P3 thực nghiệm về một số loại quả thuộc họ Ruttaceae

P3 thực nghiệm về một số loại quả thuộc họ Ruttaceae

PHẦN IV

Thực nghiệm

4.1 THIẾT BI, NGUYÊN LIÊU HOÁ CHẤT

4.1.1 THIẾT BỊ

Cân điện tử SARTORIUS GP 1503P và METTLER BD 202

Bộ chưng cất CLEVENGER

Lồ vi sóng gia dụng TOSHIBA ER-657VL cải tiến

Máy đuổi dung môi HEIDOLPH VV2000

Khúc xạ kế WYA-S ABBE

Triển quang ké WZZ-2 AUTOMATIC POLARIMETER

May héng ngoai SHIMADZU IR-470

Máy sắc ký khí ghép khối phổ HP 6890 SERIES II

- Cột mao quản Model Nọ HP 19091S-433 HP 5MS 5% phenilmetilsiloxan 30,0m x 250um x 0,25um

- Split ratio: 40 : 1

- Nhiệt độ Inlets 250°C

- Khí mang He: áp suất 6,5 pSi; tốc độ dòng: 0,9 ml/phút

- Chương trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu: 50°C, tăng 5°C/phút đến 90°C, giữ

yên 20 phút, tăng 10°C/phút đến 150°C, giữ yên 5 phút, tăng 15°C/phút đến 250°C, giữ yên 3 phút

4.1.2.NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT

- Mẫu cam được thu hái tại: ấp Xóm Cái, xã Tân Triểu, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh

Đồng Nai

- Mẫu chanh: lấy ở ấp 1, xã Phước Vĩnh An, huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí

Minh

- Mẫu bưởi: lấy ở ấp Xóm Cái, xã Tân Triều, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng

Nai

- Dietil eter đã tỉnh chế, Na;SO¿ khan, HCI, KOH, etanol 95%, Phenolptalein

4.2 KHAO SAT TINH DAU VO CAM, CHANH, BUGI

4.2.1 LY TRÍCH TINH DẦU VỎ CAM, CHANH, BƯỞI

Tên khoa học cam, chanh, bưởi đã được định danh tại Bộ môn Thực Vật,

Khoa Sinh, Trường ĐHKH Tự nhiên TP HCM

Nguyên liệu được thu hái khi vừa chín, vỏ quả còn hơi xanh, căng, bóng

Nguyên liệu được sử dụng sau khi hái

Thành phần bách phân các cấu tử trong tinh dầu được xác định bằng phương

Thực nghiệm

4.2.1.1.PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC CỔ BIEN

Nap 200g nguyên liệu và 600ml nước vào bình cầu 2000mil, Ráp hệ thống chưng cất (phụ lục 22) Tiến hành chưng cất tỉnh đầu trong những khoảng thời gian

xác định tầy theo từng thí nghiệm Để nguội, trích lại phần nước chứa tỉnh dầu

trong ống gạn bằng dietil eter Lam khan dung dich dietil eter bằng Na;SO¿ khan

Lọc, thu hồi dụng môi dưới áp suất kém Cân xác định lượng tình đầu ly trích được

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.1.2 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC ĐƯỚI TÁC DỤNG CỦA VI SÓNG

4.2.1.2.1 KHÔNG THÊM NƯỚC VÀO NGUYEN LIEU

Cho 100g nguyên liệu cắt nhỏ vào bình cầu 1000ml tiến hành chưng cất hơi nước nhờ vào lượng nước có sẵn trong nguyên liệu Ráp hệ thống chưng cất có sự

hỗ trợ của vi sóng (phụ lục 23) chiếu xạ mẫu ớ công suất 600W trong các khoảng thời gian xác định Để nguội hệ thống, trích phần nước chứa tình dầu bằng diedl eter Tiếp tục ly trích tính dầu như phần trên Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.1.2.2 CHO NUGC VAO NGUYEN LIEU

Cho 50g nguyên liệu đã cắt nhố và 150ml nước vào binh chung cat 1000ml

Tiến hành các bước tương tự như 4.2.1.2.1 Kết quả ghi trong phần nghiền cứu

4.2.1.3 PHƯƠNG PHÁP VẮT ÉP

Lấy vỏ quả cam, bưởi tươi vắt vào miếng bông, sau đó vất miếng bông để lấy tinh đầu có lẫn nước và tạp chất Lắng, lọc, làm khan để lấy tình dầu,

Riêng vó chanh được ngầm vào nước muối 5% rồi sau đó mới vắt vào miếng bông Đo nguyên liệu vỏ chanh quá mồng, lượng tính dầu thu được rất ít nên khi

tách bỏ phần nước muối, phải dùng đietil eter để long phan tỉnh dầu bị lẫn cặn

Lam khan phan dung dich dietil eter bang Na,SO, khan Loc, đuổi đụng môi ta

được tính dầu

4.22 XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ VẬT LÝ VÀ HOÁ HỌC

4.2.2.1 CHỈ SỐ VẬT LÝ

Trang 56

Thức nghiệm

Tiên hành xác định tỷ trọng, góc quay cực và chỉ số khúc xạ của tỉnh dầu tại

Bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

4.2.2.1.1 TETRONG CUA TINH DAU

Ti trong ctia tính dầu được xác định bằng tỉ số giữa khối lượng tỉnh dầu và khối lượng nước cất có cùng thể tích ở cùng một nhiệt độ Cân trên cân phân tích

trọng lượng bình đo tỉ trọng mạ Cho nước cất 2 lần vào bình đo tỉ trọng cho tới khi đây bình, cân trên cân phân tích xác định mm o Để bình khô, tương tự cho tính dầu vào đến đầy bình, xác định mạp Mỗi thí nghiệm tiến hành 3 lần, tính Ho: fip Kết quả ghi trong phần nghiên cứu,

Tỷ trọng được tính theo công thức sau:

4,2.2.1.2 GOC QUAY CUC

Cho khoảng 10ml tình dầu vào ống đo góc quay cực đài ldm, thực hiện việc

đo khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực trên triển quang kế Thực hiện phép đo 3 lần Kết quả trung bình ghi trong phần nghiên cứu

4.2,2.1,3 CHÍ SỐ KHÚC XẠ

Mỗi lần nhỏ vài giọt tính dầu vỏ cam, chanh, bưởi thu được theo các phương pháp ly trích lên lăng kính của khúc xạ kế, chỉnh máy Ghi nhận nhiệt độ và chỉ số

khúc xạ của các loại tỉnh đầu Thực hiện phép đo 3 lần Kết quá trung bình ghi

trong phần nghiên cứu

4.2.2.2 CHỈ SỐ HÓA HỌC

Chi số acid, savon hóa và chỉ số ester của tính dâu vỏ cam, chanh, bưởi được

xác định theo tiêu chuẩn TCVN 189 -1993

4.2.2.2.1 CHỈ SỐ ACID (IA)

Chuẩn bị chất chí thị mầu phenolptalein 2g/1 trong ctanol 95% Cân khoảng

0,5 + 0,0005g tính dầu vỏ cam, chanh, bưởi vào erlen 125ml, thêm Šml ctanol, nhỏ

“hức nghiệm

dịch KOH 0,1N ti microburet vao erlen cho đến khi dung dịch vừa xuất hiện mầu hồng Thực biện phép đo 3 lần, Ghi nhận thể tích ƒxoz dung dịch KOH dùng để

chuẩn

Chỉ số acid được tính theo công thức sau:

t4 = 361 xV xon Miro

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.2.2.2 CHÍ SỐ SAVON HÓA (5)

Cho khoảng 0,5 + 0,0005g tính dầu cho vào bình cầu 100ml, Thêm vào 20ml

dung dịch KOH 0,1N Đun hoàn lưu trong 2 giờ, để nguội, thêm 1 giọt chỉ thị phenoiptalein, chuẩn độ ngược bằng dung dịch HCI 0,1N Nhỏ từ từ dung dịch HCI

0,1N tŸ buret vào bình cầu cho đến khi dung dịch vừa mất mầu hỗng Thực hiện

phép đo 3 lần Ghi trọng lượng tính dầu mo, Vị mi thể tích dung dịch HCI 0,1N

dùng để chuẩn

— Thực hiện tương tự với mẫu trắng là 0,5+ 0,0005g nước cất, ghi nhận giá trị

ƒ, ml thể tích dung dịch HCI 0,1N dùng để chuẩn

Chỉ số savon hóa được tính theo công thức:

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.2.2.3 CHÍ SỐ ESTER (IE)

Là hiệu số của chỉ số savon hóa và chỉ số acid: ïE = 1S ~ IA

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.3.1,Y TRÍCH LIMONEN KHỎI TINH ĐẦU VÔ QUÁ

Lần lượt lấy 3g tính dầu vỏ cam hòa tan trong cùng một thể tích (15ml) của

các dung dịch etanol 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% Ding binh léng

tách phần limonen không tan trong ctanol, Làm khan nước bằng Na;SO¿, cô quay

ta thu được limonen Kết quả ghi trong phần nghiên cứu,

Lần lượt cho 3g tỉnh dẫu hòa tan vào các thể tích khác nhau của dung dich

etanol 50%

Trang 58

Thực nghiệm:

Làm tương tự như trên để thu được limonen Kết quả ghi trong phần nghiên

cứu

Phần limonen thu được được định danh bằng cách đo các chỉ số vật lý, bằng sắc ký khí ghép khối phổ và bằng các đữ kiện phổ học Kết quả ghi trong phần

nghiên cứu

Phần hỗn hợp các hợp chất chứa oxygen được kiểm tra bằng sắc ký khí ghép khối phổ, kết quả cho thấy trong phần này không chứa limonen (phụ lục15)

4.4 THỨ NGHIÊM TÍNH KHÁNG KHUẨN

Việc thử nghiệm tính kháng khuẩn của tình đầu vỏ cam, chanh, bưởi và hmonen được thực hiện trên 7 chúng vi khuẩn: Đacillus subtli, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Samonella enteritidis, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae Thitc hién tai Khoa Sinh — B6 mén Vi Sinh — Sinh

học Phân tử, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP HCM Thử nghiệm tinh

kháng khuẩn theo phương pháp khoanh giấy

4.4.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chuẩn bị vi khuẩn thứ nghiệm: Các chủng vi khuẩn trên được giữ trong môi trường BHI + 5% gHcerol ở nhiệt độ ~26°C trong các ống eppendorf và được cấy truyền 2 tháng một lần

- Môi trường kháng sinh để: sử dụng môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)

- môi trường tiêu chuẩn cho kháng sinh đô, sản phẩm của hãng BioLife

- Mẫu thử nghiệm là tỉnh dầu vỏ quả cam, chanh, bưởi được giữ ở 4°C trong lọ

có nắp vặn chặt

- Dung cụ: các đĩa giấy có đường kính 6mm được tiệt trùng qua nổi hấp

Autoclave ở 121°C trong 30 phút và sấy khô hoàn toàn, các Petri nhựa có đường kinh 90mm v6 tring, que béng (dé trải vi khuẩn) vô trùng,

4.4.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

4.4.2.1 CHUAN BI VI KHUAN THU NGHIEM

Từ các ống cppendorf giữ chủng, vi khuẩn được cấy truyền ra trên mặt thạch

định đưỡng thường (Nutrient agar) đối với các chủng vi khuẩn $ aureus, E coli,

P aeruginosa, V cholerae, B subtilis, 5 enteritidis va trén mGi trường thạch mầu (Blood agar) đối với chủng vi khuẩn $ pneumoniae Ủ các hộp thạch đã có vi

khuẩn ở nhiệt độ 37C qua đêm

Sau khi khuẩn lạc (vi khuẩn sinh sản tạo thành khóm) xuất hiện, chọn 3-5

Thực nghiệm

chứa 5ml nước muối sinh lý sao cho đạt độ đục 0,5MeF (tương đương với 10

CPU/mÙ hay tương đương với ODaie trong khoảng 0,08 — 0,1

4.4.2.2 CHUAN BI HOP THACH THU NGHIEM

Cân 38g môi trường MHA trong mội lít nước cất, đun cách thủy đến tan hoàn toàn Khử trùng bằng nỗi hấp autoclave ở nhiệt độ 121C trong 30 phút Sau khi để nguội đến 50°C bắt đầu phân phối ra các đĩa Petri vô trùng Trong 1 đĩa Petri có

đến 24ml thạch tương đương với độ đầy 4rmam Các hộp thạch này được ủ qua đêm

ở 37°C để kiểm tra sự vô trùng Loại bố các hộp thạch bị nhiễm

Ding que bông vô trùng nhúng vào huyén dich vi khudn đã chuẩn bị ở trên

rỗi trải đều chúng vi khuẩn thử nghiệm trên mặt thạch của môi trường MHA

Đối với chủng $ pnewmoniae thì môi trường bổ sung thêm 5% máu cừu đã loại fibrin

4.4.2.3 THỰC HIỆN KHÁNG SINH ĐỒ

Sử dụng phương pháp khuyếch tần trên thạch

Dùng kẹp vô khuẩn kẹp đĩa giấy tấm tình dầu đặt lên mặt thạch thử nghiệm Lam tương tự với mẫu trắng là đĩa giấy tẩm nước cất Lật ngược hộp thạch và ú ở

37°C Sau 18 giờ đọc đường kính vòng vô khuẩn là vòng không có ví khuẩn mọc

xung quanh đĩa giấy thử nghiệm Kết quá ghi trong phân nghiên cứu,

4.5 XÁC ĐINH HÌNH DANG CƠ QUAN CHÚA TĨNH DẦU

Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Thực Vật, Khoa Sinh, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

Miẫu vật được sử dụng là vó quả cam, chanh, bưởi

Mẫu vật được cắt lát mỏng, quan sát trạng thái sống dưới kính hiển vi nhằm xác định hình dạng cơ quan chứa tỉnh đầu

Trang 60