NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA P24 CỦA HIV-1 PHÂN TYPE AE CỦA BỆNH NHÂN Ở HÀ NỘI EXPRESSION OF GENE ENCODING P24 ppt

Hiện nay trên thị trường có nhiều kit chẩn đoán HIV dựa trên cơ sở các protein tái tổ hợp gp120, gp41 và p24 nhưng giá thành rất cao và chưa phù hợp với các phân týp HIV đang lưu hành ở

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA P24 CỦA HIV-1

PHÂN TYPE AE CỦA BỆNH NHÂN Ở HÀ NỘI

EXPRESSION OF GENE ENCODING P24 PROTEIN FROM HIV-1 SUBTYPE CRF_01AE OF PATIEN IN HANOI

SVTH: Phạm Thị Kim Thảo

Lớp 05SH, Khoa Hoá, Trường Đại học Bách Khoa

GVHD: PGS.TS Đinh Duy Kháng

Phòng Vi sinh vật phân tử, Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học Việt Nam

TÓM TẮT

HIV-1 CRF01_AE là phân type chiếm tỷ lệ lây nhiễm cao tại Việt Nam và các nước Đông Nam Á Sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc, văcxin chưa thực sự có hiệu lực và các tệ nạn

xã hội đang góp phần làm cho đại dịch HIV lan tràn với tốc độ chóng mặt Vì vậy việc chẩn đoán sớm nhiễm HIV là biện pháp tốt nhất để ngăn chặn sự lây nhiễm trong cộng đồng và đảm bảo an toàn trong công tác truyền máu Hiện nay trên thị trường có nhiều kit chẩn đoán HIV dựa trên cơ

sở các protein tái tổ hợp gp120, gp41 và p24 nhưng giá thành rất cao và chưa phù hợp với các phân týp HIV đang lưu hành ở Việt Nam Sự phát hiện protein p24 của HIV-1 giúp chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi diễn tiến của bệnh và đánh giá hiệu quả của liệu pháp kháng retrovirus

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp p24 trong tế

bào E.coli BL21 starTMDE3, tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện và tinh sạch bằng cột Ni 2+ -Resin để tạo kit chẩn đoán Protein tái tổ hợp thu được phản ứng đặc hiệu với huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HIV bằng phương pháp Western Blot

ABSTRACT

HIV-1 CRF01_AE appears to be the cause of high proportion of infections in Viet Nam and Southeast Asia Emergence of multidrug resistant strains, non-availability of an effective vaccine and inappropriate social behaviors of populations have caused the HIV pandemic cross astounding proportions So early diagnosis of HIV infection is perhaps the best way to stop its spread among populations and ensuring safety of blood obtained from donors Now Diagnostic kit is very multiform but they are high cost and may be not suitable for HIV-1 strain circulating in Vietnam For development of the kits, the three recombinant proteins gp120, gp41 and p24 have been used HIV-1 p24 detection provides a means to aid the early diagnosis of HIV-1 infection, track the progression of disease and assess the efficacy of antiretroviral therapy

In the present study, we successfully expressed recombinant p24 protein in E.coli BL21

starTMDE3, optimized expressing conditions and purified by Ni2+-Resin column to produce HIV-1

diagnotic kit Purified recombinant p24 protein specifically responded with the serum of HIV-1

infected patients by Western Blot analysis

1 Mở đầu

Sự gia tăng nhanh chóng về số người nhiễm HIV trên toàn thế giới với khoảng 20 triệu người chết vì AIDS mỗi năm, 33 triệu người mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (UNAIDS, 2009) vẫn đang là mối hiểm họa đối với toàn nhân loại Dịch bệnh làm gia tăng sự nghèo đói, tác động không nhỏ đến tình hình kinh tế, xã hội và chính trị đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam Việc nghiên cứu thuốc và văcxin phòng chống HIV là vấn đề được cả thế giới quan tâm, tuy nhiên hiện vẫn chưa nhận được

các kết quả như mong đợi Do vậy việc chẩn đoán sớm các trường hợp nhiễm HIV là hết sức quan trọng, góp phần ngăn chặn các hành vi nguy cơ làm lan truyền HIV/AIDS trong cộng đồng Các kit chẩn đoán HIV rất đa dạng và phong phú, được nhiều hãng nghiên cứu

và sản xuất Tuy nhiên, giá thành vẫn còn cao và chưa hẳn đã phù hợp với các phân týp HIV đang lưu hành ở Việt Nam

HIV-1 là type lưu hành chủ yếu và gây đại dịch trên toàn cầu HIV-1 gồm bốn phân nhóm chính M, N, O, P, trong đó Nhóm M chiếm 90% các trường hợp nhiễm HIV-1 Có ít nhất là 9 phân type di truyền, gồm A, B, C, D, F, G, H, J, K và các thể tái tổ hợp (CRFs)

Có khoảng 30 thể tái tổ hợp đã được phát hiện mới Các phân type này phân bố theo từng vùng địa lý khác nhau Hiện nay, type CRF01_AE (tái tổ hợp vật chất di truyền giữa typ A

và E) là phân typ gây đại dịch ở các nước Đông Nam Á và cũng là phân nhóm chiếm đến 97% phân typ HIV-1 lưu hành tại Việt Nam

Việc chế tạo các kit chẩn đoán đòi hỏi phải dựa trên sự lưu hành phân typ trong nước thì mới đảm bảo được tính chính xác và độ nhạy cao, đồng thời hạ giá thành sản phẩm Các bộ Kit này dựa trên cơ sở các protein gp120, gp41 và p24 tái tổ hợp Đáng lưu ý

là p24, là protein nucleocapsit hay còn gọi là protein lõi, có vai trò quan trọng ở các giai đoạn khác nhau trong chu trình sống của HIV Trước tiên p24 tham gia vào quá trình cởi

áo sau khi virus xâm nhập, nó ảnh hưởng đến mối liên kết giữa RNA và DNA trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm, hoạt động như là yếu tố hỗ trợ (cofactor) cho enzym phiên

mã ngược, làm nhiệm vụ nhận biết các dấu hiệu đóng gói, trung gian cho sự kết hợp giữa hai phân tử RNA khác nhau để hình thành genom của hạt virion HIV-1 mới

Trong chẩn đoán, p24 là kháng nguyên đặc hiệu của HIV P24 xuất hiện sớm nhất,

2 – 3 tuần sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt giai đoạn cấp tính của nhiễm trùng HIV Sau đó, kháng nguyên p24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện kháng thể p24 Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV Vài tháng cho tới vài năm sau nhiễm trùng, kháng thể p24 mất đi, kháng nguyên p24 tái xuất hiện, báo hiệu giai đoạn xuất hiện triệu chứng của bệnh (AIDS) Đây là cơ sở để xây dựng các phác đồ điều trị cho những bệnh nhân nhiễm HIV

Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa p24 của HIV-1 phân typ A/E của bệnh nhân ở Hà Nội”

2 Nguyên liệu và phương pháp

2.1 Nguyên liệu

Gen p24 của HIV phân type đã được tách dòng thành công trong vector tái tổ hợp pCR2.1-p24AE

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp biến nạp: Tế bào E coli được biến nạp theo phương pháp tạo tế bào

khả biến bằng muối CaCl2 của Seidman C.E và cộng sự [1]

chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Biến tính ở 94°C 1 phút, gắn mồi ở 60°C 50 giây, kéo dài chuỗi ở 72°C 1phút 20 giây; phản ứng kết thúc ở 72°C 8 phút và ủ mẫu ở 4°C

Tinh sạch protein bằng cột ái lực ProBond Nikel-Chelating Resin (Invitrogen) Định lượng protein bằng Bradford [3]

Phản ứng lai Western Blot[4]

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Thiết kế vector biểu hiện

3.1.1 Khuếch đại bằng cặp mồi biểu hiện đoạn gen p24 từ vector tách dòng

Nhằm tạo đầu gắn tương thích khi đưa vào vector biểu hiện Đoạn gen p24 được

khuếch đại với cặp mồi biểu hiện có gắn trình tự cắt hạn chế của BamHI và XhoI từ khuôn

là vector tách dòng pCR2.1-p24AE Sản phẩm PCR với cặp mồi biểu hiện mang gen p24 sẽ

có kích thước khoảng 584bp Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, hình 1 cho thấy kích thước đoạn gen là phù hợp với dự đoán

Hình 1 A Cặp mồi biểu hiện và B sản phẩm PCR của gen p24 bằng cặp mồi biểu hiện

Đường chạy M: thang DNA chuẩn, Đường chạy số 1: sản phẩm PCR

3.1.2 Tạo vector dòng trung gian và vector biểu hiện

Các enzym giới hạn thường khó nhận biết và cắt ở những vị trí đầu cùng của phân

tử DNA Do đó để tạo đầu dính trên sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành tạo vector tái tổ hợp dòng trung gian, bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tạo dòng pCR2.1

tạo vector tái tổ hợp pCR2.1-p24AE.BX sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

Nuôi vi khuẩn trong môi trường LB bổ sung ampicilin (0,1mg/ml) và X-gal (0,1mg/ml), nuôi 37°C qua đêm, chọn 11 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh tách plasmid, điện di kiểm tra hình2A Chọn 5 plasmid ở Hình 2A đường chạy số 3, 5,6, 7, 8, cắt kiểm tra bằng

Bam HI và Xho I, Căn cứ vào kết quả ở hình 2B đường chạy 2, 3, 4 văng ra hai băng, có

khả năng chúng tôi tạo được plasmid tái tổ hợp dòng trung gian mang gen kích thước khoảng 584bp

Hình 2 Kết quả tạo vector tái tổ hợp dòng trung gian pCR2.1.p24AEBam-Xho

A Kết quả tách chiết plasmid dòng trung gian B Kết quả kiểm tra plasmid dòng trung gian bằng enzym giới hạn Bam HI và Xho I ĐC 1A-11A Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng; ĐC X Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh; ĐC M Thang ADN chuẩn; ĐC 1B-5B Plasmid 3,5, 6, 7, 8 cắt bằng enzym giới hạn Bam HI và

Xho I; ĐC6B Sản phẩm PCR gen p24chạy bằng cặp mồi biểu hiện

Kết quả giải trình tự và dịch mã ra các axit amin trên cơ sở lý thuyết, cho phép chúng tôi khẳng định rằng đã tách dòng thành công vector dòng trung gian và đoạn gen p24 thu được trong vector pET32a+ có khung đọc đúng, có mã khởi đầu và kết thúc, không

có điểm kết thúc ở vùng khởi động, đảm bảo cho quá trình biểu hiện thông suốt

Xử lý plasmid pCR2.1.p24AEBam-Xho và pET32a+ bởi hai enzym Bam HI và Xho I Tiến hành phản ứng gắn tạo vector biểu hiện pET32a+.p24, sau đó biến nạp vào tế bào E.coli DH5α, trải trên LB bổ sung ampicilin Thu các khuẩn lạc đã nuôi cấy tách chiết plasmid, rồi cắt kiểm tra bằng Bam HI và Xho I

Hình3 Trình gen p24 và kết quả cắt kiểm tra các vector dòng tái tổ hợp pET32a+.p24 bằng enzym giới hạn

Vị trí cắt của Bam HI GGATCC; Vị trí cắt của Xho I CTCGAG

Hình 4 Kết thiết kế vector biểu hiện

A Kiểm tra sản phẩm thôi gel; B kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET32a+p24 tách từ E.coli;C Kiểmm tra các

Kết quả từ điện di đồ cho thấy các dòng plasmid khi cắt bằng BamHI và XhoI đều

văng ra đoạn gen p24 có kích thước khoảng 584bp Vậy chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện mang đoạn gen p24 mã hóa kháng nguyên lõi của HIV-1 Type AE

3.2 Biểu hiện ở tế bào E.coli BL21 DE3

Vector pET32a+.p24 được biến nạp vào E.coli BL21 DE3 nuôi cấy biểu hiện Để

tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, chúng tôi tiến hành nuôi biểu hiện khảo sát các thông số nhiệt độ, thời gian, nồng độ IPTG cảm ứng

Bảng 1 Mức độ biểu hiện protein khảo sát với các thông số nhiệt độ, thời gian và nồng độ IPTG

+/-Mức độ biểu hiện thấp không đánh giá được trên bảng điện di SDS-PAGE

+ Mức độ biểu hiện quan sát được trên bảng điện SDS-PAGE

Tổng hợp tất cả các điều kiện tối ưu khảo sát được chúng tôi nuôi kiểm tra một lần nữa với chủng mang vector tái tổ hợp được cảm ứng và

không cảm ứng Kết quả thể hiện ở hình 4

Nhằm thu lượng lớn để tinh sạch và kiểm tra

tính kháng nguyên, Chủng tái tổ hợp E.coli BL21DE3

mang vector pET32a+.p24 nuôi biểu hiện trong 100ml

LB, bổ sung ampicilin (0,1mg/ml), IPTG 0,5mg/ml ở

37°C, và thu protein sau 3 giờ cảm ứng

3.3 Tinh sạch

Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ

cho mục đích chẩn đoán, chúng tôi cần tinh sạch

protein này Do protein tái tổ hợp có 6 histidine ở đầu C

và đầu N nên có ái lực cao với ion Ni2+

trên cột Trong quá trình tinh chế, imidazol được sử dụng như chất

cạnh tranh Ni2+

trong phức hợp Ni2+-histidine Các protein lẫn trong dịch chiết protein tái tổ hợp tan được

loại bỏ hiệu quả khỏi protein tái tổ hợp ở nồng độ

imidazol 50 mM Sau đó protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột nhờ buffer đẩy (Native Elution Buffer), chúng tôi thu 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml Sau khi tinh chế, protein tái tổ hợp được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel polyacrylamit (Hình 6)

Hỗn hợp từ phân đoạn 1 – 6 ở hình 6 chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bằng phương pháp Bardford thì hàm lượng protein thu được là 0,5mg/ml trong 100ml dịch nuôi cấy Sử dụng 5µl protein tái tổ hợp được sinh sạch để tiến hành thí nghiệm

Hình 5 Biểu hiện tối ưu protein p24

ĐC M: Thang protein chuẩn, ĐC1: protein dòng mang plasmid tái tổ hợp không được cảm ứng IPTG, ĐC2: dòng plasmid mang vecter tái tổ hợp cảm ứng IPTG

Hình 6 kết quả tinh sạch của các phân đoạn protein thu được

M thang protein chuẩn, ĐC F: mẫu protein trước tinh sạch, ĐC 1 – 8: tương ứng các phân

đoạn thu được sau tinh sạch

Biểu đồ 1 Đồ thị đường chuẩn để xác định nồng độ protein p24 tái tổ hợp

Kết quả OD595nm = 0,614 Dựa trên đường chuẩn chúng tôi tính được nồng độ

protein tái tổ hợp là 0,5mg/ml

3.4 Kiểm tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp với mẫu huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật Western Blot

4 Kết luận

Đã thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp chứa các quyết định kháng nguyên của protein lõi p24 của HIV-1 phân type AE trong hệ biểu hiện

pET32a+, Ecoli BL21DE3

Đã tối ưu hóa được các điều kiện biểu hiện để nâng cao sản lượng protein tái tổ hợp

Đã tinh sạch được protein tái tổ hợp p24 bằng cột ái lực Ni2+

-Resin Hàm lượng protein thu được trong 100 ml dịch nuôi sau là 0,5 mg/ml

Protein tái tổ hợp p24 phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV trong các mẫu huyết thanh bệnh nhân dương tính và không phản ứng với các mẫu âm tính

Các nghiên cứu tạo kít chuẩn đoán HIV đang tiếp tục được thực hiện Hướng đến việc thiết kế qui trình tạo kit và sản xuất kit chẩn đoán ở qui mô ngoài phòng thí nghiệm

Hạ giá thành sản phẩm, áp dụng xét nghiệm rộng rãi trong cộng đồng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Seidman C E., Struhl K., Sheen J., Jessen T (1997), Current Protocols in Molecular Biology,pp.1.8.1-1.8.10

[2] Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., 1989: Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

[3] Bradford, M M (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding

Anal Biochem 72:248-254

[4] Towbin, H et al (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications Proc Natl Acad Sci U S

A 76(9):4350-4