P2 thực nghiệm về thành phần hóa học cao eter dầu hỏa của cây chó đẻ răng cưa

P2 thực nghiệm về thành phần hóa học cao eter dầu hỏa của cây chó đẻ răng cưa

PHAN THỰC NGHIỆM

Dhan Lhuc nghiệm

Việc khảo sát, nghiên cứu trên cây Chó Đẻ Răng Cưa được thực hiện với các phương pháp cụ thể như sau:

‹ Phân tích hàm lượng các nguyên tố bằng quang phổ phát xạ nguyên tử Máy

Dx 8, phòng phân tích quang phổ, Liên Đoàn Địa Chất Việt Nam

- Đo điểm nóng chảy trên máy Electrothermal IA 9000 Series, Digital Melting Point Apparatus

: Phổ hồng ngoại IR ghi trên máy quang phổ hồng ngoại Briker 40, tại Viện Công Nghệ Hóa Học

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H RMN ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC.200, tần số cộng hưởng 200 MHz

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ĐC RMN kết hợp với kĩ thuật DEPT ghỉ trên máy

cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC.200 , tần số cộng hưởng 50 MHz, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Và Thi Nghiệm Thà nh Phố Hỗ Chí Minh

- Khối phổ: Ghi phổ trên máy HP-5989 B-MS, Phòng cấu trúc, Viện Hóa Học,

Hà Nội

- Một số phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi ở Viện Hóa Hợp Chất Tự Nhiên, Gif-sur-Yvette, Cong Hoa Pháp

Trang 19

Đhản Lhực nghiệm

TRONG CAY CHO DE RANG CUA

1.1 Khảo sát nguyên liệu

1.1.1 Thu hái và xử lý mẫu

Với sự giúp đỡ của các nhà thực vật học của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, của Công ty Dược liệu Trung ương II và của Công

ty Vimedimex, chúng tôi đã xác định được vùng sinh thái chủ yếu của loài Phyllanthus urinaria phân bố ở các tỉnh Bình Dương, Đồng Nai, Bình Thuận, Ninh

Thuận, Phú Yên,

Cây Phyllanthus urinaria do ưường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, mẫu cây mọc hoang thu hái tạt huyện Tân Uyên tỉnh Bình Dương Cây được thu hoạch vào mùa mưa (tháng 9) và mùa khô (tháng 3)

Nguyên liệu tươi, loại bỏ cỏ và cây bị sâu bệnh Phân cây thành 3 phần: lá, thân và rễ riêng biệt Để khô nguyên liệu ở nhiệt độ phòng, rồi đem sấy ở 50°C đến trọng lượng không đổi Nguyên liệu khô đem xay thành bột nhỏ, thu được bột thô của thân, lá và rễ tương ứng

1.1.2 Xác định độ ẩm

Cân một lượng xác định nguyên liệu tươi, phơi cây tươi nơi thoáng ở nhiệt

độ phòng, sau đó sấy ở II0°C đến khi trọng lượng cây không thay đổi Cân, rồi tính hàm lượng Ẩm của mẫu

Bảng 1 Trọng lượng bột cây khô tương ứng với mẫu cây tươi

1.2 Khảo sát sự hiện điện của các ion vô cơ

Sơ bộ nghiên cứu sự phân bố các nguyên tố vi lượng trong các bộ phận của cây bằng phương pháp quang phổ phát xa Kết quả xem bang 2

Trang 20

Dhần Lhưc nghiệm

Bảng 2: Sự phân bố hàm lượng các nguyên tố vi lượng trong các bộ phận của

cây PhyHanthus trinaria L., lấy tại Tân Uyên -Bình Dương

Nhận xét: Ca có hàm lượng cao nhất: 1%; nguyên tố có hàm lượng cao thứ

hai la Mg: 0,5%

1.3 Khảo sát sự hiện diện của các thành phần hữu cơ có trong cây Chó Dé Răng Cưa

1.3.1 Điều chế các loại cao

Trong cây cỏ thường có sự hiện diện của một số cấu tử hữu cơ như sterol, alcaloid, glicosid, tanin, flavon, saponin, triterpen Mỗi cấu tử hữu cơ được định tính bởi các thuốc thử đặc trưng, thường là các phản ứng có màu hoặc trầm hiện

Sự khảo sát này dược thực hiện trên bột thô, cao hexan và cao etanol của thân lá

và rễ của cây Chó Đẻ Răng Cưa

1) Điều chế cao hexan

Mẫu thô thân, lá và rễ đem trích soxhlet với dung môi hexan trong 62 giờ, đến khi dung môi trong Lọc, cô cạn dung môi ở áp suất kém, thu được cao hexan của thân, lá và rễ tương ứng

2) Điều chế cao etanol

Bã cây từ 1, để khô tự nhiên, tiếp tục trích bằng etanol 95% trong soxhlet (48 giờ), đến khi dung môi trong Thu hổi etanol ở áp suất kém, thu được cao etanol của thân, lá và rễ tương ứng

Trang 21

Phan thuc nghiệm

1.3.2 Khảo sát định tính

1.3.2.1 Xác định sự hiện diện của sterol

1) Đại cương về sterol

Sterol thuộc nhóm steroid, có nguồn gốc thực vật hoặc động vật Cấu trúc gồm 27-29C, có sườn cơ bản là ciclopentanophenantren

Sterol là chất không phân cực, ít tan trong nước, tan nhiều trong các dung môi không phân cực như eter etilic, eter dầu, benzen, cloroform, nên thường dùng

dung môi này để ly trích sterol Một số thuốc thử dùng để nhận biết sterol như:

Các phương pháp xác định sterol dựa trên phản ứng màu với 3 thuốc thử sau đây: Liebermann-Burchard, Sakowski, HạSO¿ đả

2) Định tính sterol

Trang 22

Dhần Lhực nghiệm

——

Hòa tan bột cây khô (lIgam) trong cloroform 20 ml Lọc lấy dịch lọc dùng

làm mẫu thử Với mẫu cao (0,1 gam) hòa vào 30 ml cloroform, lấy dịch lọc làm mẫu thử

- Thuốc thử Liebermann - Burchard

H;SOx đậm đặc Iml Nếu thấy xuất hiện màu xanh nhạt, lục, hổng hoặc đỏ là phản ứng dương tính

- Thuốc thử Salkowski

H;SO¿ đậm đặc Dung dịch tách làm 2 lớp, lớp HạSOx có màu xanh và lớp

cloroform có màu đỏ với thuốc thử Salkowski

- Thuốc thử Noller: SOCl; và thiếc

Cách thử: Cho 2ml SOC]; vào ống nghiệm sau đó cho 2 viên nhỏ thiếc, khi dung

dịch hết sủi bọt, cho tiếp 2ml mẫu thử Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển

từ màu cam sang màu đỏ tím

Bang 3 Két quả định tính sterol của bột thô, cao hexan, và cao etanol của

thân, lá và rễ của cây Phyllanthus urinaria

Đhần Lhực nghiệm

Alealoid là baz hữu cơ có nguồn gốc thực vật, nhưng đôi khi tạo thành do

tổng hợp, luôn luôn chứa nữ có tính baz ñ hay nhiều, có được tính đặc biết ở liều

lượng thấp, cho các phản ứng trầm hiện với các thuốc thử đặc trưng của nó,

Alcaloid gốc thực vật hiếm khi ở đạng tự do, thường ở đạng kết hợp với axit

hữu cơ hoặc vô cơ; đa số không mau, ft tan trong nước, tan để đàng trong dụng môi eter, benzen, cloroform, euil acetat, cd vi ding, có tinh trién quang,

Alealoid có tính baz, với axit tạo thành rouối, tan trong nước, dé kết tinh,

bẩn, đang muối chỉ bị thủy phân bởi ánh sáng mặt trời hay la tử ngoại

3) Định tinh alealoid

Bột thổ (Š gam) trích với dụng dich Prollius (eter etil, cloroforra, etanol,

NHẠOH, tỷ lệ 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lắc thường xuyên, Lọc lấy

+ Thudc thi Bertrand

_Axit Siliconmestic 5,08

Nước cất 100ml Cho kết tủa màu trắng dục với địch chứa alcaloid,

Dhần thực nghiệm

Lấy 5 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm 2ml mẫu thử và lần lượt cho từng giọt các thuốc thử trên vào các ống nghiệm

Bang 4 Kết quả định tính alealoid của bột thé, cao hexan, va cao etanol cua

thân, lá và rễ của cAy Phyllanthus urinaria

phuong phdp Stass-Otto Xem so đồ 2

sau khi để khô cây trong bóng râm và xay nhuyễn, theo

Trang 25

Phén are nghiện

Bột cây khô (1006) được tẩm với NHẠOH 50% (00m), dé khd agodi khong khí, Ngâm nguyên liệu trong hỗn hợp dụng môi cter eulic:CHCH(3:1) trong 24giờ, Lọc bỏ bã, lấy dụng dịch Cô loại dung môi, tận trích bằng H;SỐO, 3%, thu được địch axit, Dich axit được kiểm hóa véi dung dich NH,OH 10% đến pH = 9-10 Sau

đó lắc dụng địch này với hỗn hợp đụng môi eter eHlic:CHCHÓ1) Các phần hỗn hợp dụng môi được gộp lại và rửa với nước cất, làm khan bằng Na;SÖ, Lọc, loại dụng môi thụ được alcaloid tổng

Trang 26

-Tém NHsOH 50% (v/v), để khô 48giờ

-Trich bang EtOEt:CHC1];(3:1) trong 24 gi

-Loc

Kết quả hàm lượng alcaloid tổng theo mùa như sau:

- Mùa khô: 0,023% trong lượng bột cây khô

- Mùa mưa: 0,012% trong lượng bột cây khô

Trang 27

Đhần Lhưc nghiệm

1.3.2.3, Định tính và định lượng cHeosid [24, 24]

š) Đại cương về giicosid

Ghosid là các hợp chất hữu cơ tạo thành do Sự ngững tu giữa một đường với

một phần không phái đường với điều kiện nhóm hidroxyl ban acetal cla phan đường phải tham gia vào sự ngưng tụ, Phần không phái là đường được gọi là

agiycon hoặc genin, có cấu trúc hóa học rất khác nhau, đa số tác dụng sinh học

phụ thuộc vào phan này,

Độ tan khác nhau phụ thuộc vào mạch đường đài ngắn và phụ thuộc vào nhóm ấi nước có trong phần agiycon, Thường các gilicosid tan trong nước, cồn; it hoặc không tan trong cấc dụng môi hữu cơ như: hexan, cter, chiorof@rm, Phần

gen có độ tan ngược lại,

3) Định tính

Để xác định sự hiện điện của glicosid, chúng tôi sử dụng phương pháp SOOS (có sửa đổi) theo sơ để 3 Dịch etanol sau cùng được dùng để trắc nghiệm

với các thuốc thứ ToHens, Baliet và Molish

Tận trích nguyên liệu JOQgara (bột cây khô, cao eter đầu hỏa, cao alcol) với etanol 20% trong 24 giờ, Lắc thường xuyên, Lọc, chế hóa dịch lọc vỚI acetat chì

trong nước đến khi không còn trầm hiện, Lọc, thêm dụng dịch Na;SÖa bão hòa đến

khi không còn trầm hiện Để yên 12 giờ Lọc, cô cạn dung địch Hòa tan phần cặn

trong etanol 95%, dụng địch này dùng làm mẫu thử,

Với các mẫu cao, hòa lan cao vào dung môi đã ly trích nó, lọc lấy dịch lọc

Dung dịch thymöi 2% 1-2 giọt

H.SO, dim dac 1ml Nếu thấy xuất hiện màu đồ là phần ứng dương tinh

Cách thử: Lấy 2 ống nghiệm, cho vào ống thứ nhất 2 mi mẫu thử dam đổi chứng) Cho 2ml dụng địch mẫu thử vào ống nghiệm: thứ nhì, cho từng giọt thuốc thử vào,

Trang 28

- Dong dich Na2SO, bao hoa

- Loc Dich loc

- Cô cạn đưới áp suất kém

Trang 29

Đhần thực nghiệm

Bang 5 Két qua định tinh glicosid của bột thô, cao hexan, và cao etanol của

thân, lá và rễ của cây Phyllanthus urinaria

Cây mẫu Tollens | Baljet | Molish

Bột thô + + + Thân Cao hexan - - -

Kết luận: Bột thô, cao etanol của thân, lá và rễ của cay Phyllanthus urinaria

có chứa glicosid; cao hexan, của thân, lá và rễ không có glicosid

3) Định lượng

Chúng tôi tiến hành xác định glicosid theo sơ đồ 4

Bột khô (100g), tận trích với eter dầu hỏa trong Soxhlet Lọc, bã lọc để khô

ở nhiệt độ phòng, tận trích tiếp với etanol 20% Lọc lấy dịch etanol Cô dung môi ở

áp suất kém Dung dịch còn lại, được loại tạp bằng acetat chì 20% Lọc bỏ trầm hiện Dung dịch còn lại đem loại acetat chì dư bằng Na;SO, bão hòa, thu lấy dịch

nước Dung dịch nước đem tận trích bằng cloroform

Dịch cloroform rửa với nước cất, làm khan bằng Na;SO¿ cô cạn dung môi ở

áp suất kém, thu được 0,78g

Dịch nước tận trích với n-BuOH, chiết lấy dịch nước, làm khan bằng Na;SO¿, cô cạn dung môi ở áp suất kém, thu được 0,42g

Kết quả định lượng cho biết hàm lượng glicosid cla cay Phyllanthus urinaria là:

1,20% glicosid theo trọng lượng cây khô

Trans 30

Tận trích với EtOH 20% trong Soxhlet

- Loại chì dư bằng dung dịch Na;SO,„bão hòa

- Rửa với nước cất

| - Lam khan bang Na2SO,

- Cô cạn dung môi

Chân thực nghiệm

1.4.2.4, Định tính và định lượng tanin{23,24}

3) Đại cương về tanin

Định nghĩa: Tanin là những hợp chất poliphenol có trong thực vật, có vị chất

và được phát hiện đương tính với phần ứng thuộc đa và được định lượng đựa vào mức độ hấp phụ trên bột đa sống chuẩn,

Tanin có một vài tính chất chung sau;

Làm kết tủa với mội số protsim, đặc biệt với gelaun và alburmin; làm kết tủa

vai baz hữu cơ, đặc biệt cho trầm hiện với một số alcaloid; có tính thuộc đa; với muối kừmn loại nặng, tlanin cho nhựa sơa với man sdc khác nhau, đặc biệt với muối

sắt, tanin cho mầu xanh lá cây hoặc xanh dương đậu

Tanin tan trong nước (Ig/Ô,35ml nước), và địch nước có tính axi yếu Ngoài

ra tanin còn tan trong cồn, aceton, etil acetat, không lan trong eler cubc, benzen,

đisulfua cacbon, tetraclorua cacbon; tanin thưởng ở đang vô định hình, xếp, có mầu

rằng nhạt đến nâu và sâm dân dưới ánh sáng và không khí; tanin thường có vị chất

và điểm nóng chấ y không xác định

2) Định tính

Cân nguyên liệu (Sgam hột cây khó) Thêm nước cất (10Ôml), Đun sôi trong

1Ô phút, Lọc; lấy địch lọc làm mẫu thử,

Với ruẫu cao, lấy 3 gam cao đun sôi trong LQO rnl rước cất trong 1Ô phút, Lọc, lấy dịch lạc lầm mẫu thử,

- Lấy mẫu thử (100ml), thêm thuốc thử SHasny (fml); dun nóng Tram hiện mau

đỏ cho biết sự hiện điện cha tanin

- Lấy mẫu thử (10ml), thêm 4 giọt acetat chỉ Trầm hiện mầu vàng cho biết sự hiện

điện của tan

- Lấy mẫu thử (10ml), thêm dung địch gielain mặn (95ml), Trầm hiện võ định hình màu vàng, để lâu chuyển thành mầu nâu cho biết sự hiện điện của tanin,

- Lấy mẫu thử (10ml), thêm 2 giọt FeCh Í% trong nước, Dung dịch chuyển sang

màu xanh lơ cho biết sự hiện điện của tan,

Định tính tanin bằng thuốc thử sau đây:

Dung dich NaCl bao hoa 1000!)

- Dung địch acetat chì bẦo hòa

- Dung dich PFeCLa 156 trong nude

Bộ phận Dạng Thuốc thử |

Cây mẫu Stiasny | Gelatin man | FeCl; 1% |

Bội thô + + + Thân Cao hexan - - -

Cao etanol + + + Bột thô + + +

Kết luận: Bột thô, cao etanol của thân, lá và rễ của cay Phyllanthus urinaria

có chứa glicosid; cao hexan, của thân, lá và rễ không có tanin

Dịch acetat etil, thu hồi dung môi, cô cạn, làm khan đến trọng lượng không đối, thu được 2,97g

Dịch nước trích với n-BuOH bão hòa Lọc lấy dịch n-BuONH, cô cạn dung môi ở áp suất kém, để khan trong bình hút ẩm đến trọng lượng không đổi, thu được

5,218

Kết quả định lượng tổng hàm lượng tanin của cây Phyllanthus urinaria là: 8,18% tính theo trọng lượng cây khô

Trang 33

đổi

Dich n-BuOH Cặn không tan

-Thu hồi dung môi ở 40°C

hân Lhựo nghiệp

1.3.2.5, Xác định sự hiện điện của flavon [24,25]

}) Đại cương về flavon

Flavonotd là một nhóm hợp chất lớn thường gặp ở thực vật, Phần lần các

hợp chất Ílavonoid có màu vàng, Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có

cấu tạo khung kiểu C4-¿-Ck sau:

Trong đa số trường hợp thì mạch 3 C đóng vòng với vòng Á tạo nên di vòng

C có chứa oxi, các đị vòng có thể như sau:

Dihydropyran Ÿ-pyron Dihydro Y-pvron Pyriium

Phần lớu các favonoid có thể xem là các dẫn chất có nguồn gốc phenyl của các nhân sinh ra từ sự ghép vòng C với vòng Á sau đầy:

Benzodihydropyran Benzo-Y-pyron Benzodihyvdro-¥-pyron Renzopyriium

Các vòng thường mang một hay nhiều nhóm -QH tự do hoặc thay thế một phần, vì vậy về tỉnh chất chúng là các pobphenol, có tính axH., Độ hòa tan của họ chất flavonoid phụ thuộc vào số nhóm -GH và các nhóm thể khác cua ching

Các thuốc thứ cho đa vonoid:

Phản ứng cyannidin cla Willstater: (phan Ung Shibata) Đấy là phản ứng khứ hay thưởng được sử dụng nhất để tìm sự có mặt các dẫn xuất flavonoid

Thuốc thử gồm: Axit HCI, bột Ma kim loai, va rudu isoamilic

Trans 35

Dhan thue nghiệm

Phan ting Martini Bettolo: SbCl; trong CCl, cho mau từ đỏ đến tím với

chalcon, vàng tới vàng cam đối với flavon Dihydrochalcon do mất nối đôi tiếp

cách giữa nhóm cacbonyl và nối đôi ở vòng B nên không cho màu với SbCl; hoặc với H;SOa

Tác dụng của H;ạSO¿ đậm đặc: Axit H;ạSO¿ khi nhỏ lên các đẫn xuất flavon

và flavonol thì cho màu vàng đậm Đối với chalcon và auron cho mau dé , đỏ thắm

và đồ tươi Flavanon cho màu đỏ tươi rồi đỏ thắm

2) Định tính

Cân 100mg (bột cây khô) Thêm nước cất (100ml) Đun sôi 30 phút Để

nguội; lọc, dung dịch lọc làm mẫu thử

Thuốc thử Shibata: HCI đậm đặc, bột Mg kim lọai, alcol isoamil

Cách thử: Cho mẫu thử (2ml) vào 2 ống nghiệm, ống thứ nhất làm đối

chứng, Trong ống nghiệm thứ nhì, thêm HCI đậm đặc (5ml), bột Mg, thêm alcol

isoamil doc theo thành ống nghiệm, đun nhẹ Nếu có một vòng màu hồng từ từ

xuất hiện, rồi chuyển sang màu dé tim thi phan ứng dương tính

Bang 7 Kết quả định tính flavon trên thân, lá và rễ của

cây Phyllanthus urinaria

Kết luân: Bột thô, cao etanol của thân, lá và rễ của cây PhyHanthus urinaria

đều có chứa flavon; cao hexan của thân và rễ không chứa flavon

1.3.2.6 Xác định sự hiện diện của saponin [24,26,28]

1) Đại cương về saponin

Định nghĩa: Saponin là một loại glicosid rất thường gặp trong thực vật Tiền

tố sapo có nghĩa là xà phòng Người ta biết khoảng 500 loài thuộc hơn 80 họ thực

Trang 36

- Tính phá huyết: là tính chất làm vở hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- §aponin có thể làm chết cá hoặc một số động vật máu lạnh khác ở những nồng

độ rất thấp

2) Định tính

Cân bột mẫu (1 gam) cho vào crlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ khoảng 30 phút Lọc, để nguội, và thêm nước cất đến 100 ml (nước sắc)

Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3, 10 mi nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10

ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Đo chiểu cao các cột bọt Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới | cm thi chỉ số bọt là đưới 100, nghĩa là không có saponin Nếu ống nghiệm thứ 4 có cột bọt cao L cm, chỉ số bọt được tính như sau:

Chỉ số bọt của bột cây khô, cao hexan, cao etanol đều < 100

Kết luận: Bột thô, cao hexan, và cao etanol của thân, lá và rễ của cây

Phyllanthus urinaria đều không có chứa saponin

Trang 37

- Kết quả định tính cho thấy cây Phyllanthus urinaria khong chứa saponin

e Sterol hầu như có mặt trong các cao trích từ thân, lá và rễ

® Alcaloid chỉ có trong bột thô và cao etanol của thân, lá và rễ

- Kết quả định lượng cho thấy cây Phyllanthus urinaria chứa:0,012-0,023%

alcaloid (tùy thuộc mùa mưa hay mùa khô); 1,20% glicosid và 8,18% tanin

- Nhận xét: Tanin thô thu được là bột màu vàng, phần thu được từ dung môi

etil acetat là dạng bột mịn hơn so với phần thu được từ dung môi butanol có hàm

lượng tương đối cao

Trang 38