P4 thực nghiệm tìm hiểu thành phần hóa học cây Bạch đầu ông

P4 thực nghiệm tìm hiểu thành phần hóa học cây Bạch đầu ông

à

pA

THỰC NGHTEi«

Luan án thac sy Khoa bọc Tióa họe Nguyễn Thị Hồng Thủy

Trước khi tiến hành ly trích, cô lập và xác định các hợp chất có trong cây Bạch đầu ông, chúng tôi thực hiện các bước sau đây:

Ly trích mẫu cây để điều chế cao thô

Chuẩn bị cột sắc ký

Ly trích mẫu cây: Dung môi được sử dụng là etanol 95%, cloroform, eter

đầu hỏa (60 ~ 90°C) Chúng tôi tiến hành khảo sát theo sơ đồ 2

Sắc ký cột trên cao eter dầu hóa và cao cloroform trích theo sơ đồ 4

Thuốc thử : Ngoài một số thuốc thứ phục vụ cho phần khảo sát định tính

ở mục 3, chúng tôi còn sử dụng thudc thi hién hinh 1a hoi 1, H.SO, 10%, acid phosphomolipdic 10% trong etanol

Cột sắc ký

Sử dụng sắc ký cột khô nhanh, cột là một phểu lọc thủy tỉnh xốp được

gắn vào hệ thống hút chân không Cho từ từ silica gel (60H loại dùng cho sắc ký

lớp mồng, Merk) vào cột nén silica gel dưới áp suất kém để giữ cho cột cứng đều không bị gãy Khi lượng sHica gel vừa đủ, bão hòa cội bằng eter đầu hóa

(60 ~ 90°C) trong một giờ, sau đó trải đều lớp cao nạp cột lên trên

Thiết bị và dụng cụ:

Máy cô quay RE HH Rotavapor kèm bếp đun cách thủy Buchi 461 Water Bath

Bếp đun cách thủy LW 8 Water Bath

Soxhlet

Luan én thac sy Khoa hoe Héa hoe Nguyễn Thị Hồng Thủy

iii

1 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ TRONG LÁ VÀ THÂN CÂY CO

BẠCH ĐẦU ÔNG

1.1 Điều chế cao etanol, cao cloroform, cao eter dau hỏa 60 — 90° của lá

và thân cây Bạch đầu ông

Nguyên liệu tươi được trích với etanol Lọc, cô cạn dung môi trên máy cô

quay ở 40°C, tiếp tục đuổi dung môi trên bếp cách thủy, rồi đưa vào bình hút

chân không, thu được cao etanol Trộn cao etanol với bột alumin, tận trích bằng

eter dầu hỏa 60 - 90° trong soxhlet, phần dịch trích đem cô cạn thu được cao

eter dầu hỏa, phần bã tiếp tục trích với cloroform, dịch trích cloroform đem cô

cạn được cao cloroform Cao etanol, cao cloroform, cao eter dầu hỏa của thân

và lá cây Bạch đầu ông lần lượt đem đi định tính

1.2 Định tính sterol và triterpen:

Cân mẫu (cao etanol, cao eter dâu hỏa, cao cloroform) hòa tan trong cloroform (20 ml), loc Lay dịch lọc để trắc nghiệm với các thuốc thử

Liebermann — Burchard, Salkowski va Noller

s* Thuốc th Liebermann — Burchard:

e Anhidric acetic 20 ml

e H,SO, dam dac 1 ml Nếu thấy xuất hiện màu xanh nhạt, lục, hồng, hoặc đỏ là phàn ứng dương

tính

+ Thuốc thử Salkowski:

e H;SO¿ đậm đặc

Nếu thấy xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính

+» Thuốc thử Noller:

e Clorur tioni] 1 ml

e Sn 1 vién

=—==————==———————————

Tranơ 4&

Luan Sn thac sg Khoa hoe tl6a hoe Nguyễn Thị Hồng Thủy

Nếu thấy ngã qua màu vàng, qua cam, qua đỏ thẩm là phản ứng dương tính

1.3 Định tính alcaloid

Ngâm nguyên liệu (cao etanol, cao eter đầu, cao cloroform) (0,1g) trong

dung dịch H;SO¿ 3%, đun nhẹ ở 80°C trong 6 giờ Lọc lấy dịch lọc để thử với

thuốc thử Bouchardat, Mayer, Hager, Bertrand, Dragendorff

% Thuốc thử Bouchardat:

e I, 2,5 (g)

° KI 5 (g)

e Nước cất 10 ml

s%* Thuốc thử Mayer :

e HgCl 6,8¢

° KI 2,5¢

e Nuéc cat 500m!

Cho kết tủa vàng nâu với dịch trích alcaloid

s Thuốc thử Bertrand

e Acid silicotungstic 5g

e Nước cất 100ml

Cho kết tủa trắng đục với dịch chứa alcaloid

% Thuốc thử Hager

e Dung dich acid picric bao hòa trong nước

Cho kết tủa vàng với địch chứa alcaloid

4% Thuốc thử Dragendorff:

@ Dung dich A:

© Bi(NO3)2 0.05g

e Nước cất 40ml

Trane 49

Lusn dn thac sy Khoa hoe toa hoe Nguyễn Thị Hồng Thủy

“^=—=—=Ễ=ễỄỄỄỄỄỄễỄễỄễỄễễ> _—._

® Dung dịch B:

e KI 5g

e Nước cất 40ml

Khi sử dụng trộn đều dung dịch A với dung dịch B Cho trầm hiện màu vàng cam với dịch chứa alcaloid

1.4 Dinh tính tanin:

Nấu sôi 5g mẫu nguyên liệu trong 100 m] nước cất trong 20 phút và 3g cao trong 100ml] nước cất trong 10 phút Lọc, thực hiện các phản ứng trên dịch

lọc với các thuốc thử Stiasny, dung dịch gelatin mặn, dung dịch acetat chì bảo

hoa, dung dich FeCl; 1%

s* Thuốc thử Stiasny

e Dung dich formol 36% 20ml

“* Dung dịch gelatin mặn:

e Dung dich NaCl bao hòa 100g

1.5 Dinh tinh flavon

Flavon duoc x4c định bởi phan ting SHIBATA goi là phản ứng Cianidin cia Wilstatter

Nấu sôi mẫu nguyên liệu trong nước cất khoảng 10 phút, để nguội lọc

Lấy địch lọc làm mẫu thứ Cho mẫu thử vào bai ống nghiệm (1.2m) Ống 1 làm

mẫu đối chứng; ống 2 thêm HCI đậm đặc (5ml), bột Mg kim loại, để yên đến

khi không còn sủi bọt, thêm từ từ alcol isoamil theo thành ống nghiệm ĐÐun

nhẹ, một vòng màu hồng bắt đầu xuất hiện rồi chuyển sang màu đỏ tím, chúng

tỏ có sự hiện diện của flavon

Trane 50

Sun &n thae sy Hhoa hoe HO8 hoc En Thi Héng Thay

1.6 Binh tinh glicosid

Glicosid duge xde dinh bang cdc phản ứng có mầu và phần ứng phát huỳnh quang

Phan ứng có mầu dựa trên phản ứng đặc trưng của phần đường như phần ứng Tollens (AgNO¿/ NH.OH); phần ứng pesez

Phần ứng màu của phần không đường

Phản ứng Bajet; dung dịch acid picric 1% trong alcol 20%, dung dich

NaOH 5% nếu thấy xuất hiện màu hổng thẩm hoặc vàng cam là phản ứng

đương tính

s* Phản ứng thuốc thử Molish:

®_ Thimol xanh 2%1 — 2 giọt

@ HạSO¿ đậm đặc 1 mi

Nếu thấy xuất hiện roàu đồ là phần ứng đương tính

2 CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO ETER ĐẦU HÓA

VÀ CAO CLOROFORM CỦA CÂY BẠCH ĐẦU ÔNG

Các hợp chất hữu cơ ly trích được tờ cây Bạch đầu ông được thực hiện qua các giai đoạn

2.4 Điều chế cao etanol, eter đầu hỏa, cloroform

Phần tươi mỗi bộ phận cây, phơi héo, ngâm với etanol 95° (3 x 10 Hit)

Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, gom chung phần cao etanol của thân, lá, bông,

rễ lại Cao etanol được chia làm hai phần Phần thứ nhất được trộn với alumin

tân trích bằng eter dầu hỏa (60 — 90°C) trong soxhlet, thu hồi dung môi thu

được cao eter dầu bỏa Một phần được hòa vào cloroform (3x150ml), để yên 10

phút, lọc, thu hồi dung môi và làm khô phần cao cloroform trong bình hút Ẩm chân không đến khi trọng lượng không đổi, thu được cao cloroform

Kiểm tra các loại cao vừa điều chế được:

Trano 4

Luan Sn thac sy Khoa hoe tla hoe Nguyễn Thị Hồng Thủy

Sắc ký lớp mỏng phần cao etanol, cao eter dầu hỏa, cao cloroform (sơ đồ

2), trong hệ dung ly cloroform - 3 giọt metanol, phun thuốc thử hiện hình lần

lượt với H;SO¿ đậm đặc, acid phosphomolibdic 10% trong etanol, sấy ở 110C

Chúng tôi nhận thấy phần cao eter dầu hỏa toàn cây có nhiều vệt cho màu rõ

với H;SO¿ đậm đặc hơn là so với cao etanol và cao cloroform ở sơ đồ 2

Phần cao cloroform trích trực tiếp từ cao etanol vẫn cho nhiều vệt cho

màu rõ với H;SOx đậm đặc Vì thế chúng tôi quyết định sắc ký cột cao eter dầu

hỏa và cao cloroform

2.2 Cô lập các hợp chất hữu cơ trên cao eter dầu hóa

Hòa tan cao eter dầu hỏa (8,8g) trong cloroform Thực hiện sắc ký cột

khô nhanh trên phễu lọc xốp có đường kính 8cm, với chất hấp phụ silica gel

Dung môi được sử dụng là: eter dầu hỏa 60 — 90”, benzen, cloroform, metanol, mỗi phân đoạn hứng từng 50ml Dùng sắc ký lớp mỏng với thuốc thứ hiện hình

là HạSO„ đậm đặc và iod để theo dõi quá trình sắc ký

Chúng tôi thu được 9 phân đoạn, đánh số từ 1 đến 9 Trong đó phân đoạn

2, 4 được tiếp tục khảo sát, các phân đoạn còn lại cho nhiều vết nên chúng tôi tạm để lại chưa khảo sát

2.2.1 Cô lập hợp chất Vernopp Tu

Phân đoạn 2 của bảng 8 có kết quả sắc ký lớp mỏng với hệ dung ly benzen : cloroform (1:1), cho một vết tròn rõ và vệt mờ Phân đoạn thu được có dạng bột màu trắng lẫn dầu vàng Rửa trên phểu buchner và kết tinh lai nhiều

lần, thì thu được tỉnh thể hình kim không màu, có trọng lượng 187,5mg, có giá tri Ry = 0,55 trong hệ dung ly benzen : eloroform (1:1), có nhiệt độ nóng chảy là

216 — 217°C, đặt tên là Vernopp Tà

2.2.2 Cô lập hợp chất Vernoterpen Vị và Vernoterpen V;

=—=ễễễễ

Trang 52

a hoe Lu8n &n thac

Phân doan 4 ctia bang 8 thu được từ sắc ký cội bởi hệ dung ly eter dau hỏa : benzen (7:3 và 5:5) Sắc ký lớp mỏng cho ba vệt rõ Sắc ký điều chế với

hệ dung ly benzen : cloroform (3:7) thu được Vernoterpen Vụ (R/=0,1§; dang

bột có lẫn tỉnh thể hình kim Tiếp tục kết tỉnh phân đoạn Vernoterpen V„ trong

dung môi hexan rồi cloroform tách ra hai loại tình thể Kết tỉnh lại hai loại tỉnh thể này nhiều lần trong dung môi metanol, thu được Vernoterpen Vị (dạng bột,

có nhiệt độ nóng chảy 169-169,5 “C ) và Vernoterpen V; (tình thể hình kim không màu có nhiệt độ nóng chảy 138-139 °C)

2.3 Cô lập các hợp chất hữu cơ trên cao cloroform

Hòa tan cao cloroform (23g) trong cloroform Thuc hiện sắc ký cột khô nhanh (tương tự như phần 2.3) chúng tôi thu được 9 phân đoạn, ký hiệu từ A;

đến Áo

2.3.1 Cô lập hợp chất Vernonia Q¡ và Vernonla Q¿

Phân đoạn A¿ của bảng 9 được kết tỉnh phân đoạn trong n - heplan lạnh

va gan lọc nhiều lần rồi kết tình lại trong metanol, kết hợp với sắc ký lớp mỏng EN

cuối cùng thu được hai chất đặt tên là Vernonia Q; va Vernonia Q;›

2.3.2 Cô lap hop chat Vernonia Qs

Phan doan A; bang 9 được rữa trên phểu buchner bằng dung mdi aceton

thu được chất rắn màu trắng ngà, đem sắc ký điều chế trong hệ dung ly benzen

- eloroform (7:2), thì được chất rấn dạng bột mầu trắng sắc ký lớp mỏng có Rr = 0,57 trong hệ dụng ly cloroform, dat tén 1a Vernonia Q;

Trane 53