Nghiên cứu tách chiết cô lập Amyrin và Brassicaterol từ cây ké đầu ngựa

Nghiên cứu tách chiết cô lập Amyrin và Brassicaterol từ cây ké đầu ngựa

PHẦN NGHIÊN CỨU

2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cây Ké

2.1.3 Xác định một số cấu từ hữu cơ trong cây Ké Đầu Ngựa:

Chúng tôi tiến hành xác định một số cấu tử hữu cơ thường hiện điện trong cay cé nhu: sterol, flavon, tanin, alcaloid, glicosid, saponin, triterpen,

Mỗi cấu tử hữu cơ được định tính bởi những thuốc thử đặc trưng, thường là các thuốc thử cho phdn ứng có màu hoặc cho phần ứng trầm hiện Sự khảo sát các cấu tử hữu cơ được thực hiện trên các dạng cao: ©fer đầu hỏa, benzen, chloroform và metanol của các bộ phận của cây

Cac dang cao trên được điều chế theo sơ đổ 1.

Bảng 5 Hàm lượng các nguyên tố trong tro của các bộ phận của cây

So dé 1 Điều chế cao ster dầu héa, cao benzen, cao chioroform và cao metanol

- €6 can dung mdi d 40°C

trong mấy cổ quay

2.1.3.1 Sterol va triterpen [8] [17] [39]:

Saterol va triterpen dudc x4c dinh diva trén các phấn ứng có màu

với các thuốc thử Liebermann ~ Burchard, Salkowski va Noller

Hòa tan mẫu cao (0,1g) trong CHCH; (20ml) Lọc; lấy dịch lọc để trắc nghiệm với các thuốc thử (bảng Ó),

Bảng 6, Kết quả định tính sierol và triterpen trong cao eter ddu héa,

cao benzen, cao chloroform va cao metanol cia ld, than va ré

cây Ké Đầu Ngựa

* 4

Báng 7 Kết quả định tính flavon trong cao eter dầu hẳn, cao benzen,

cao chloroform va cao metanel của lá, thân và rễ cây Ké

Than Cas benzen -

Cao chioroform - Cao metanol +

Để định tính alcaloid, chúng tôi tiến hành theo phương pháp sau đây :

Ngdm nguyén liéu cao (0,1g) trong dung dich H,SO, 3% ; dun nhẹ

& 80°C trong 6 giờ Lọc ; lấy dịch lọc để thử với các thuốc thử như

Bouchardat, Mayer, Hager, Bertrand, Dragendorff

Kết quả định tính alcaloid được tốm tắt trong bang 8.

Bảng 8 Kết quả định tính alcaloid trong cao eter dầu hỏa, cao benzen,

cao chloroform va cao metanol cia lá, thân và rễ cây Ké Đầu

2.1.3.4 Tanin [21 ]:

Dé dinh tinh tanin, chúng tôi sử dụng các thuốc thử cho phần ứng mầu và trầm hiện như : thuốc thử Stiasny, dung dich gelatin man, dung dich acetat chi bao hoa, dung dich FeCl, 1%,

Nấu sôi mẫu cao (5g) trong nước cất (100ml), trong 10 phút Lọc

và thực hiện các phản ứng của địch lọc với các thuốc thứ (bảng 9)

Bảng 9 Kết quả định tính tanin trong cao eter dédu héa, cao benzen,

cao chioroform và cao metanol của lá, thân và rễ cây Ké Đầu

phan Stiasny |Gelatin mặn| Acetat chì | FeCH 1%

2.1.3.5 Glicosid:

Để định tính glicosid, chúng tôi dùng phương pháp SOOS (có sửa đổi) theo sơ đổ 2 Dịch alcol sau cùng được dùng để trắc nghiệm với các

thuốc thử Baljet và Molish (bảng 10)

Bang 10 Kết quả định tính giicosid trong cao eter dầu hỏa, cao

benzen, cao chloroform va cao metanol của lá, thân và rễ

cây Ké Đầu Ngựa

Chloroform - - Metanol + +

Sơ đồ 2 : Định tính giicosid theo phương pháp SOOS

Chế hóa với dung dịch

Na2SO,4 bão hòa

2.1.3.6 Saponin [20]:

Dung tinh tao bot đặc trưng của saponin để sơ bộ xác định sự hiện điện

của nó trong cây

Khả năng tạo bọt được biểu hiện qua chỉ số bọt Theo định nghĩa,

chỉ số bọt là độ pha loãng của nước sắc nguyên liệu có cột bọt cao Ì em

sau khi lắc trong ống nghiệm và được tiến hành trong điều kiện qui định

Cho nguyên liệu (1 gam) vào erlen 500 ml chứa sẵn nước sôi

(100ml), giữ cho sôi nhẹ 20 phút Lọc; để nguội và thêm nước cất vào

cho đúng 100 ml,

Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao lố cm, đường kính l6 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3, 10ml nước sắc, thêm nước cất vào

méi Ong cho dd 10ml Bit miéng dng nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của

ống trong 15 giây, lắc 2 lần trong mỗi giây Để yến 15 phút, đo chiều cao

Bảng 11 Tóm tắt kết quả xác định các cấu tử hữu cơ trong cao eler

dau héa, cao benzen, cao chloroform và cao mefanol của

lá, thân, và rễ cây Ké Đầu Ngựa

Cao eter đầu hỏa, cao benzen, cao chloroform và cao metanol của lá, thân và rễ cây Ké Đầu Ngựa chứa triterpen và có thể chifa sterol

® Cao metanol của lá, thân và rễ cây Ké Đầu Ngựa chứa triterpen,

alcaloid, tanin, glicosid và có thé chifa sterol

# Cao metanol của lá và thân cầy Ké Đầu Ngựa chứa flavon

eter dầu hỏa còn chứa một lượng rất lớn chất béo Do đó, cần phải xà phòng hóa

cao eter dầu hỏa để loại chất béo và trích phần không xà phòng hóa khỏi hốn hợp

vGi eter eth

Sự xà phòng hóa xây ra theo phản ứng sau đây :

Sau phản ứng xà phòng hóa, chất béo chuyển thành muối tan trong nước Phần không xà phòng hóa được trích với eter etil Cô cạn dung môi cho phần cặn có thể chứa triterpen, alcol mạch đài dây thẳng

Để cô lập triterpen, chúng tôi sứ dụng phương pháp tách phân đoạn bằng sắc

ký trên cột, dùng chất hấp phụ là alumin trung tính, với hệ thống dung môi giải ly

khác nhau như : eter dầu hỏa, eter dầu hỏa - benzen, benzen Trong quá trình sắc

ký trên cột alumin, các chất tách ra từ các phân đoạn dụng môi khác nhau được theo

dói bởi :

e sắc ký trên bản mong silicagel (triển khai bản mồng với hệ thống dung môi

chioroform—acetat cHl 3:1, thuốc thử làm hiện vết trên bản mỏng là dung dich

acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%)

* phan Ứng có mầu với các thuốc thử đặc trưng : Liebermann - Burchard, Salkowski va Noller

Thuốc thi Liebermann — Burchard :

Kết quả sắc ký cột alumin trên phần không xà phòng hóa là phân đoạn 7?-

107, giải ly với dung môi eter dầu hỏa-benzen tỉ lệ 3:1, sau khi cô cạn dung môi, cho chất rắn trắng kết tỉnh trong MeOH dưới dạng tính thể gọi là sản phẩm 7.

Sản phẩm 7 có các đặc trưng như sau:

e© 7 kết tỉnh trong MeOH dưới dang tinh thể hình kim, nóng chảy 6 196°C

© 7 cho trắc nghiệm dương tính với 3 thuốc thử đặc trưng của triterpen: thuốc thử Liebermann-Burchard, thuốc thử Salkowski và thuốc thử Noller

e© Sắc ký trên bản mỏng silicagel 60F¿s¿ (triển khai bản mỏng với chloroform- acetat eul tỉ lệ 3:1, thuốc thử làm hiện các vết là dung dịch acid

phosphomolibdic 10% trong EtOH 95%) thực hiện trên 7 cho 1 vết tròn màu

xanh, R; = 0,60

e Tit tan trong alcol, tan trong eter etil, benzen, chloroform

2.2.2 Xử lý mẫu cây nghiên cứu :

Ở Việt Nam, cây Ké Đầu Ngựa mọc hoang khắp nơi, ở vùng đồng bằng, miền núi và miễn biển Gần đây, do nhu cầu, nhiều nơi trồng cây Ké Đầu Ngựa để dùng làm thuốc

Việc trồng cây tương đối đơn giản : cần làm đất, bón phân cho tốt Tro, đất

sông, phosphat đều dùng được Đào từng lổ nhỏ, cho 3,4 hột vào mỗi hố cách nhau

50-60 cm Phủ ít đất lên và tưới ẩm; cây mọc mười ngày sau Khi cây cao khoảng 6-7 cm, có thể bứng đem trồng chổ khác Vào cuối mùa nắng hay sang mùa mưa, hái trái chín hay hái cả cây đem phơi khô hoặc sấy để dùng

Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi thu hái cây Ké Đầu Ngựa ở xã Mỹ

Đức, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang vào tháng 2, tháng 6 năm 1998 và tháng 2

năm 1999

Sau khi thu hái mẫu cây, nhặt lấy phần lá Rửa sạch lá khỏi đất cát; phơi khô

lá dưới ánh nắng mặt trời và sấy ở nhiệt độ 40-50°C cho đến khi trọng lượng không

đổi Nghiền lá khô thành bột, đây là mẫu nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu.

2.2.3 Điều chế cao eter dâu hỏa:

Bột lá khô (600g) được tận trích với eter dầu hỏa (60-90°C) trong dụng cụ

Soxhlet Lọc dịch trích eter dầu hỏa; cô cạn dung môi ở 40°C trong máy cô quay

thu được cao eter dầu hỏa (18,3 g), (sơ đồ 3)

Sơ đồ 3 Điều chế cao eter dầu hỏa của lá khô cây Ké Đầu Ngựa

Lá tươi (4,7 kí)

+ Phơi đười ánh nắng mặt trời

+ Sấy khô lá ở 40°C cho đến khi

trọng lượng không thay đổi

Tận trích với eter dầu hỏa (60-90°C)

trong dung cu Soxhlet

| Cô cạn ở 40°C

Cặn eter dầu hỏa

(18,3 g)

Hiệu suất: 3% tính trên trọng lượng lá khô

2.2.4 Điều chế phần không xà phòng hóa của cao eter dầu hỏa:

Xà phòng hóa cao eter dầu hỏa (18,30 g) với dung địch KOH (16,78) trong

EIOH 95% (§5ml) Sau khi đun hoàn lưu hỗn hợp và để nguội, thêm nước cất

(1iÔmi)

Tận trích phần không xà phòng hóa với eter cũl Làm khan dung môi với Na¿SÕ¿ và cô cạn dung môi cho phần căn không xà phòng hóa (§,1g) (sơ đồ 4)

Sở đồ 4, Điều chế phần không xà phòng hóa của cao eter dâu hảa

Cao eter dầu hóa (18,32)

+ Hoa tan cao trong dung dich

KOH khan (16,7 2) trong EtOH 95% (85ml)

+ Đun hoàn lưu trong 2 gid + Để nguội

2.2.5 Cô lập triterpen từ phần không xà phòng hóa:

Sau giai đoạn xà phòng hóa cao eter dầu hỏa của lá khô, phần không xà phòng

hóa thu được có thể chứa các cấu tử hữu cơ không tham gia phần ứng xà phòng hóa

như : triterpen, alcol mạch đài dây thẳng,

ching tôi sử dụng phương pháp tách phân đoạn bằng sắc ký trên cột, dùng chất hấp

phụ alumin và hệ thống dụng môi giải ly khác nhau Trong quá trình sắc ký, các

chất sẽ được tách ra từ các phân đoạn dung ly khác nhau

Thực hiện sắc ký cột phần không xà phòng hóa của cao eter dầu hỏa (8,1 g) trên cột alumin trung tính (250 g), với hệ thống dung môi giải ly là cter dầu hóa,

cter dầu hỏa — benzen và benzen Hứng mỗi phân đoạn 100ml

Theo dõi quá trình sắc ký bằng các thuốc thử của triterpen kết hợp với sắc ký trên bản mỏng silicagel (đùng ban mong silicagel GOF 254 , hé dung ly 1a chloroform— acetat cHl với tỈ lệ 3:1, thuốc hiện hình các vết là dung dich acid phosphomoybdic 10% trong etanol 95%), Kết quả của tiến trình sắc ký trên cột aluamin được tóm tắt

trong bang 12

Theo kết quả sắc ký trên cột alumin thực hiện trên phần không xà phòng hóa

của cao eter dầu hỏa, phân đoạn 77—107, với dung môi giải ly là eter dầu hổa - benzen theo tỉ lệ 3:1 (3100ml) cho một vết duy nhất với sắc ký trên bản mống

mầu đặc trưng của trierpen

2.2.6 Kháo sát cơ cấu của trHcrpen 1:

Sau khi tách chiết và cô lập được sản phẩm từ dịch trích cter dầu hỏa của lá cây Ké Đầu Ngựa, chúng tôi tiến hành khảo sát cơ cấu của sản phẩm 7 bằng các

phương pháp sau đây :

2.2.6.1 Xác định điểm nắng chảy T,:

Sản phẩm 7 kết tỉnh trong MeOH dưới dạng tỉnh thể trắng, nóng chảy ở

196°C

T, = 196°C (MeOH)

2.2.6.2 Sée kj trén ban méng silicagel:

Tiến hành sắc ky ban mong trên sản phẩm 7 cô lập với điều kiện như sau: bản moéng TLC plastic roll 0,2 mm, silicagel 60 F¿s¿, dung ly là

chloroform—acetat eiil, tỉ lệ 3:1, thuốc thử lầm hiện các vết là dung dịch

acid phosphomolybdic 10% trong EtOH

Phun thuốc thứ lên bản mỏng Sấy bản móng ở 150C trong 15 phút, Kết quả cho một vết tròn mầu xanh, Rịr= 0,60 (hình 2).

Hình 2 Sắc ký trên bản mỏng silicagel của sản phẩm T

2.2.6.3 Phương pháp phổ nghiệm:

a) Phổ hồng ngoại: ( xem phụ lục 1, trang 81)

Phố hồng ngoại cho thấy có sự xuất hiện của các mỗi đặc trưng sau

Phé °C —~ NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy có sự xuất hiện các

mũi cộng hưởng tương ứng với những loại carbon như sau (bảng 14)

của T

é, ppm

1 143,9 Không có mũi cộng hướng | Ì carbon tứ cấp - C =

5 473 Mũi dương 1 carbon >CH —

8 41,5 Không có mũi cộng hưởng |1 carbon tứ cấp - C ~

9 39,3 Không có mũi cộng hưởng | Ì carbon tứ cấp -€ —

is 38,3 Mũi âm 1 carbon — CH, ~

12 36,3 Không có mũi cộng hướng | | carbon ty c&p — c ~

l4 33,0 Mũi dương ] carbon — CH, |

15 32,2 Khong cé miicdng hudng = | carbon uf cap - Cc -

17 30,6 Không có mũi cộng hưởng | Ì carbon tứ cấp -C =

26 23,0 Mũi âm 1 carbon — CH, -

30 [ 15,0 | Mai dudng I carbon - CH,

2.2.6.4 Diéu ché ddn xudt acetat cua triterpen T:

Phé héng ngoai cia sdn phdm T có vạch hấp thu ở 3200 cơ! tương ứng với đao động giấn của nhóm hidroxi - OH Để chứng minh thêm sự hiện diện của nhóm hidroxi - OH trong cơ cấu của sản phẩm 7, chúng tôi thực hiện phần ứng acetil hóa 7, ding anhidric acetic và piridin

Acetat kết tỉnh trong metanol dưới dạng tỉnh thể trắng

* Xác định điểm nóng chây:

Điểm nóng chảy của dẫn xuất acetat của sản phẩm Ÿ là:

T.= 240 ~241°C

*% Phổ hàng ngoại cho các mũi đặc trưng sau đây: (xem phụ lục 5, trang 55)

V em! (KBr): 1720 (>C=0 ester), 1450, 1360, 1250 (- OAc) va 1020

ae *® Phd 21 “H ~ NMR cho thay các mũi cộng hưởng như sau: (xem phụ lục 6, ” „ we a 5

trang 56) ( bảng 15 )

Bảng 15 Phổ 'H - NMR của acetat của triterpen T

Sản phẩm T cô lập từ phần không xà phòng hóa của cao eter dầu hỏa

của lá khô cây Ké Đầu Ngựa cho trắc nghiệm dương tính với thuốc thử

Liebermann — Burchard, Salkowski và Noller đặc trưng cửa triterpen

Sự nghiên cứu triterpen trong lá cây Ké Đầu Ngựa chưa được đề cập

trong tài liệu tham khảo

Các tri(erpen thường hiện diện trong hệ thực vật là triterpen 5 vòng,

được sắp xếp thành 3 nhóm dựa trên 3 chất “chuẩn”:

Sản phẩm 7T được nhận danh là triterpen j - amyrin dựa trên một số

kết quả sau đây:

Triterpen J néng chay 6 196°C (MeOH)

Theo tài liệu [22], - amyrin nóng chay 6 196-197°C (MeOH)

* Sắc ký trên bản mỏng silicagel:

Thực hiện sắc ký trên bản mỏng cùng với điều kiện như B - amyrin, triterpen

T cho 1 vết xanh đậm, Rr = 0,60 ( Ry cla B - amyrin = 0,62)

Bảng 16 So sánh phổ IR của triterpen T véi phổ IR của Ö - amyrin

Phổ !H - NMR của Phổ 'H - NMR của Vị trí của proton trên

3,20 (m) 3,23 (m) H-3

5,10 (t) 5,18 (t) H- 12

% Phổ 11C - NMR và phổ DEPT:

Tài liệu tham khảo không có để cập đến pho °C - NMR và phổ

DEPT của B- amyrin

Với kỹ thuật DEPT, nhóm - CH — va — CH; céng hudng dưới dang

mũi nằm ở phía trên đường nền cửa phổ, trong khi nhóm — CH) ~ đưới dang

mũi nằm ở phía dưới đường nền cửa phổ Các loại carbon tứ cấp - C — không xuất hiện trong phổ DEPT