P2 Ngiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây sen cạn

P2 Ngiên cứu và kết quả thành phần hóa học của cây sen cạn

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cay Sen can Trang 12

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH

NGHIÊN CỨU

Phương pháp hóa lý xác định cấu trúc hoá học hợp chất:

-Đo điểm nóng chảy trên khối Maquenne

-Phổ hồng ngoại IR được ghi trên máy quang phổ hồng ngoại IR-470 SHIMADU -Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-RMN được ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân

BRUKER AC 200, tần số cộng hưởng 200 MHz của Trung tâm dịch vụ phân tích và

thí nghiệm (DVPT & TN) thành phố Hỗ Chí Minh và được ghi trên máy cộng hưởng

từ hạt nhân BRUKER 500 MH¿ của Viện KHoa Học-Công Nghệ Hà Nội

-Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'ÍC-RMN kết hợp kỹ thuật DEPT RMN được ghi

trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC 200, tần số cộng hưởng 50 MH¿ của Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm (DVPT & TN) thành phố Hỗ Chí Minh

và được ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER 125 MHz của Viện Khoa Học-Công Nghệ Hà Nội

-Phố GC-MS được ghi ở Trung tâm dịch vụ phân tích và Thí nghiệm TPHCM

# Việc khảo sát trên cây Sen Cạn được thực hiện với các công việc như sau:

- Điều chế các loại cao alcol, cao cloroform để sắc ký cột

- Sắc ký cột khô nhanh với silica gel 60H loại dùng cho bản mông Merck

- Sắc ký bản mồng loại 25DC ~ Alufolien 20 x 20 cm, Kieselgel 60 Fas4, Merck

- Sắc ký cột silica gel trên cao cloroform: phân lập các cấu tử hữu cơ

- Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp hóa

lý hiện đại như: IR, 'H-RMN, !C-RMN, DEPT-RMN, MS

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học Brine Shrimp trên các cao và các hợp chất cô lập được

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: TRAN HONG DUNG

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 13

2.1- KHẢO SÁT NGUYÊN LIÊU

2.1.1 Thu bái và xử lý mẫu

® Cây Sen Cạn được thu hái vào đầu tháng 8 — 2001 tại Viện Sinh Học Đà Lạt

~ tỉnh Lâm Đồng, được nhận danh khoa học là ?ropaeolin majus L thuộc họ Sen

cạn (Tropaeolaceae) bởi Thạc Sỹ Hoàng Việt, bộ môn Thực vật và Sinh môi,

khoa Sinh, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TPHCM

® Cây tươi sau khi thu hái về, được lặt bỏ cây sâu bệnh, lá vàng úa và lá non,

lau sạch Sau đó, thái nhỏ và đem phơi khô ngoài không khí, khi đã khô, đem sấy

ở 80°C trong tủ sấy cho đến khi trọng lượng không đổi và xay nhuyễn

+ Nguyên liện có dạng bột khô

2.1.2 Xác định đô ẩm

® Cân phần thân và phân lá tươi mỗi phân 100g, phơi khô và sấy ở 110°C đến

khi trọng lượng không đổi, cân trọng lượng sau cùng

+ Độ ẩm được tính theo công thức:

(trọng lượng tươi — trọng lượng khô)

V20 011 cu tácd (06114 0041 jive aye cha cay Sen can Trang 14

Sơ đồ 1: Điều chế cao etanol và cao cloroform

Phơi khô, cắt nhuyễn

Say ở 80°C đến trọng lượng không đổi

© của cây Sen cạn Trang 15

2.2- TRICH LY VA CO LAP MOT SO HOP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY SEN CAN

2.2.1 Điều chế các loại cao cloroform và cao alcol của lá

- Lá cây được ngâm trong alcol, sau 24 giờ lọc lấy dung dich cao thu héi dung môi Tiếp tục nhiều lần thu được cao alcol,

- Cao alcol nấy được trích lồng-lổng bằng phương phấp sắc ký cột với

chioroform, tách riêng, làm khan nước và thu hếi dụng mồi thu được cao cloroform

- Quy trình trích cao alcol và cao cloroform được trình bay trong so dé 1

2.2.2 Sắc ký côt silica gel trên cao cloroform

- Sắc ký cột silica gel trên cao cloroform (27g) Sử dụng các dung môi giải ly

cột từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, benzen, cloroform, metanol, hứng mỗi lọ 5Ôml Các lọ cho sắc ký bản móng giống nhau được gom chung thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 2

- Sắc ký cột trên cao cloroform thu được 10 phân đoạn

- Tổng cao thu được qua cột là: 22,14g: hiệu suất: §2%

- Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bang 2

* Nhân xét

* Phân đoạn 3 của bắng 2 có lượng cao 0,8 gam, là sáp sệt màu vàng Sắc ký lớp

mỏng cho thấy rất nhiều vết trên bản mỏng Chúng tôi thực hiện sắc ký điều chế

nhiều lần và kết tính lại trong cloroform thu được bột có mầu trắng, đặt tên là T2

* Phân đoan 4 có lượng cao 2,13 gam, là dung dịch vàng, có đạng bột Sắc ký lớp

mồng của phân đoạn 4 cho thấy nhiễu vết trên bản mỏng nhưng có một vết rõ và cách xa các vết khác, Lọc lấy phân bột rắn trên phễu lọc, sau đó đuổi bớt dung môi

GVHD: PGS.TS NGUYÊN KIM PHI PHUNG HVCH: TRAN HONG DUNG

Góp phần tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 16

để thu thêm bột rắn Sau khi tách rửa nhiều lần bằng hexan lạnh để loại bô bớt phần dung dịch vàng, kết tỉnh nhiều lần trong cloroform thu được bột có màu trắng,

* Phân đoan 6 có lượng cao 1,24 gam, là dung dịch vàng, có rất nhiều vết Sắc ký

bắn mông của phân đoạn 6 cho thấy nhiều vết trên bản mỏng nhưng có hai vết

chính nằm cách xa nhau Sắc ký điều chế chúng tôi thu được tỉnh thể T4 có hình

kim mịn mầu trắng và tỉnh thể T6 có hinh kim màu trắng,

* Phân đoan 8 1A dung dich mau xanh đậm được đặt tên là T5

+ Phân đoạn 9 có lượng cao 2,76 gam, là dung dich xanh lục nhạt, có nhiều vết,

nhưng có một vết rõ Sắc ký điều chế và kết tinh lai thu đựợc bột màu trắng, đặt tên

là T7

-Tóm lại, từ 10 phân đoạn thu được của sắc ký cột trên cao cloroform, chúng tôi

chọn khảo sát trên phần đoạn 3, 4, 5, 6 và 9 Các phân đoạn còn lại cho nhiêu vết

không rõ ràng trên bản mỏng nên chúng tôi tạm để lại chưa khảo sát,

2.3- KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HOC CÁC HỢP CHAT THU ĐƯỢC

2.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất T1

Hợp chất T1 thu được từ phân đoạn 4 của sắc ký cột ở bảng 2, có những đặc điểm sau:

- Dang bot mau trắng, nhiệt độ nóng chấy 83-84°C

- Sắc ký bản mỏng: cho một vệt tròn màu nâu, có R¿ = 0,55 trong hệ dụng ly: chloroform : metanol (8:2) với thuốc thử hiện hình: acid sulphuric đậm đặc (hình 4)

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: TRAN HONG DUNG

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen can Trang 17

Bảng 2: Sắc ký cột silica gel trên cao cloroform (27g) của cây Sen Can

E:B 253-276 3250 Nhiéu vét Dich xanh luc nhat

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn

CAO STAHOL CAG CLOROFORM

Hình 3 : Sắc ký lớp mồng cao etanol và cao cloroform

Với dung môi giải ly cloroform : metanol (9:1)

Trang 18

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHỤNG HVCH: TRAN HONG DUNG

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 19

Gép phan tim hiểu thành phần hóa học của cây Sen cạn Trang 20

- Phố GC-MS (phụ lục 1): cho một mũi duy nhất ở 13,56 phút Thư viện máy cho biết hợp chất có trọng lượng phân tử tương đương như hợp chất dotriacontanol với

độ tương hợp 766-787 Ngoài ra, phổ để có mảnh căn bản với m/⁄z= 291

- Phổ IR KBr, v lem (phụ lục 2): 3300 (O-H); 2895, 2885 (C-H); 1125 (C-O)

- Phổ 'H-REMN (CDCH) (phụ lục 3), Šppm: 3,58 (mũi đa, -CH;-CHOH-CH;>; 1,25 (mũi đa, các nhóm -CH;-); 0,88 (mũi ba, -CH;-CH:)

- Phổ C-RMN (phu lục 4) và DEPT-EBMN (phụ lục 5) (CDCH), ôppm: 71,83

(-CHOR); 37,27 (-CHạ-); 31/70 (-CHạ-); 29,47 (-CH¿); 29,15 (CHạ-); 25,44

(-CH;-), 22,48 (-CHạ-); 13,91 (CH¡:)

* Biên luận cấu tric cla hop chat T1:

- Phé C-RMN kết hợp DEPT-RMN cho thấy có các mỗi ở vùng từ trường cao

từ 71,83 đến 13,91 ppm cho biết đây là hợp chất loại alcol béo Phổ có 1 carbon có

độ dịch chuyển hóa học thấp nhất trong các mũi nói trên ở 71,83 ppm là loại -

CHOH Phổ có 2 carbon có độ dịch chuyển hóa học cao nhất trong các mũi nói trên

ở 13,91 ppm là -CHạ, còn các carbon còn lại déu là loại -CHạ- Vậy đây là hợp chất alcol béo, loại alcol nhị cấp:

Góp phần tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 21

- Trong phổ GC-MS không cho nhìn rõ được mánh ion phân tử của alcol nhất cấp và nhị cấp, tuy nhiên mấy cho biết hợp chất này tương đương với

dotriacontanol Từ hai đữ kiện này để nghị hợp chất là 13-dotriacontanol, với công

* Kiểm tra lai bằng nhổ 1H và 2C.RMN có so sánh với tài liệu tham khảo của

hợp chất 11-triacontanol (C;ofluO) có điểm nắng chảy là SG

Góp phan tim hiểu thành phần hóa học của cây Sen can Trang 22

Bảng 3: So sánh điểm nóng chấy và phổ ”C.RMN của hợp chất T1 với hợp chất 11-triacontanol Si

Kết luận: so sánh điểm nóng chấy, khối phổ, phổ RMN, chúng tôi để nghị hợp chất T1 là 13-dotriacontanol, với cấu trúc như sau:

CHACHA ACH aie CH

OH

13-Dotriacontanol

2.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa hoc cia hop chất T2

Hợp chất T2 thu được từ phân đoạn 3 của bằng 2, có những đặc điểm sau:

- Dạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chây: 79C

- Sắc ký lớp mồng: cho một vệt tròn mâu nâu, có R; = 0,58 trong hệ dung ly:

cloroform : metanol (8:2) với thuốc thử hiện hình acid sulphuric đậm đặc (hình 4)

- Phổ MS (phụ lục 6): Phổ đồ cho thay cdc mili m/z = 406 (M — HO), m/z = 297

- Phé IR KBr ( phy luc 7), v cm !: 3300 (O-H ) ; 2922 (C-H )

- Phé 'H-RMN, CDCH: định lượng (phụ lục 8), ôppm: 3,58 (mũi đa, các profon loại

~ CH, - CHOH— CH, ~ ); 1,63-1,25 (mili đa, các proton loai -CHOH- CH) ~ CH,

—;, và 0,88 (mỗi ba, các proton của 2 nhóm metyl cuối mạch)

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: TRAN HONG DUNG

Góp phần tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 23

- Phố !'C-RMN kết hợp với phổ DEPT 90 và 135 (CDCH), (phụ lục 9 và10): phổ đồ

cho thấy chỉ có các mỗi ở vùng từ trường cao với ð„ mm: 71,73 ( Carbon loại

~ CHOH), 37,48-22,70 (cdc carbon loai - CH, - CHOH- CH, -); 14,13 (các

carbon loại -CHa)

*Biên luận cấu trúc của hợp chất 12:

- Phổ C-RMN kết hợp DEPT-RMN cho thấy có các mũi Ở vùng từ trường

cao từ 71,83 đến 13,91 ppm cho biết đây là hợp chất loại alcol béo Phổ có 1 carbon

có độ dịch chuyển hóa học thấp nhất trong các mỗi nói trên ở 71,83 ppm là loại -

CHOH Phổ có 2 carbon có độ dịch chuyển hóa học cao nhất trong các mũi nói trên

ở 13,91 ppm là -CHạ, còn các carbon còn lại đều là loại -CH;ạ- Vậy đây là hợp chất

alcol béo, loại alcol nhị cấp:

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHUNG HVCH: TRAN HONG DUNG

Góp phân tìm hiểu thành phần hóa học của cây Sen cạn Trang 24

tổ, 7 š vi » 13 + + Ae gh

% _Kiém tra lai bang phé"H va °C-RMN cé so sénh voi tài liệu tham khảo của

hợp chất 11-triacontanol (C2oH,›O) có điểm nóng chảy là 82°C

Bảng 4: So sánh điểm nóng chảy va phé °C-RMN cia hop chất T2 với hợp chat 11-triacontanol 9,

#Kết luận: so sánh điểm nóng chảy, khối phổ, phổ RMN, chúng tôi để nghị hợp

chất T2 là 10-Nonacosanol, với cấu trúc như sau:

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 25

2.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hơp chất T3

Hợp chất T3 thu được từ phân đoạn 5 của sắc ký cột ở bảng 2, có những đặc

điểm sau:

- Dạng bột màu trắng với nhiệt độ néng chdy: 81,5°C

- Sắc ký lớp móng: cho một vệt tròn màu nầu, có R; = 0,48 trong hé dung ly: cloroform : metanol (8:2) với thuốc thử hiện hình acid sulphuric đậm đặc (hình 4)

- Phổ MS (phụ lục 11): cho biết T3 có mũi m/z = 452 (Mỹ'”, phù hợp với công thức phân tử CaoHaoO¿

- Phổ IR: KBr ( phụ lục 12), ò cm”; 3416 (O-H ) ; 2915 (C-H ); 1701 (C=0)

- Phổ 'ÌH-RMN CĐCG (phụ lục 13), ôppm: 2,34 (2H; mũi ba; -CH;-CH;-COOH); 1,63 (2H; moi năm; -CH;-CH;-COORN); 1,25 (mũi đa; các proton -CH;-); 0,88 (4H; mỗi ba; -CH;-CH:)

- Phổ °C-RMN (phụ lục 14): Phổ để cho thấy hợp chất có các carbon với độ dich chuyển hoá học như sau, ôppm: 178,75 (-COOH); 33,88 (-CHạ-; C-2); 31,95 (-CHạ-;

C-3); 29,72 (-CHạ-;, C-4); 29,62 - 22,71 (-CHạ-, C-5 đến C-29) và 14,12 (-CH;; C- 30)

* Biện luận cấu trúc của hợp chất 13:

-Tữ kết quả phổ IR, ˆH—-RMN, ''C-RMN, MS cho thấy hợp chất T2 là một acid béo

dây thắng, không phân nhánh, có 30 carbon.Vì vậy, chúng tôi để nghị hợp chất T3

là acid triacontanoic, với công thức hóa học như sau:

Góp phân tìm hiểu thành phân hóa học của cây Sen cạn Trang 26

2.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của hơp chất T4

*+ Hợp chất T4 thu được từ phân đoạn 6 của sắc ký cột ở bảng 2, có những đặc điểm sau:

- Đạng bột màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 82°C

- Sắc ký bản mỏng: cho một vệt tròn màu nâu, có R¿; = 0,43 trong hệ dung ly:

cloroform : mefanol (8:2) với thuốc thử hiện hình acid sulphuric đậm đặc (hình 4)

- Phể MS (phụ lục 15): cho biết có mỗi m⁄z = 404 (M- 2H;O) Các mỗi có nưz chênh lệch nhau 14 đvC (-CH¿;-) và có cường độ giảm dẫn nhu: 57 (C,H,)’, 69 (C2H:O)”, 95 (CsH7O)*, 137 (CoH3O)* Ngoài ra có mũi m/z= 297 giống như mảnh

đã thấy trong hợp chất T1 và T2, đó là mảnh:

-CH-(CH,)„„-CH,

OH

cho thấy hợp chất T4 có các mũi đặc trưng của alcol béo Thư viện phổ cho biết

hợp chất T4 có thể là Nonacosa-5,10-diol với độ tương hợp là 81%

- Phổ IR KBr (phụ lục 16), v cm : 3210 (O ~ H );, 2925, 2850 (C-H)

- Phổ '!H-RMN (CDCI) (phu luc 17), 855m: 3,64; 3,59 (nỗi đa, các profon loại

~ CH, - CHOH- CH, — ); 1,68 (mii da, proton -CH,-CHOM); 1,45 (mỗi da, các

proton loai —CH,); 0,94; 0,88 (mỗi ba, các proton của 2 nhóm -CHỊ)

- Phổ C-RMN kết hợp với phổ DEPT 90 và 135 (CDCI;), (phụ lục 18 và 19), chỉ

cho các mỗi Ở vùng từ trường cao vỚi öpsạ: 72,02 và 71,73 ( 2 carbon loại -CHOH); 39,72 đến 18,85 (các carbon -CH¿-); 14,12 (các carbon loại -CHạ)

* Biện luận cấu trúc của hợp chất T4

- Phổ C- và DEPT-RMN cho thấy các mỗi cộng hưởng đều ở vùng từ trường cao

từ 14-72 ppm, trong đó có hai carbon là - CH¿T- CHOH- CHạ-; hai carbon là

~CH; và các carbon còn lại đều là -CH; - cho thấy đây là alcol béo có phân nhánh

GVHD: PGS.TS NGUYEN KIM PHI PHỤNG HVCH: TRAN HONG DUNG