P3 Kết quả thu nhận Ezym Papain để ứng dụng vào phả ứng thủy phân

P3 Kết quả thu nhận Ezym Papain để ứng dụng vào phả ứng thủy phân

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT LƯỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già xanh, quả gần chín) ở trên cùng một loài và cùng một phương pháp làm khô Kết quả được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau

quả (g)

Khối lượng nhựa lấy (g)

Tỉ lệ nhựa thô trên quả (%)

Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26 Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18 Nhận xét: lượng papain thô thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non

và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao Qua kết quả này, chúng tôi nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thô là khi quả đu đủ được 50 – 100 ngày tuổi

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƯƠI

Nhựa tươi được làm khô ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC bằng các phương pháp khác nhau Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ

Sấy nóng, có quạt gió 24 giờ Vón cục, vàng nhạt

Đông khô chân không 8 giờ Vẩy mỏng, óng ánh và trắng sáng

Nhận xét:

Chất lượng papain thô thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm chất lượng càng kém

Tuy có nhiều phương pháp khác nhau để làm khô nhựa tươi nhưng phương pháp đông khô chân không là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất lượng nhựa Do đó, toàn bộ nhựa tươi được đông khô chân không để loại nước và nhựa sau đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tôi tiến hành đông khô trong 8 giờ và thu được 5 gam chế phẩm đông khô

3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ

Nhựa tươi sau khi đã đông khô chân không, chúng tôi tiến hành sơ chế bằng dung môi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất Sản phẩm sau quá trình sơ chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein Kết quả chạy điện di của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a:

1 – thang protein chuẩn

2 – nhựa đu đủ non đông khô sơ chế bằng etanol Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung môi còn lẫn khá nhiều protein tạp, do

đó chúng tôi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch protein Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của nhựa đu đủ non không có xuất hiện enzyme papain do đó chúng tôi tiến hành lấy nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành trong giai đoạn trưởng thành của trái

Tinh chế:

Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đông khô theo phương pháp đã trình bày trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khô ban đầu chúng tôi thu được 1g papain Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b:

Hình 3.1 b Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông khô

1- Thang protein chuẩn 2- Chế phẩm Merck

3 - papain

3.4 PHƯƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN

Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 750nm của các ống nghiệm có nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1)

Bảng 3.3 Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm

Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD

(AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin

Cách tính

Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein Từ đó suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml)

n x

M  *0.001* (mg/g) với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml)

Lượng tyrosin tương ứng (M) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Độ hấp thu quang OD(AU) 0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688 Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu quang ở bước sóng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y = 0.4454x + 0.016

Đường chuẩn Anson

y = 0.4454x + 0.016

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

Hñ P = Tyrosin*V*L

với

Hđ P: hoạt tính protein (UI)

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml)

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng mẫu enzyme

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ

Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tôi tiến hành khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đó định mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau:

Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x – 0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng là x Sau đó, áp dụng công thức

m

n x

M  *0.001* (mg/g)

với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml)

để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g)

Bảng 3.5 Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác nhau

pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh

Các giai đoạn tinh chế

Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.129 184.86 5

3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ

Trong quá trình tinh chế enzyme ngoài việc khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn, chúng tôi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau:

Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung dịch bằng nước cất Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha loãng

và các dung dịch khác như sau

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B Cho vào ống A 5ml dịch lọc

từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2

Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sóng 720nm từ đó dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin

Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau:

Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin Từ giá trị của x ta tính được hoạt tính protease theo công thức:

Hñ P = Tyrosin*V*L(UI)

Hđ P: hoạt tính protein (UI)

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml)

v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng mẫu enzyme

M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

Bảng 3.6 Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế

Tỉ lệ hoạt tính sau mỗi giai đoạn tinh chế (%)

pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh

Các giai đoạn tinh chế

3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN

Nhằm đánh giá tính ổn định của mỗi chế phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát

sự biến đổi hàm lượng protein của mỗi chế phẩm theo thời gian

Cân chính xác 0.10 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn Các chế phẩm này được bảo quản ở 4oC để dùng dần Hút 0,4ml dung dịch protein đã pha ở trên để tiến hành

Bảng 3.7 Hàm lƣợng protein của các chế phẩm theo thời gian

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng protein theo thời gian

Trong đó:

M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô

M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đông khô

M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông khô

M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau khi đông khô

Nhận xét:

Qua biểu đồ trên chúng ta thấy rằng hàm lượng protein của các chế phẩm hầu như không thay đổi nhiều theo thời gian chúng tôi khảo sát Chế phẩm M0 có hàm lượng protein cao nhất còn M1 có hàm lượng protein nhỏ nhất Như vậy phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp có trong mẫu nghiên cứu, còn lại chủ yếu là papain nên có hàm lượng protein nhỏ nhất trong các phương pháp Phương pháp đông khô giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm M0 vì quá trình đông khô giúp cố định mẫu nên có hàm lượng protein cao nhất Còn hai phương pháp còn lại dùng dung môi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein có trong chế phẩm nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các protein khác nên có hàm lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1

3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN

Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát

sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian

Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn Chế phẩm được bảo quản ở 4oC để dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày

Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể hiện trong bảng 3.8:

Bảng 3.8 Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian

Hình 3.7 Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian

Trong đó:

M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô

M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đông khô

M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông khô

M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau khi đông khô

Nhận xét:

Nhựa đu đủ là hỗn hợp các protease có tính thủy phân mạnh, trong đó papain

là một trong những enzyme có hoạt tính mạnh và chiếm hàm lượng cao nhất, thủy phân protein tới oligopeptide Papain ở dạng tự nhiên, nhóm –SH tự do bị bao vây,

có tính ổn định cao hơn papain dạng hoạt động trong dung dịch

Không chỉ là proteza có tính chất đặc hiệu cơ chất rộng, papain còn có khả năng tự thủy phân do một phân tử papain xúc tác cho sự thủy phân một phân tử khác Do trong thời gian tiến hành thí nghiệm, dung dich enzyme chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan như chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố oxy trong không khí

và sự tự thủy phân của papain, nên hoạt tính của các chế phẩm sẽ giảm dần theo thời gian

Theo kết quả ở bảng, hoạt tính của các chế phẩm giảm dần mỗi ngày Sạu 5 ngày chúng tôi khảo sát thì hoạt tính của các chế phẩm giảm đi rất nhiều so với ngày đầu tiên (M0 còn 47.91%, M1: 9.4%, M2: 9.37 %, M3:7.29 %) Chế phẩm M0 giữ hoạt tính tốt hơn là do trong nhựa đu đủ còn có một số chất khác đã góp phần bảo vệ papain Các phương pháp kết tủa thu nhận papain đã loại bỏ một số chất có trong nhựa nên độ bền của những chế phẩm còn lại kém hơn so với M0

Trên hình biểu diễn sự biến động hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian

đã cho chúng ta thấy rằng hoạt tính của chế phẩm M1 có hoạt tính cao hơn hẳn các chế phẩm khác Lý do có thể là do phương pháp tủa muối không có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, phương pháp này chỉ loại đi nhiều proteaza tạp, còn lại phần lớn

là papain Cồn và aceton cũng là một dung môi hữu cơ được sử dụng rộng rãi để kết tủa proteaza nhưng phương pháp này có nhược điểm làm giảm hoat tính proteolytic, nhiều khi dẫn đến mất hoạt tính hoàn toàn

Từ những số liệu thực nghiệm cho ta có thể đánh giá rằng chế phẩm papain được tách bằng muối có hoạt tính cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ và khá bền khi tồn tại ở dạng hoạt động

3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN

3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau từ 7.5 đến 9.0 Xác định hoạt tính theo phương pháp Anson, mẫu được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 720nm Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 (phụ lục 20)

Bảng 3.9 Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH

7.0 0.355 0.087 O.268 72.34 7.5 0.295 0.030 0.265 71.65 8.0 0.232 0.067 0.228 60.80 8.5 0.275 0.064 0.211 56.01 9.0 0.271 0.072 0.200 52.77

Khi tăng dần giá trị pH lên thì đồng thời hoạt tính protein cũng tăng lên sau

đó giảm xuống rất nhanh, đều này chứng tỏ rằng pH đóng một vai trò rất quan trọng cho sự tồn tại của enzyme trong môi trường do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa

của các enzyme và phần nào quyết định dạng tồn tại và hoạt tính của chúng Và khi

pH = 7 – 7.5 thì hoạt tính protein trong nhựa khô đạt giá trị cao nhất so với các giá trị còn lại

3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Cân 0.0224 g nhựa khô hòa tan trong 100ml nước cất Sau đó tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính protein trong nhựa khô theo phương pháp Anson ở các khoảng nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ t = 40OC đến 90oC (với ∆t = 5OC), pH dung

dịch đệm được giữ cố định ở pH = 7.6 Kết quả được trình bày trong bảng 3.10:

Bảng 3.10 Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ

tOC ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml)

0 10

Nguyên nhân có thể là do khi ta tăng nhiệt độ thì các protein trong nhựa khô

sẽ thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của chúng chuyển từ dạng bất hoạt hay ở dạng có hoạt tính kém do quá trình phân hủy hay oxy hóa thành dạng hoạt hóa nên dẫn đến hoạt tính tăng cao, nhưng khi nhiệt độ tăng quá cao thì nó lại chuyển thành dạng bất hoạt có khi bất hoạt hoàn toàn do cấu trúc tâm hoạt động đã bị thay đổi

Qua các kết quả khảo sát trên chúng tôi nhận thấy rằng: hoạt tính của enzyme papain sau các giai đoạn tinh chế giảm dần đồng thời với lượng protein cũng giảm dần Do đó, chúng tôi sử dụng nhựa đu đủ đã đông khô để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng mà không tiến hành tinh chế

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN

Tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở điều kiện nhiệt độ phản ứng là 70OC và pH của phản ứng là 7.0 với các hàm lượng xúc tác khác nhau Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 10ml dung dịch thủy giải từ bình phản ứng, thêm nước sôi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch đem lọc Hút

10ml dịch lọc đem xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen Kết quả được trình bày trong bảng 3.11 – 3.13:

Bảng 3.11: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất

Bảng 3.12: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất

Bảng 3.13: Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất

Sự biến thiên hàm lượng đạm formol ở các hàm lượng xúc tác khác nhau

được biểu diễn qua đồ thị hình 3.10

Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Hàm lượng đạm

formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)

1.1 1.4 1.8 2.0 2.2 2.4 2.5 2.9 3.1 3.4 3.5 3.6 3.6

Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Hàm lượng đạm

formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)

1.9 2.9 3.2 3.5 3.8 4.1 4.2 4.6 4.9 6.1 7.2 8.6 8.6

Thời gian phản ứng 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Hàm lượng đạm

formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)

1.4 2.8 3.5 4.9 6.3 7.0 7.7 8.3 8.4 8.8 9.1 9.2 9.2

Biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng đạm formol theo thời gian phản ứng

Bảng 3.14: Biến thiên hàm lƣợng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau

Nhận xét:

Hàm lượng đạm amin = hàm lượng đạm formol – hàm lượng đạm amoniac

Qua kết quả khảo sát trên, hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân dao động từ 0.06 – 0.07g/l Như vậy hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân rất thấp so với các chỉ tiêu cho phép của nước chấm và xem như không đáng kể Do đó trong các khảo sát về ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme so với cơ chất cũng như các điều

Nồng độ enzyme (%) 0.25 0.50 1.00 Hàm lượng đạm

amoniac trung bình của dịch thủy phân (g/l)

0.06 0.07 0.07

kiện ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân chúng tôi không xét đến hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân

Sau 24 giờ phản ứng, hàm lượng đạm formol đạt tối đa là 9.2 và nếu cứ tiếp tục phản ứng thủy phân thì hàm lượng đạm formol không tăng lên nữa điều này chứng tỏ phản ứng đã kết thúc Do đó chúng tôi đã ngưng tất cả các phản ứng khảo

Hàm lượng protein trong đậu phộng (bao gồm cả protein tan và không tan) được xác định thông qua hàm lượng nitơ tổng xác định bằng phương pháp Kjeldalh Kết quả thu được như sau:

V = 17.5 (ml)

P (hàm lượng protein ban đầu) = hàm lượng Nitơ tổng * 5.91

= 17.5*5.91*1.4 = 145.4 (mg/g) Hàm lượng protein trong 5g mẫu cho phản ứng

Mđậu phộng = 145.4*5 = 725.2 (mg/g) Hàm lượng protein tan có trong nhựa đu đủ đông khô được xác định theo phương pháp Lowry là:

M = ((0.4545 + 0.0004)/0.0007) = 649.85 (mg/g)

Hàm lượng protein tan có trong mẫu đậu phộng được xác định theo phương pháp Lowry là:

M = ((0.2525 + 0.0004)/0.0007) = 361.25 (mg/g) Chúng tôi đã tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu

3.12.1 Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so với cơ chất theo thời gian

Ở hàm lượng xúc tác là 0.25%, phản ứng được thực hiện ở 3 giá trị pH khác nhau là 6, 7, 8 Tương ứng với mỗi giá trị pH, tiến hành khảo sát 3 giá trị nhiệt độ là

60OC, 70OC, 80OC Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức thành 100ml bằng nước sôi để ngừng phản ứng thủy phân Rút 0.4ml dung dịch phản ứng đã pha loãng để xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo công thức như sau:

H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%)

G: hàm lượng protein tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo phương pháp Lowry

P: hàm lượng protein ban đầu (tan và không tan) trong bánh dầu đậu phộng xác định theo phương pháp Kjeldahl

Tại pH 6.0 chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.15 – 3.17

Bảng 3.15 Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60 O

C và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%

Thời gian thủy phân (giờ)

Mật độ quang 750nm (AU)

Hàm lượng protein (mg/g)

Hiệu suất thủy phân (%)

Mật độ quang 750nm (AU)

Hàm lượng protein (mg/g)

Hiệu suất thủy phân (%)

Bảng 3.17 Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80 O

C và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%

Thời gian thủy phân (giờ)

Mật độ quang 750nm (AU)

Lượng protein (mg/g)

Hiệu suất thủy phân (%)

Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng

Hình 3.11 Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%

Tại pH 7.0 chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.18 - 3.20

Bảng 3.18 Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60 O C và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%

Thời gian thủy phân (giờ)

Mật độ quang 750nm (AU)

Lượng protein (mg/g)

Hiệu suất thủy phân (%)

Mật độ quang 750nm (AU)

Lượng protein (mg/g)

Hiệu suất thủy phân (%)

Bảng 3.20 Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80 O

C và hàm lƣợng xúc tác là 0.25%

Thời gian thủy phân (giờ)

Mật độ quang750nm (AU)

Lượng protein (mg/g)

Hiệu suất thủy phân (%)

Hiệu suất phản ứng ở 80OC thường thấp hơn so với 60OC Điều này có thể được giải thích do nhiệt độ tăng cao làm bất hoạt tâm hoạt động của enzyme