Thực nghiệm nghiên cứu về cây vọng cách Prema

Trang 1

4 THỰC NGHIỆM

4.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

4.1.1 Hóa chất

¾ Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: eter dầu hỏa (60oC - 90oC), benzen, cloroform, etyl acetat, aceton, metanol

và etanol đều là hóa chất Trung Quốc

¾ Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, dung dịch acid sulfuric đậm đặc hiện hình bằng cách nung nóng, soi đèn UV hoặc dùng hơi iod

¾ Silica gel 60G F254 (0.040 – 0.063mm) loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, Merck

4.1.2 Thiết bị

¾ Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, ống đong, pipetman)

¾ Máy cô quay chân không, kèm bếp cách thủy

¾ Cột sắc ký: cột cổ điển

¾ Sắc ký lớp mỏng pha thường 25DC – Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254, Merck và pha đảo RP-18 F254 , Merck

¾ Các thiết bị ghi phổ:

- Phổ 1H–NMR, 13C–NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90, phổ HSQC và

phổ HMBC: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 ở

tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR

Các phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học và Khoa Học Công

Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội

Trang 2

4.2 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG

LÁ VỌNG CÁCH (PREMNA SERRATIFOLIA L.)

4.2.1 Điều chế các loại cao

Lá cây vọng cách thu hái ở quận 12, thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 12 năm 2006, được định danh bởi thầy Hoàng Việt, bộ môn Thực vật và Sinh môi trường đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM Lá cây được sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi, vò nhuyễn được 2 kg mẫu khô Mẫu khô được trích nóng với metanol bằng phương pháp đun hoàn lưu, lọc, cô quay thu hồi dung môi được cao thô metanol Hòa tan cao metanol vào nước, lần lượt chiết với các dung môi eter dầu, cloroform, butanol, cô quay dịch trích ở áp suất kém thu được các loại cao

tương ứng Quy trình trích cao được tóm tắt trong sơ đồ 1

Trang 3

Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế cao

Lá khô

(2kg)

-Đun hoàn lưu trong metanol trong 3 giờ (3 lần)

- Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Cao metanol

- Hòa vào nước

- Trích với eter dầu

- Thu hồi dung môi

(60g)

- Trích với cloroform

- Thu hồi dung môi

Cao cloroform

(12 g)

Dịch nước

-Trích với butanol -Thu hồi dung môi

Cao butanol

(80g) Cao nước(50 g)

Trang 4

4.2.2 Khảo sát cao eter dầu

Sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường cao eter dầu hỏa (60 g) với các hệ

dung ly có độ phân cực tăng dần thu được mười phân đoạn từ E1 đến E10

Sơ đồ 2: Quy trình xử lý cao eter dầu hỏa của lá cây vọng cách

Cao eter dầu

(60 g)

SKC silica gel pha thường với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau

Nhận xét:

Trong mười phân đoạn (E1 đến E10), sắc ký bản mỏng các phân đoạn E2, E3, E5

cho những vết rõ ràng nên được chọn tiếp tục khảo sát

4.2.2.1 Khảo sát phân đoạn E2

Sắc ký cột phân đoạn E2 trên silica gel với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat có

độ phân cực tăng dần, thu được chín phân đoạn (E2.1 – E.2.9) Ở các phân đoạn thứ

E2.7 thấy có kết tủa màu trắng tách ra khỏi dung dịch Lọc kết tủa, tiến hành sắc ký

cột và sắc ký điều chế phần kết tủa nhiều lần với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat

(9:1) thu được 8mg VCE1 Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 3

VCE1

(8 mg)

VCE3

(10 mg)

VCE4

(2 mg)

VCE2

(10 mg)

E2

Trang 5

Sơ đồ 3: Sơ đồ cô lập hợp chất VCE1 từ phân đoạn E2

- SKC trên silica gel

- Hệ dung ly eter dầu : etyl acetat

Các phân đoạn

E 2.1 – E 2.6

Phân đoạn E 2.7

(40 mg)

- SKC silica gel và sắc ký điều chế nhiều lần

- Eter dầu:etyl acetat (9:1)

VCE1

(10 mg)

Phân đoạn E2

(1g)

Các phân đoạn

E 2.8 – E 2.9

Sắc ký cột silica gel phân đoạn E3 với các hệ dung ly có độ phân cực tăng

dần Hệ dung ly được sử dụng ở đây là eter dầu : etyl acetat 99:1→ 98:2→ 95:5→ 9:1→ 85:15→8:2

Quá trình sắc ký cột kết hợp với việc triển khai trên bản mỏng thu được 15

phân đoạn (E3.1-E3.15) Tiếp tục sắc ký cột phân đoạn E3.6 trên silica gel với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat, thu được 12 phân đoạn (E3.6.1-E3.6.12) Ở phân đoạn

E3.6.7 thấy xuất hiện kết tủa màu cam, tinh chế kết tủa thu được 10 mg hợp chất VCE3 Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 4

Trang 6

Sơ đồ 4: Sơ đồ cô lập hợp chất VCE3

(500 mg)

Phân đoạn E3.6

(80 mg)

Phân đoạn E3.7 – E3.15

- Hệ dung ly eter dầu:etyl acetat

Phân đoạn

E3.1 – E3.5

Phân đoạn

E3.6.1 – E3.6.6 Phân đoạn E3.6.7 (30mg) E3.6.8 – E3.6.12 Phân đoạn

- Lọc kết tủa

VCE3

(10 mg)

Sắc ký cột phân đoạn E5 trên silica gel pha thường với hệ dung ly eter dầu:etyl acetat có độ phân cực tăng dần, dựa vào sắc kí bản mỏng gom thành sáu

phân đoạn (E5.1–E5.6) Sắc ký cột silica gel pha thường phân đoạn E5.3 với hệ

dung ly eter dầu : etylacetat có độ phân cực tăng dần (100 : 0 → 95 : 5→ 90 : 10

→80 : 20→ 70 : 30→ 60 : 40) thu được năm phân đoạn (E5.3.1-E5.3.5) Tinh chế

Trang 7

phân đoạn E5.3.2 thu được 2 mg hợp chất VCE4 Tiếp tục sắc ký cột silica gel pha thường trên phân đoạn E5.3.4 với hệ dung môi eter dầu:cloroform (40:60) thu được

10 mg hợp chất VCE2 Quy trình được tóm tắt ở sơ đồ 5

Sơ đồ 5: Sơ đồ cô lập VCE2 và VCE4

(2 g )

có độ phân cực tăng dần

Phân đoạn

E5.1 , E5.2 Phân đoạn E5.3 ( 200 mg) E5.4 - E5.6 Phân đoạn

- Hệ dung ly eter dầu:etylacetat

Phân đoạn E5.3.4

(30 mg)

Phân đoạn E5.3.2

(15 mg)

VCE2

(10mg)

Phân đoạn E5.3.1,

E5.3.3 và E5.3.5

VCE4

(2 mg)

Trang 8

4.2.3 Khảo sát cao butanol

Sắc ký cột trên silica gel pha thường cao butanol (80 g) với các hệ dung ly có độ

phân cực tăng dần thu được 8 phân đoạn từ B1 đến B8

Sơ đồ 6: Quy trình xử lý cao butanol

Cao butanol

(80 g)

B1

VCB1

(5 mg)

VCB2

(50 mg)

4.2.3.1 Khảo sát phân đoạn B1

Sắc ký cột trên silica gel pha thường phân đoạn B1 với hệ dung ly

cloroform:metanol có độ phân cực tăng dần, dựa vào sắc ký bản mỏng thu được sáu

phân đoạn (B1.1-B1.6) Tiếp tục sắc ký cột trên silica gel pha thường phân đoạn

B1.5 trên silica gel với hệ dung ly cloroform:etyl acetat tỉ lệ tăng dần (100:0 → 95:5

→ 90:10 → 85:15 → 80:20 → 70:30), thu được bốn phân đoạn (B1.5.1-B1.5.4) Sắc kí cột trên silica gel pha thường phân đoạn B1.5.2 trên silica gel với hệ dung ly

cloroform: metanol có độ phân cực tăng dần thu được năm phân đoạn Tiếp tục sắc

ký cột trên silica gel pha đảo RP-18 phân đoạn B1.5.2.2 với hệ dung ly metanol:nước (1:1) thu được 5mg hợp chất VCB1 Quy trình được tóm tắt trong sơ

đồ 7

Trang 9

Sơ đồ 7: Sơ đồ cô lập VCB1

- Hệ dung ly cloroform:metanol

- Hệ dung ly cloroform:etyl acetat

Phân đoạn B1

(3 g)

Phân đoạn B1.6

Phân đoạn

B1.1-B1.4

(3 g)

Phân đoạn

B1.5.2.1

Phân đoạn

B1.5.1

- SKC trên silica gel pha đảo RP-18

- Hệ dung ly metanol:nước

VCB1

Phân đoạn B1.5.2

Phân đoạn B1.5.3-B1.5.4

Phân đoạn

B1.5.2.3-B1.5.2.5

Phân đoạn

B1.5.2.1

Phân đoạn

B1.5.1

- SKC trên silica gel pha đảo RP-18

- Hệ dung ly metanol:nước

Phân đoạn

B1.1-B1.4

(3 g)

Phân đoạn

B1.1-B1.4

Phân đoạn B1.5.3-B1.5.4

Phân đoạn

B1.5.2.3-B1.5.2.5

Phân đoạn

B1.5.1

Trang 10

4.2.3.2 Khảo sát phân đoạn B3

Sắc ký cột trên silica gel pha thường phân đoạn B3 với hệ dung ly

cloroform:metanol:nước tăng dần (1:0:0→95:5:0 → 9:1:0 → 8:2:0 → 20:6:1→ 14:6:1→ 4:6:1) Quá trình sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng thu được 25

phân đoạn (B3.1-B3.25) TIếp tục sắc ký cột phân đoạn B3.16 với hệ dung ly etyl acetat:metanol:nước (8:1:1) thu được hợp chất VCB2 Quy trình được tóm tắt ở sơ

đồ 8

Sơ đồ 8: Sơ đồ cô lập hợp chất VCB2

- Hệ dung ly cloroform:metanol:nước (14:6:1)

(700 mg )

Phân đoạn

B3.1-B3.15

- Hệ dung ly etyl acetat:metanol:nước (8:1:1)

VCB2

(50 mg)

Phân đoạn B3.17-B3.25

Trang 11

4.2.4 Thử nghiệm độc tính tế bào

Tiến hành thử nghiệm độc tính tế bào của các cao và hợp chất thu được bằng

phương pháp Sulforhodamine B (SRB) Thử nghiệm SRB là một phương pháp so

màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật

độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

4.2.4.1 Thiết bị - Hóa chất

• Thiết bị

- Cân phân tích

- Tủ cấy vô trùng

- Tủ ấm 37 oC, 5% CO2

- Kính hiển vi, kính soi ngược

- Máy ly tâm

- Máy lắc

- Máy đếm tế bào

- Đĩa 96 giếng

- Bình Roux

- Micropipet

• Hóa chất

- Môi trường MC Coy

Trang 12

- Huyết thanh

- Trypsin/EDTA

- DMSO

- Tricloroacetic (TCA) 50%

- Acid acetic 1%

- Tris bas 10nM

- Tế bào ung thư ruột kết DLD-1

Trang 13

4.2.4.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB

Nuôi cấy tế bào trong bình Roux đạt độ phủ 80-90%

Huyền phù để tách lớp đơn

tế bào

Đếm và phủ tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 10.000 tế bào/ giếng

Lắc trên máy 10 phút

Hòa tan SRB đã gắn bằng 10nM Tris-bas

Rửa 4 lần với 1% acid acetic

Rửa 5 lần với nước

Nhuộm SRB trong thời gian

20 phút ở nhiệt độ phòng

Cố định tế bào bằng TCA 50%

đặt vào tủ 4oC trong vòng 1h

Ủ 48h trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2

Thêm các chất cần thử với nhiều

nồng độ khác nhau Chất chứng dương là resveratrol

Ủ 24h trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2

Đọc kết quả tại bước sóng

492 và 620 nm

Trang 14

4.2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel

Phần trăm tăng trưởng tế bào được tính theo công thức

(3.1)

G (%) = ODTN

ODDC x 100 %

Phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào được tính theo công thức

(3.2)

Trong đó

%G: phần trăm tăng trưởng tế bào

%I : phần trăm ức chế tăng trưởng tế bào

OD TN : Giá trị OD của mẫu thí nghiệm

OD DC: giá trị OD của mẫu đối chứng

Các số liệu OD492 và OD620 thu nhận được từ máy được xử lý theo phương pháp sau trên Microsoft Excel

Từ hai thông số OD ở 492 nm và 620 nm, tính giá trị OD sử dụng theo công thức sau

(3.3)

I (%) = ODDC OD TN

ODDC x 100 = 1 G

[ OD492(TN) – OD620(blank)] – [ OD620(TN) – OD620(blank)]

Tính giá trị trung bình OD giữa các lần lặp

Tính %G và %I theo công thức 3.1 và 3.2 Tính trung bình %G và %I của

các lần lặp

Trang 15

Tính độ lệch chuẩn (STD) theo công thức

(3.4)

Trong đó

x : giá trị OD, %G hoặc %I của từng lần lặp

x : giá trị OD, %G hoặc %I trung bình

n : số lần lặp

Trình bày kết quả: giá trị trung bình ± STD

Tiêu đề	Thực nghiệm nghiên cứu về cây vọng cách Prema
Tác giả	Phạm Thị Bích Vân
Người hướng dẫn	TS. Trần Lờ Quan
Trường học	Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM
Chuyên ngành	Hóa học
Thể loại	Luận văn
Năm xuất bản	2006
Thành phố	Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	15
Dung lượng	425,93 KB