Báo cáo y học: "Phát hiện virut EBV trên bệnh nhân ung thư vòm họng bằng phản ứng PCR" pdf

Phỏt hiện virut EBV trờn bệnh nhõn ung thư vũm họng bằng phản ứng PCR Lờ Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn* Nguyễn Đỡnh Phỳc**; Lờ Thanh Hũa*** Tóm tắt Từ bệnh phẩm là mụ sinh thiết của 3

Trang 1

Phỏt hiện virut EBV trờn bệnh nhõn ung thư vũm họng bằng phản ứng

PCR

Lờ Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn*

Nguyễn Đỡnh Phỳc**; Lờ Thanh Hũa***

Tóm tắt

Từ bệnh phẩm là mụ sinh thiết của 3 bệnh nhõn (BN) được chẩn đoỏn ung thư vũm họng (UTVH), phỏt hiện hệ gen EBV bằng phản ứng PCR Sử dụng kỹ thuật dũng húa và giải trỡnh tự, toàn bộ chuỗi ARN thụng tin đoạn gen LMP-1 của EBV được xỏc định trong cả 3 mẫu bệnh phẩm nghiờn cứu

* Từ khoỏ: Ung thư vũm mũi họng; EBV; LMP-1

Detect Epsstein-Barr virus in patients with nasopharyngeal carcinoma by

polymerase chain reaction

Summary

Genomic DNA from biopsy tissue of 3 patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC) was extracted Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the LMP-1 gene of EBV was detected We detected EBV in biopsy tissue of these 3 patients

* Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; LMP-1

ĐẶT VẤN đề

Ung thư vũm mũi họng là một loại khối

u ỏc tớnh xuất phỏt từ lớp biểu mụ phủ của

vựng vũm mũi họng Loại ung thư này

được xếp vào cỏc khối u biểu mụ của

đường tiờu hoỏ và hụ hấp trờn, là một

trong 5 loại ung thư phổ biến nhất ở người

Việt Nam và hay gặp nhất trong ung thư

vựng tai mũi họng Trờn thế giới, cũng hay

gặp ở cỏc nước vựng Đụng Nam Á và phớa

nam Trung Quốc [6]

Về nguyờn nhõn của bệnh, cú rất nhiều giả thiết, tập trung thành ba nhúm chủ yếu

đú là do virut Epstein-Barr, do di truyền và

do cỏc yếu tố mụi trường, tập quỏn ăn uống, hoỏ chất Trong thời gian gần đõy, cú rất nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu của cỏc tỏc giả trong và ngoài nước về mối liờn quan

giữa virut Epstein-Barr và ung thư vũm mũi

họng

EBV là một thành viờn thuộc nhúm herpesvirut týp 4 gõy nhiễm bệnh trờn người [3] Cấu trỳc

* Bệnh viện 103

** Học viện Quân y

*** Viện Công nghệ Sinh học

Phản biện khoa học: PGS TS Nguyễn Thái Sơn

hệ gen của EBV là chuỗi ADN xoắn kộp,

mạch hở, kớch thước khoảng 172 kb Hệ

gen của EBV gồm 6 tổ hợp gen mó húa cho

cỏc loại protein khỏng nguyờn, ký hiệu là

EBNA, đú là EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C và EBNA-LP và 3 tổ hợp gen mó húa cho protein màng là

LMP-1, LMP-2A và LMP-2B [LMP-1, 5]

Trang 2

Nhiễm tiềm tàng EBV là khởi đầu sớm

cho quá trình tiến triển ung thư [8] Trong

các protein có vai trò quan trọng đối với quá

trình tiến triển thành UTVH ở giai đoạn

sớm, LMP-1 là một loại đặc biệt do protein

này có khả năng gây ung thư thực nghiệm

trên chuột và LMP-1 cũng có khả năng gây

ra nhiều kiểu biến đổi kiểu hình tế bào

lympho B và tế bào biểu mô khác [2] Một

bằng chứng quan trọng chứng minh vai trò

của LMP-1 trong quá trình tiến triển UTVH

là protein LMP-1 biểu hiện và tìm thấy trong

78% số mẫu mô bệnh nhân UTVH Sản

phẩm ARN thông tin của LMP-1 là kết quả

ghép-nối (splicing) của 3 chuỗi exon, chịu

trách nhiệm tổng hợp protein màng có phân

tử lượng là 63 kDa LMP-1 có mức độ biến

đổi cấu trúc rất cao giữa các chủng, đặc

biệt ở vùng gen của exon 3 tại đầu 3’, trong

đó có những chủng EBV phân lập ở Việt

Nam [4, 7]

Trong nghiên cứu này sử dụng phản

ứng PCR, kỹ thuật dòng hóa và giải trình tự

để xác định sự tồn tại đoạn gen LMP-1 của

EBV trong mẫu mô sinh thiết của 3 BN được

chẩn đoán xác định là UTVH

ĐèI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

nghiªn cøu

1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu mô sinh thiết của BN UTVH tại

Bệnh viện Tai Mũi Họng TW được sử dụng

để tách ADN tổng số, bao gồm cả hệ gen

của virut

2 Phương pháp nghiên cứu

* Phản ứng PCR:

Phản ứng PCR được thực hiện dùng cặp mồi do chúng tôi thiết kế như sau:

LMP1F (mồi xuôi):

5’-ATGGAACGCGACCTTGAGAG-3’

LMP1R (mồi ngược):

5’-TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC-3’

Sản phẩm của toàn bộ gen LMP-1 có kích thước 1,3 - 1,35 kb, thay đổi tuỳ từng chủng Chu trình nhiệt của phản ứng như sau:

940C 1 phút

550C 1 phút

720C 2 phút

35

40C Nhiệt độ bảo quản tạm thời sản phẩm

* Dòng hóa và giải trình trình tự:

Sản phẩm đoạn gen LMP-1 của EBV, sau khi tinh sạch, dòng hoá vào plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.) Chọn lọc và tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình của hãng Bioneer (Hàn Quốc) Trình

tự nucleotid ADN của plasmid tái tổ hợp mang gen LMP-1 được giải trình trên máy

tự động ABI-3100 Genetic Analyzer Phân tích chuỗi nucleotid bằng các chương trình SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu bằng chương trình GENEDOC 2.6.002 (http:// www.nrbsc.org/gfx/genedoc/)

28

KÕT QU Ả nghiªn cøu

VÀ BµN LU ẬN

Trang 3

1 Kết quả thực hiện PCR, dòng hoá

sản phẩm và tách dòng

Bằng cặp mồi LMP1F-LMP1R, sản phẩm

PCR thu được có kích thước dự kiến

khoảng 1.300 bp Kết quả điện di kiểm tra

sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trình

bày ở hình 1 cho thấy đoạn ADN của EBV

có độ dài khoảng 1.300 bp Như vậy, hệ

gen của EBV đã được tách từ mô sinh thiết

của BN UTVH và sau khi thực hiện PCR đã

cho sản phẩm ADN có chất lượng và kích

thước phù hợp

Hình 1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm

PCR trên thạch agarose 0,8% M: Thang

chuẩn ADN Đường chạy 1 - 3: sản phẩm

PCR 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3

Kiểm tra sản phẩm dòng hóa bằng điện

di trên thạch agarose 0,8% (hình 2) Khi cắt

ADN plasmid tái tổ hợp có chứa sản phẩm

PCR (gen LMP-1) đã cho 2 băng ADN: 3,9

kb của vector và khoảng 1.300 bp của gen LMP-1 đang nghiên cứu

H×nh 2: Kết quả t¸ch dßng đoạn gen LMP-1

EBV trên thạch agarose 0,8% M: Thang chuẩn AND Đường chạy 1 - 3: sản phẩm tách dòng 3 mẫu ADN lần lượt của BN 1, 2, 3

2 Kết quả giải trình tự gen LMP-1

Đoạn ADN thu được gọi là khung gen của LPM-1, kích thước khoảng 1,3 kb, chính xác hơn sau khi phân tích là 1.268

bp, bao gồm 3 exon và 2 intron, có cấu trúc giống như tất cả các khung gen LMP-1 của các chủng trên thế giới [4]

30 60 90 120 ATGGAACGCGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCCACGGCCCCCTCTAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCATAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTGCTCTTGGCGCTACTGTTCTGGCTG

M E R D L E R G P P G P P R P P L G P P L S S S I G L A L L L L L L A L L F W L>

EBVS7-VN-mRNA _>

150 180 210 240 TATATCATTATGAGTGACTGGGCTGGAGGAGCGCTCCTTGTCCTCTATGCCTTTGCTCTAATGCTTATTATTATCATTCTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTT

Y I I M S D W A G G A L L V L Y A F A L M L I I I I L I I F I F R R D L L C P L>

270 300 330 360 GGAGGTTTTGGTCTACTCCTACTGATGATCACCCTCCTGCTCATCGCTCTTTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTACCTTGGAATTGTGCTGCTCATCTTCGGCTGCTTACTTGTCTTA

G G F G L L L L M I T L L L I A L W N L H G Q A L Y L G I V L L I F G C L L V L>

390 420 450 480 GGTCTCTGGATCTACTTCTTGGAGATTCTCTGGCGGCTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCATCCTAGCCTTCTTCCTAGACATCATCCTGCTTATTATTACTCTCTATCTA

G L W I Y F L E I L W R L G A T I W Q L L A F I L A F F L D I I L L I I T L Y L>

510 540 570 600 CAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCCATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGACAACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCC

Q Q N W W T L L V D L L W L L L F L A I L I W M Y Y H G Q R H T D E H H H D D S>

630 660 690 720 CTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTAGCCATGAATCTGACTCTAACTCCAACGAGGGCAGACACCACCTGCTCGTAACTGGAGGCGCCGACGGACCCCCACTCTGCTCTCAA

L P H P Q Q A T D D S S H E S D S N S N E G R H H L L V T G G A D G P P L C S Q>

750 780 810 840 AACCTACGCGCACCTGGATGTGGTCCTGACAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGCCAATGGCCCACAGGACCCTGACAACACTGATGACAATGGCCCACAGGACCCTGACACC

N L R A P G C G P D N G P Q D P D N T D A N G P Q D P D N T D D N G P Q D P D T>