh pha tĩnh trong sắc ký lỏng

1.2.1 Phân loại các kiểu chiết

- Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên kết mà sử dụng ngay các nhóm chức

trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ Về cơ bản, sử dụng điều kiện sắc ký pha thuận Chất hấp phụ hay đợc dùng nhất là silicagel, magnesi silicat, nhôm oxyd

- Kiểu phân bố trên pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ đã đợc thay đổi,

gắn thêm nhóm chức hoá học đóng vai trò chính trong kiểu tơng tác phân

bố, bao gồm các kiểu điều kiện sắc ký sau:

• Pha thuận: pha tĩnh phân cực sẽ giữ lại các chất phân cực và cho phép các chất không phân cực đi qua cột Thông thờng kiểu này sử dụng các dung môi ít hoặc không phân cực

• Pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngợc lại kiểu pha thuận

• Pha đảo tạo cặp ion: pha tĩnh không phân cực, mẫu phân cực có chứa các phân tử cần phân tích ở dạng ion kết hợp với ion trái dấu đợc thêm vào

trong mẫu, trở thành phân tử trung hoà đợc lu giữ lại trên cột và rửa giải theo cơ chế pha đảo.

• Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đã đợc thay đổi, gắn với các nhóm chức có thể ion hoá Cơ chế tách chiết của kỹ thuật này cũng giống nh sắc ký trao đổi ion Các nhóm chức gồm nhóm trao đổi anion mạnh hoặc yếu và nhóm trao đổi cation mạnh hoặc yếu

1.2.2 Thực hành chiết, làm sạch và làm giàu mẫu qua 5 bớc

• Bớc 1: Chọn loại cột pha rắn

Có thể sử dụng các cột 1ml, 2ml hoặc 5ml phụ thuộc vào: thể tích mẫu, mức độ tạp chất, tính phức tạp của nền mẫu, lợng chất phân tích quan tâm, tính chất dung môi mẫu và tính chất tơng tác giữa chất phân tích với pha rắn

• Bớc 2: Luyện cột

Luyện cột nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu cần chiết và loại một số tạp chất còn ở trên cột Thông thờng sau khi luyện cột phải rửa tiếp cột bằng một dung môi giống nh dung môi dùng để chuẩn bị mẫu

• Bớc 3: Chuyển mẫu vào cột chiết

Chuyển chính xác lợng mẫu cần chiết vào cột, sử dụng pipet hoặc micropipet Cần lu ý, để tránh tắc cột, cần phải ly tâm hoặc lọc mẫu trớc khi chiết Sau khi chuyển toàn bộ mẫu, sử dụng máy hút chân không hoặc áp lực

đẩy

• Bớc 4: Rửa

Nếu nh hợp chất cần quan tâm lu trên cột, rửa để loại bỏ các chất không mong muốn, các tạp chất không lu trên cột bằng dung dịch đã dùng để chuẩn

bị mẫu hoặc một dung dịch khác mà nó không rửa giải hợp chất cần quan tâm

• Bớc 5: Rửa giải các hợp chất cần thiết

Sử dụng lợng nhỏ thể tích dung môi hữu cơ mà nó chỉ rửa giải hay chiết các hợp chất quan tâm và để lại các tạp chất không đợc loại trong quá trình rửa Dịch rửa giải đợc thu hồi để tiếp tục phân tích

1.2.3 Ưu nhợc điểm và ứng dụng của chiết pha rắn.

Chiết pha rắn là một phơng pháp chiết thuận tiện, không đắt, tiết kiệm thời gian và có thể thay thế cho chiết lỏng-lỏng Kỹ thuật này đợc dùng để làm sạch và làm giàu mẫu phân tích Thêm vào đó, nó giảm đáng kể lợng dung môi hữu cơ sử dụng.

Hình 1.1: Sơ đồ miêu tả kỹ thuật chiết pha rắn trong phân tích

1.3 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [3, 4, 6, 16]

1.3.1 Khái niệm cơ bản

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phơng pháp tách hoá lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đợc phân chia dới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử

- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đã đợc gắn pha liên kết

ta có sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân

tử Quyết định hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tơng tác:

Pha tĩnh F Pha động

2 1

3

Chất phân tích (A+ B+C)

Tổng của 3 tơng tác này sẽ quyết định chất nào đợc rửa giải ra trớc tiên khi lực lu giữ là nhỏ nhất và ngợc lại

1.3.2 Các đại lợng đặc trng.

• Thời gian lu và thể tích lu

Thời gian lu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ:

Hình 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trng

Nếu gọi tR là thời gian lu giữ của một chất

Thì : t’R = tR – t0

Trong đó: t’R là thời gian lu thực (thời gian lu hiệu chỉnh)

t0 là thời gian chết (thời gian không lu giữ)

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lu có thể thay thế bằng thể tích lu Thể tích lu là thể tích pha động thu đợc sau cột trong khoảng thời gian tơng ứng với thời gian lu

K =

Trong đó CS , CM là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở thời điểm cân bằng.

• Thừa số dung lợng

Thừa số dung lợng là đại lợng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lợng chất tan trong pha tĩnh và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

M

S M

S

V

V K Q

t t

O RB A

B A

B

t

t t t

t t k

k K

ở đây ta quy ớc chất B bị lu giữ mạnh hơn chất A, nh vậy α luôn lớn hơn

1, α càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ Thờng phân tích trong

điều kiện α trong khoảng 1,5 đến 2.

• Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột thờng đợc biểu thị qua hai thông số : Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H)

Số đĩa lý thuyết N đợc tính theo các công thức :

54 , 5

Trong đó W : Là chiều rộng pic ở đáy pic

W1 / 2 : Là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Chiều cao của đĩa lý thuyết đợc tính theo công thức :

N

L

Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký Với một điều kiện sắc ký nhất

định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích

• Độ phân giải (RS)

Độ phân giải là đại lợng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh nhau đợc tính theo 1 trong 3 công thức sau:

B A

RA RB S

W W

t t R

18 , 1

B A

RA B W W

t t

k

k B

A là khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đờng cong phía trớc, ở tại 1/20 chiều cao pic

1.3.3 Hệ thống HPLC

Theo thứ tự từ đầu đến cuối của hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau

• Bình chứa dung môi

• Bơm cao áp : đẩy pha động qua cột sắc ký

• Bộ phận tiêm mẫu : tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định

• Cột tách (pha tĩnh)

• Detector

• Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính

1.3.4 Pha tĩnh

* Khái niệm: Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách

một hỗn hợp chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp, kích thớc hạt rất nhỏ,

đờng kính cỡ hạt từ 3 – 10àm, diện tích bề mặt hạt thờng từ 50 – 500 m2/g

- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion

- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, ngời ta chia nó thành hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài)

* Điều kiện đối với một pha tĩnh

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trờng sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc

- Tính chất bề mặt phải ổn định

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tơng đối đồng nhất

1.3.5 Pha động

• Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Đây là một yếu tố rất linh động và dễ dàng thay đổi Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỷ lệ nhất định Nó cũng có thể là dung dịch các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói

chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có đợc hiệu quả phân tách tốt nhất.

• Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu Nó quyết định thời gian lu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký Pha động có thể ảnh hởng đến :

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lu giữ của chất tan

- Hiệu lực của cột tách

- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký

• Điều kiện đối với một pha động

- Phải trơ đối với pha tĩnh

- Hoà tan đợc chất cần phân tích

- Bền vững theo thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detetor dùng để phát hiện các chất phân tích

- Có tính kinh tế và không quá hiếm

• Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:

- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động

- Thành phần các chất tạo ra pha động

Đánh giá chiều cao pic : Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic là

một đại lợng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá

1.3.7 Phơng pháp định lợng và cách tính kết quả trong HPLC.

Tất cả các phơng pháp định lợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc là: Nồng độ của chất tỉ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó Có 4 phơng pháp định lợng đợc sử dụng trong sắc ký:

Mẫu syro Patarvit

Nhà sản xuất: Patar Lab Ltd., Part (Thái Lan)

Số lô: 406146

Hạn dùng: 06-2006

Công thức: trong mỗi 5 ml syro chứa:

Vitamin B1 2mg Vitamin B2 1mg Vitamin B6 1mg Nicotinamid 5mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D 200UI Lysine 100mg

Hoá chất:

- Chất đối chiếu vitamin D (dầu 1000.000 UI/g)

- Chất đối chiếu vitamin A (dầu 1000.000 UI/g)

- Chất đối chiếu vitamin B1, B2, B6, PP

- Methanol tinh khiết sắc ký

- Acetonitril tinh khiết sắc ký

- Nớc cất

- Hexan

Dụng cụ-thiết bị:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : HP 1100, gắn với máy vi tính và máy in

- Bộ thiết bị chiết pha rắn

- Các dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức chính xác 50 ml; 25 ml; 20 ml;10 ml; ống đong, pipet chính xác, cốc có mỏ và các dụng cụ thuỷ tinh khác

2.1.2 Nội dung và phơng pháp nghiên cứu

Nội dung:

- Khảo sát và xây dựng quy trình chiết

+ Lựa chọn dung môi để rửa sạch tạp và dung môi để rửa giải

+ Khảo sát thể tích dung môi để rửa sạch tạp mà vẫn không làm mất vitamin D

+ Khảo sát thể tích dung môi rửa giải để rửa giải hết vitamin D

+ Khảo sát lợng dung môi để rửa sạch các vitamin còn lại trong cột để phục hồi cột

- Xây dựng quy trình HPLC để phân tích Vitamin D

Để xây dựng chơng trình sắc ký thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát : + Kiểu sắc ký áp dụng

+ Khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin D

+ Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lợng

- áp dụng định lợng vitamin D trong syro Patarvit.

+ Sử dụng quy trình chiết và quy trình sắc ký đã xây dựng ở trên để định lợng vitamin D trong syro Patarvit

+ Khảo sát tính chính xác của kết quả phân tích

+ Khảo sát tính đúng của kết quả phân tích

Phơng pháp nghiên cứu:

Phơng pháp nhiên cứu sử dụng trong khoá luận là sắc ký lỏng hiệu năng cao và chiết pha rắn (SPE) Tiến hành thực nghiệm để xây dựng quy trình chiết tối u và chơng trình sắc ký phù hợp nhất Sau đó thông qua xử lý thống

kê các kết quả khảo sát để đánh giá chơng trình sắc ký và phơng pháp đã xây dựng

n i i

Xử lý cột (luyện cột) : lần lợt cho qua cột 3ml methanol, 3ml nớc, 5ml

methanol- nớc (50:50)

Khảo sát điều kiện chiết:

- Pha dung dịch mẫu: tiến hành pha một dung dịch chuẩn có công thức cho mỗi 5 ml nh sau:

Vitamin B1 2 mg Vitamin B2 1 mg Vitamin B6 1 mg Nicotinamid 5 mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D 1.000 UI

Cân chính xác khoảng 20mg B1, 10mg B2, 10mg B6, 10mg dầu Vitamin D (1000.000 UI/g), 10mg dầu Vitamin A (1000.000 UI/g) Cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol tuyệt đối rồi thêm methanol đến vạch.Hút 1ml dung dịch trên cho qua cột SPE đã đợc xử lý

- Pha dung dịch vitamin D chuẩn

- Pha dung dịch vitamin A chuẩn

Khảo sát điều kiện rửa:

Mục đích của chúng ta là làm sạch mẫu trứơc khi sắc ký Vậy phải chọn loại dung môi và thể tích dung môi phù hợp để rửa hết các vitamin tan trong nớc (B1, B2, B6, PP) trong khi không rửa trôi vitamin D

Trong mẫu có một lợng lớn các vitamin tan trong nớc gồm B1, B2, B6,

PP Để rửa sạch các vitamin này ta lựa chọn nớc, sau đó là methanol-nớc.Tiến hành khảo sát thể tích nớc và methanol- nớc để loại hết các vitamin tan trong nớc mà không mất vitamin D:

Rửa cột bằng 10ml nớc tinh khiết chia làm 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2

ml Hứng 5 phân đoạn này vào 5 cốc đánh số từ 1 đến 5, sau đó đem sắc ký Kết quả: các vitamin B1, B2, B6, PP đã đợc rửa sạch khỏi cột trong 4ml đầu