p4 Thực nghiệm về thành phần hóa học của cây lô hội

p4 Thực nghiệm về thành phần hóa học của cây lô hội

UGRIEM

Nat rt Dinh,

Phan Th NyMợm- -

ức Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, Ho Hanh Tdi (Liliacae)

5.1 NGUYEN LIEU, HOA CHAT VA THIET BI

5.1.1 NGUYEN LIEU

Mẫu cây Lô Hội nghiên cứu là loại cây trồng tập trung ở huyện Tân Uyên, tỉnh

Bình Dương, thu hái cây vào khoảng 8 — 10 tháng tuổi Nhận danh cây có tên khoa

học là Aloe Barbadensis Miller, var Chinensis, họ Hành Tỏi, Liliacae bởi PGS Lê Công Kiệt, Bộ Môn Thực Vật, Khoa Sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh

s* Mẫu nguyên liệu khô: lá Lô Hội tươi được tách khỏi thân, rửa sạch, cắt bỏ phần bị dập và có sâu Mẫu lá tươi được chia thành 2 phần: thịt lá và vỏ lá

Chat dich latex mau vang được góp chung với phần vỏ Phơi khô phần thịt lá

và vỏ lá dưới ánh nắng mặt trời (khoảng 3-4 tần); sấy ở 60°C Xay nhuyễn

để thu được bột nguyên liệu khô

s* Mẫu nguyên liệu tươi: chuẩn bị như mẫu khô nhưng không phơi nắng và sấy 5.1.2 HÓA CHẤT

s* Hóa chất dùng trong quá trình chiết xuất: eter dầu hỏa (60-90°C), alcol etil

95%, acetat etil, cloroform, benzen, va alcol n-butil

“> Hoa chat dùng trong quá trình sắc kí cột: silicagen 60 (Merck 70 — 230 mesh),

benzen, cloroform va alcol metil

“+ H6a chat dùng trong quá trình sắc kí bản mỏng: bản mồng silicagel loại TUC

phastic roll 0,2mm-silicagel 60 Fs¿, cloroform, alcol metil, acetat etil, acid

sulphuric, va KOH

+ Hóa chất dùng trong quá trình thủy phân oxi hóa antraglicosid: clorua sắt tam

toluen, EtOH

“ spy , ca 43], [50]

Tinh che va x lý các hóa chất trước khi làm thí nghiệm 491, |

+ Eter dầu hỏa (60-90°C): sử dụng phần chưng cất phẩm ở phân đoạn 60-90°C,

s% Benzen: làm khan sơ bộ bằng CaCl;; sau đó lọc đề loai CaCl Chung cat

phân đoạn, lấy phân đoạn ở 80-81°C Ngâm dung môi với sợi Na

lượng alcol, lắc cloroform với lượng nước bằng 1⁄2 lượng cloroform (thực hiện khoảng 5-6 lần) Dùng bình lóng tách bỏ phần nước Làm khan dung môi với CaCl khan; dé yén 24 giờ Lọc, chưng cất phạn đoạn Lấy sản phẩm ở phân đoan 61°C Bảo quản dung môi tinh chế trong bóng tối

s Chưng cất phân đoạn các dung moi: alco! metil (64-65°C), alcol etil (78°C),

Silicagen dùng cho sắc ký cột được say 2 g10 ở 150°C để tăng độ hoạt hóa,

sau đó ngâm trong benzen và để qua đêm để dung môi thấm đều trên các hạt

silicagen

U °

Hồ Tấn Dinh

Phân Thực Nghiệ,

ee Nghiém Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, He Hanh Tdi (Liliacae)

5.1.3 THIẾT BỊ

Dụng cụ dùng để ly trích là thiết bị Soxhlet loai 1lit va ait; binh thiy tinh 20

lit va 5 lit

Dụng cụ dùng để thu hỏi dung môi:đưới áp suất thấp là máy cô quay hiệu BUCHI 461

Thiết bị dùng thăng hoa ấp suất thấp là tủ sấy chân không VH231X, Texas

Instruments

Cột sắc kí có đường kính 1,5cm

Dụng cụ dùng để đo nhiệt độ nóng chảy là khối Maquenne

s* Phổ khối lượng được thực hiện trên máy 598§9B MS của phòng Khối Phổ,

Viện Hóa, Nghĩa Đô, Từ Liêm, Hà Nội

s* Phân tích nguyên tố được thực hiện trên máy phân tích nguyên tố tự động của

Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm, số 2 Nguyễn Văn Thủ, Quận

1, thành phố Hồ Chí Minh

%* Phổ hổng ngoại được thực hiện trên máy quang phổ hồng ngoại IR-470

SHIMADZU của khoa Hóa trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ

Chi Minh va BRUKER-IFS48 * CARLO ERBA-GC6130 cia Trung Tam Dich

Vu Phan Tich va Thi Nghiém

* Phổ tử ngoại được thực hiện trên máy quang phổ tử ngoại KONTRON

INSTRUMENTS UVIKON 922 của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ

hạt nhân 200 MHz hiệu BRUKER-AC2000 của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm

* Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C_NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân 50 MHz hiệu BRUKER-AC2000 của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích

và Thí Nghiệm

5.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU

CO TRONG THIT LA, VO LA VA RE CAY LO HOI

5.2.1 ĐIỀU CHE CAO ETER DAU HOA, CAO BENZEN,CAO CLOROFORM VA CAO

Nguyên liệu thô (thịt lá, vó lá và rễ) được tận trích với các dung môi eter dầu hỏa,

benzen, cloroformvà alcol metil, alcol etil (mdi loai dung môi 2 lí) trong soxhlet Lọc, cô cạn dung môi ở 40°C thu được các loại cao Cho các loại cao này vào bình

hút ẩm chân không đến khi trọng lượng không thay đổi, thu được các cao: cao eter dầu hỏa, cao benzZen, cao cloroform, cao alco! metil va alcol etil

Khối lượng các mẫu như sau:

Phân Thực NỀHER= la Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, Ho Hanh Tdi (Liliacae}

BO phan cay Dang mau Khối lượng ()

5.2.2 ĐỊNH TÍNH

5.2.2.1 Sterol

5.2.2.1.1 Điều chế dung dịch thủ:

+» Hòa tan mẫu khô (1ø) trong cloroform (20ml), lọc

+ Hòa tan mẫu cao (0,1g) trong cloroform (30m1), lọc

$.2.2.1.2 Thuốc thử

(a) Thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARĐ:

+ Anhidrid acetic 20ml

Phần ứng dương tính khi xuất biện mầu xanh nhạt, lục, bỗng hoặc đỏ

(h) Thuốc thử SALKOWSKI

+ H;SO¿; đậm đặc

18

Phân Thực Nghin”

ee Sake Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, Ho Hanh Tdi (Liliacae) Phần ứng dương tính khi xuất hiện màu đồ

5.2.2.2 Alcaloid

5.2.2.2.1 Điều chế dung dịch thủ theo 2 phương pháp

Trích mẫu (5g) với dung dich Prollius (eter etil, cloroform, alcol etil 95% va NH.ONH, Ủ lệ 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lắc thường xuyên Lấy lớp

hữu cơ Cô cạn dung môi cho cao Hòa tan cao trong HCI 1% trong HạO ở 80°C,

trong | gid Lay dịch lọc

Hòa tan mẫu (5g) trong dung dich HCI 1%, dun nhe 6 80°C trong 1 gid Loc

5S.2.2.2.7 Thuấc thử

(a) Thuốc thử BOUCHARDAT

ti; 2,58

s* NƯỚC Cất 10ml

Phần ứng dương tính khi xuất hiện kết tìa mầu vàng nâu

(b) Thuốc thử MAYER

* HgCl 6,82

s* Nước cất 500ml

Phần ứng dương tính khi xuấthiện kết tủa màu nâu

(c) Thuốc thử BERTRAND

Acid silicotungstic 5g

Phan ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa màu trắng đục,

(d) Thuốc thử HAGER

“+ Acid picric bão hòa trong nước

Phần ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa mầu vàng

(e) Thuốc thử DRAGENDORFF:

Dung dich A: Bi(NO3)}2 0,85¢

Dung dich B:

+ CH;COOH 10mi

Hé Tan Bink Ludn An Thac S¥

Trang 65

Phdn Thug rối Nee Nghigm Khảo Sát Thành Phân Hóa Hoc Cia La Cay LA H6i,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, He Hanh Tdi (Liliacae}

Phản ứng đương tính khi xuất hiện kết tủa mầu đó

5.2.2.3 Glicosid

Trich mau (Sg) trich vdi alcol etil 60% (20ml) trong 24 gid Loc, ché hóa dịch lọc với dung dịch acetat chì 20% (20ml) Lọc, chế hóa dịch lọc với dụng dich Na,SO,

bão hòa (10ml) Lọc, cô cạn dung dịch ở 40°C, thu được cao Hòa tan cao này trong alcol etil 95% và lọc

Š.2.3.3.2 Thuốc thử

(a) Thuốc thử MOLISH:

s* Thimol xanh 1-2 giọt

s%H›;SO¿ đâm đặc tml,

Phản ứng đương tính khi xuất biện màu đó

(b) Thuốc thử BALIET

“* Acid picric 1% trong alco] etil 95% 20 ral

Phần ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng cam hay mau hồng xẫm

5.2.2.4 Tanin

5.2.2.4 1 Điều chế dung dịch thủ

Nấu mẫu khó (5g) với nước cất (100g) trong 20 phút Lọc

5.2.2.4 2 Thuốc thứ

(a) Thuốc thử STLASNY

“ HCl dam đặc 10m!

Phần ứng đương tính khi xuất hiện kết tủa màu đổ

(b) Thuốc thử gelatin mặn

Phần ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt, để lâu hóa nâu

(c) Dung dich FeCl, 1% trong nude

Phân ứng dương tính khi dung dịch hóa xanh với 2 giọt thuốc thử

Phan Thuc Ngment _ Khdo Sdt Thanh Phan Hoa Hoc Cua Ld Cay Lé Hoi,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, Ho Hanh Tdi (Liliacae)

5.2.2.5 Flavon

5.2.2.5.1 Diéu ché dung dich thit

Nấu mẫu (5g) với nước cất (100ml) trong 30 phút Để nguội, lọc

5.2.2.5.1 Phan ứng kiểm chứng

Phản ứng SHIBATA:

Ông nghiệm kiểm chứng: 2ml dung dịch thử

Ông nghiệm phản ứng: 2mi dung dịch thử, thêm HCI đậm đặc (5ml) và bột

Mg Để yên đến lúc hết sủi bọt, thêm từ từ alcol iso-amil theo thành ống

nghiệm Đun nóng nhẹ

Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng màu hồng chuyển sang màu đỏ tím

5.2.2.6 Saponin

Đun sôi lg bột nguyên liệu trong 100ml nước cất trong 30 phút Lọc, để nguội,

thêm nước cất vào cho đủ 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao lốcm, đường

kính l6mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, , 10ml nước sắt Thêm nước

cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10ml Lắc mỗi ống theo chiều dọc của ống trong

15 giây Để yên 15 phút rồi đo chiều cao các cột bọt Nếu chiều cao cột bọt trong

tất cả các ống nghiệm dưới Icm, chỉ số bọt dưới 100, nghĩa là không có saponin Chi s6 bot CBS = 10 * (d/c)

d: chiéu cao cét bot (cm)

c: lượng mẫu trong 6ng nghiém (g)

5.2.2.7 Định tính lacton bất bão hòa

5.2.2.7.1 Thuốc thử LEGAL

s* Hòa tan mẫu trong 2-3 giọt piridin, thêm Ì giot nitroprusiat natrI 0,5% mới

pha, rồi cho từng giọt NaOH 2N

Phần ứng dương tính khi xuất hiện màu hồng

5.2.2.7.2 Thuốc thử KEDDE

+ Dung dịch A: acid 3,5-dinirobenzoid 2 % trong alcol euil

s* Dung dịch B: KOH 5% trong nước

Phần ứng dương tính khi xuất hiện màu hồng

5.2.2.7.3 Thuốc thử BALJET

¢ Acid picric 1% trong alco] etil 20%

s* NaOH 5%

Hé Tan Dinh,

Phân Thực mee Nien Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội,

Aloe Barbadensir MÍ., vạr, Chinensb, Họ Hành Tỏi (LHiacae) Phan ứng đương tính khi xuất hiện mầu vàng cam hoặc mầu hồng xâm

3.2.2.8 Định tính anfragninon

| Phang tng BORNTRAEGER

Hòa tan vài mg chất cần xác định trong Í mi dung dich KOH 5% Dun néag 10

phút, Để nguội Acid hóa dung dich và chiết với benzen Tách lớp benzen cho vào

một ống nghiệm khác, rồi thêm vào đó 1 mỉ dung dịch KOH 5% hoặc NH,OH 10% Nếu lớp benzen mất màu và lớp nước kiểm có mầu đồ tía là phần ứng dương tính 5.2.2.9 Định tinh antraglicosid

Phan ứng BORNTRAEGER ~ antron

Thực hiện phần ứng BORNTRAEGER, nếu lớp kiểm vẫn giữ màu vàng thì thêm vào 2 giọt dụng dịch hidrogen peroxid 6%, lớp kiểm sé cé mau dé, phan ứng dưỡng tính

5.3 KHẢO SÁT ANTRAGLICOSID TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP TỪ LÁ TƯƠI CÂY LÔ HỘI

5.3.1 XỬ LÝ MẪU DÙNG CHO NGHIÊN CUU

Mẫu nguyên liệu tươi: lá Lô Hội tươi được tách khỏi thân, rửa sạch, cất bổ phan bi đập và có sâu Gọi vỏ theo hình mô tả cấu trúc lá Lô Hội (hình 4) Mẫu lá tươi

được chia thành 2 phần: thịt lá và vỏ lá Chất dịch latex mầu vàng được góp chung

với phần vỏ Xay nhuyễn mỗi phần thu được dịch thịt lá và dịch vỏ lá tưới

5.3.2 LY TRÍCH, TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP ANTRAGLICOSID

5.3.2.1 Phương pháp Calciam của E, J HAY

Phương pháp sử dụng nguyên liệu lá tươi do EJ HAY đề nghị năm 1956

Lá tươi (20 kỹ được rửa sạch, gọt vớ, chỉ lấy phần latex mầu vàng đem cô cạn thu được chất nhựa mầu nâu gọi là Aloes (9,2 g; ~0,046%) Sau đó đem hòa tan và đun sôi hiên tục trong 200ml dụng dịch Ca(OH); bão hòa trong NHẠOH cho đến khi thấy

xuất hiện kết tủa thì ngưng Để nguội Lọc, cho kết tửa vào 20 ml dung dich HCl đậm đặc Để yên 2 giờ Lọc và sấy khô kết tủa ở 50°C (3,6 g; ~0,018%) Kết tĩnh tại 7 lần trong nước và 3 lần trong alcol metil thu dude tinh thể màu vàng chanh,

có nhiệt độ nóng chay 148°C (1 62, ~0,008% } Tinh thé dude dat tén ia X)

Trong quá trình ly trích và tách chiết, chúng tôi đã cải tiến chỉ tiết

của phương pháp

như sau và đã thu được kết quả tốt hơn

Hỗ Tấn Đính

Phan Thuc NER

Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội, Aloe Barbadensis M., var Chinensis, Họ Hành Tỏi (Liiacae)

Lá tươi (20 k0 được rửa sạch, gọt lấy vỏ và phần latex màu vàng thành một chất

dịch, đem xay nhuyễn Trích chất dịch với nước nóng ở 80-90°C, lọc lấy phần nước

Phần dịch nước sau lọc được tiếp tục đun nóng ở 80-90°C, thêm 200ml dung dich

Ca(OH)› bão hòa trong NHẠOH, 30 phút Để nguội Thêm từ từ dung dịch NH,OH

23 cho đến khi dung dịch hóa đặc (pH=9,5-10), Lọc lấy kết tủa rồi cho vào trong

200 ml dung dịch HCI 30% Để yên 24 giờ ở 4-10°C Lọc kết tủa màu vàng xẫm và

sây khô ở 50°C (14,1 g; ~0,07%) Kết tỉnh lại 7 lần trong nước và 3 lần trong alcol

metil thu được tỉnh thể màu vàng chanh, nhiệt độ nóng chảy 148°C (7,8 g; ~0,04%)

Tinh thể được đặt tên là Xị,

5.3.2.3 Phương pháp Barium

Lặp lại phương pháp Calcium cải tiến nhưng thay thế Calcium bằng Barium (dùng

dung địch Ba(OH); bão hòa trong NH,OH) Lượng tỉnh thể vàng xẫm thô thu được

là 30,6g (~0,15% trên lá tươi); và 21,1g (~0,11% trên lá tươi) tinh thể X2 tỉnh khiết

màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy là 148°C

5.3.2.4 Tác dụng hấp phụ của than hoạt tính

Cho 2g than hoạt tính vào 100ml dịch thịt lá (tỉ lệ 1:50) bị nhiễm dịch latex màu

vàng, đun nóng 15 phút ở 50-60°C Lọc lấy phần dịch nước đem định tính

antraglicosid và antraquinon Phản ứng Borntraeger cho kết quả âm tính Như vậy,

than hoạt tính hấp phụ tốt antraglicosid và antraquinon nên có thể dùng để loại

những chất này (nếu bị nhiễm) trong dịch thịt lá Lô Hội Tính chất này cũng lặp lại

trên dịch của nguyên lá tươi, nhưng với tỉ lệ (than : dịch nước) = (1 : 5)

5.3.3 PHAN UNG THUY PHAN OXID HOA ANTRAGLICOSID X2

Lấy 10g tinh thể X; tỉnh khiết hòa tan trong dung dịch FeCl; (50g) trong nước

(150ml) Bun hoàn lưu ở nhiệt độ 115°C trong I5 phút Sau đó tăng nhiệt độ đến

130°C trong 6 giờ Để nguội Lọc lấy kết tủa, sấy khô ở 50°C thu hỗn hợp sản

phẩm Trích hỗn hợp sản phẩm với toluen (500m]) trong Soxhlet, trong 12 giờ Cô

cạn dung môi ở 40°C cho chất bột màu nâu đỏ (5,72g), có nhiệt độ nóng chảy

Tc=215°C Kết tính lại 2 lần trong EtOH 95% thu được tình thể màu cam đồ (4,55g; hiệu suất phan tng ~ 70%), co nhiệt độ nóng chảy Tc=222°C Thăng hoa ở nhiệt

độ 160°C, áp suất thấp (0,5mmHg) thu được tỉnh thể X¿ màu cam (1,87g; hiệu suất

cô lập~40%), nhiệt độ nóng chay Tc= 224°C

ỗ

Phân Thực Nghĩa

He Nghigm Khảo Sải Thành Phần Hóa Học Của Lá Cây Lô Hội,

Aloe Barbadensis M., var Chinensis, Ho Hanh Tdi (Liliacae) 5.4 KHAO SAT DAN XUAT ANTRAQUINON LY TRICH, TA CH CHIET VA

CO LAP TU LA TƯƠI CÂY LÔ HỘI

5.4.1 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DẪN XUẤT ANTRAQUINON THO

Điều chế cao alcol n-butil: v6 lá cây tươi (20k) được cất nhỏ, xay nhuyễn và vất

kiệt cho bã và dịch nước Tận trích phần bã với alcol eul 95% ở nhiệt độ phòng

trong bảy ngày cho dich trich alcol etil 1, Cô can phan địch nước ở 40°C, dưới áp

suất thập (loại nước có trong vỏ cây) cho cao Tận trích cao với alcol eil 95% ở nhiệt độ phòng trong bảy ngày cho dịch alcol eul 2 Gép chung dịch trích alcol edil

1 với dịch trích alcol edl 2 cho dịch trích alcol eũl của phần vô lá Cô cạn dung môi

ở 40°C, dưới áp suất thấp cho cao alcol etil Hòa tan cao EBtOH trong nước cất Dịch

nước được rửa nhiều lần với eter eul cho đến khi dịch eter không còn mầu vàng xâm Dịch eter eul được đem cô cạn dụng môi cho cao cter ebl, Cao eter elil được trích với alcol n-butl (0,5 HH Dịch nước sau đó được tận trích với alcol n-buul (319 Gộp chung 2 phần dịch alcol m-buHl của cao eter ebl và dịch nước Sau đó đem dich alcol n-butil di cé dudi dung mdi 6 40°C, đưới ấp suất thấp sẽ cho cao alcol butil (15,8g)

5.4.2 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP

Cao alcol ø-buul được đem tiến hành sắc ký cột siHcagel, với hệ dung ly benzen,

cloroform, alcol metil và hỗn hợp của chúng Theo dõi tiến trình sắc ký cột silicagel (trên 18g cao alcol n-butil) bằng sắc ký bản mồng silicagel, với hệ dung ly

là benzen : cloroform : alcol menl = l1 :2: 1, và thuốc thử KOH 10% trong alcol

etil 95% làm hiện vết trên bản móng

Tinh chế các hợp chất X; và X; bằng phương pháp kết tính phân đoạn; với X› trong

cloroform va X; trong toluen

5.5, THU NGHIEM HOAT TINH KHANG KHUAN CUA ANTRAGLICOSID

CÔ LẬP TỪ LÁ TƯƠI CẢ Y LÔ HỘI

5.5.1 ĐỊNH TÍNH

Sứ dụng phương pháp khuyếch tần cải tiến,

5.5.1.1 Vi khuẩn

Thử nghiệm trên 4 vi khuẩn tiêu biểu:

II Streptococcus faecalis ATCC 29212 Gram (+)

2 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Gram (+) khó điển trị

` a

3 Escherichia coli ATCC 25922 Gram (-)

ra - | Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Gram (-) khó điều trị