nghiên cứu chế biến bột đạm từ sinh khối artemia bằng phương pháp sử dụng enzyme protease

Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia bằng enzyme Flavourzyme.. Nghiên cứu này cũng cho thấy có thể sử dụng prot

Trang 1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Chế biến sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường -Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cám ơn: TS Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, TS Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS TS Trần Thị Luyến, TS Nguyễn Thị Nga, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường cùng các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, quý thầy cô giáo Khoa Chế biến, gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

Trang 3

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ARTEMIA VÀ MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ARTEMIA 3

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE 6

1.3 GIỚI THIỆU VỀ BỘT ĐẠM THỦY PHÂN 11

CHƯƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Các phương pháp phân tích 16

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 17

2.2.2.1 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sinh khối Artemia bằng enzyme protease 17

2.2.2.2 Thử nghiệm sản xuất bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia 22

2.3 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM VÀ HÓA CHẤT 23

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 24

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SƠ BỘ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN SINH KHỐI ARTEMIA 25

3.1.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu Artemia 25

3.1.2 Nghiên cứu bảo quản sinh khối Artemia 26

3.2 CHỌN LOẠI ENZYME PROTEASE THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 29

Trang 4

3.3 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY

PHÂN SINH KHỐI ARTEMIA BẰNG FLAVOURZYME 34

3.3.1 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân Artemia 34

3.3.2 Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân sinh khối Artemia 39

3.3.3 Xác định tỷ lệ Flavourzyme thích hợp cho quá trình thủy phân 43

3.3.4 Xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân 48

3.3.5 Xác định tỷ lệ ethanol bổ sung thích hợp cho quá trình phòng thối 53

3.3.6 Xác định thời gian thủy phân 57

3.4 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN TỪ SINH KHỐI ARTEMIA VÀ SẢN XUẤT THỬ SẢN PHẨM 61

3.4.1 Quy trình sản xuất bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia 61

3.4.2 Sản xuất thử sản phẩm bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 76

Trang 5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Kí hiệu

DHA Docosahexaenoic acid

ĐC Đối chứng

EPA Eicosapentaenoic acid

HUFA Acid béo chưa bão hòa bậc cao (Highly Unsaturated Fatty Acids)

(có mạch từ 20 carbon trở lên và có từ 4 – 6 nối đôi) MUFA Acid béo bão hòa một nối đôi

Naa Nitơ acid amin

NTS Nitơ tổng số

NNH3 Nitơ Amoniac

pHopt pH thích hợp

PUFA Các acid béo chưa bão hòa có nhiều nối đôi (Polyunsatured fatty

acids) (có từ 2 nối đôi trở lên) SFA Các acid béo bão hòa (Satured fatty acids)

topt Nhiệt độ thích hợp

Trang 6

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1 Thành phần acid amin của sinh khối Artemia 25

2 Bảng 3.2 Thành phần hóa học của sinh khối Artemia (% so với

trọng lượng khô)

26

3 Bảng 3.3 Thành phần acid béo của sinh khối Artemia 26

4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian bảo quản và NaHSO3 tới sự thay

đổi trạng thái cảm quan của sinh khối Artemia tươi

27

5 Bảng 3.5 Kết quả phân tích hàm lượng NNH3 và Naa của sinh

khối Artemia

28

6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của loại enzyme tới sự thay đổi trạng thái

cảm quan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

30

7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi trạng thái cảm

quan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia bằng enzyme

Flavourzyme

35

8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của pH tới sự thay đổi trạng thái cảm quan

của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia bằng enzyme

Flavourzyme

39

9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bổ sung tới sự thay đổi

trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

bằng enzyme Flavourzyme

44

10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung tới sự thay đổi

trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân Artemia bằng

enzyme Flavourzyme

49

11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol bổ sung tới sự thay đổi

trạng thái cảm quan của các mẫu thủy phân Artemia bằng

enzyme Flavourzyme

53

Trang 7

12 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của thời gian tới sự thay đổi trạng thái

cảm quan của các mẫu thủy phân Artemia bằng enzyme

Flavourzyme

58

13 Bảng 3.13 Kết quả đánh giá trạng thái cảm quan của bột đạm

thủy phân từ sinh khối Artemia

63

14 Bảng 3.14 Kết quả kiểm vi sinh của bột đạm thủy phân từ sinh

khối Artemia

63

15 Bảng 3.15 Thành phần acid amin trong bột đạm thủy phân 64

16 Bảng 3.16 Thành phần acid béo trong bột đạm thủy phân 64

17 Bảng 3.17 Sơ bộ hạch toán giá thành cho bột đạm thủy phân từ

sinh khối Artemia

66

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 2.1 Hình ảnh về sinh khối Artemia salina 16

2 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại protease thích hợp

cho quá trình thủy phân

17

3 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp cho

quá trình thủy phân

18

4 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp cho quá

trình thủy phân

19

5 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ enzyme bổ sung

thích hợp cho quá trình thủy phân

20

6 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nước bổ sung thích

hợp cho quá trình thủy phân

21

7 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ ethanol bổ sung

thích hợp cho quá trình thủy phân

22

8 Hình 2.8 Hình ảnh về máy so màu UV/VIS 23

9 Hình 2.9 Hình ảnh về máy li tâm lạnh Rotina – Đức 23

10 Hình 2.10 Hình ảnh về máy sấy hút chân không - Hàn Quốc 24

14 Hình 3.3 Ảnh hưởng của loại enzyme tới sự biến đổi hàm

lượng Naa của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

31

lượng NNH3 của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

31

Trang 9

lượng protein hòa tan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

32

lượng peptid của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

32

18 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự biến đổi hàm lượng

Naa của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

36

NNH3 của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

36

protein hòa tan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

37

peptid của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

37

22 Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH tới sự biến đổi hàm lượng Naa

của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

40

23 Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH tới sự biến đổi hàm lượng NNH3

41

24 Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH tới sự biến đổi hàm lượng

protein hòa tan của các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

41

25 Hình 3.14 Ảnh hưởng của pH tới sự biến đổi hàm lượng peptid

42

26 Hình 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme tới sự

biến đổi hàm lượng Naa của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

45

biến đổi hàm lượng NNH3 của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

45

biến đổi hàm lượng protein hòa tan của mẫu thủy phân sinh

khối Artemia

46

biến đổi hàm lượng peptid của mẫu thủy phân Artemia

46

Trang 10

30 Hình 3.19 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước tới sự biến đổi hàm lượng

Naa của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

50

NNH3 của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

50

protein hòa tan của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

51

peptid của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

51

34 Hình 3.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol tới sự biến đổi hàm

lượng Naa của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

54

lượng NNH3 của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

55

lượng protein hòa tan của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

55

lượng peptid của mẫu thủy phân sinh khối Artemia

56

38 Hình 3.27 Sự biến đổi hàm lượng Naa theo thời gian thủy phân 59

39 Hình 3.28 Sự biến đổi hàm lượng NNH3 theo thời gian thủy

Trang 11

MỞ ĐẦU

Artemia là tên của một loài giáp xác nhỏ sống ở những vùng nước mặn có biên

độ mặn rộng từ vài phần nghìn đến 250‰ Trong tự nhiên người ta thường gặp

Artemia sống ở các hồ nước mặn Từ những năm 30 của thế kỷ trước, người ta biết

đến Artemia là do phát hiện thấy Artemia chính là loại động vật giàu protein nên rất

thích hợp cho việc dùng làm thức ăn để ương nuôi các loài động vật thủy sản như tôm, cá, động vật thân mềm…

Ở Trung Quốc, người ta thu nhận hàng ngàn tấn sinh khối Artemia từ các

ruộng muối ở vịnh Bohai và sử dụng làm thức ăn cho tôm thẻ trong các trại giống

tại vịnh Bohai và trên toàn Trung Quốc Ngoài ra Artemia cũng được sử dụng làm thức ăn nuôi cá cảnh Hiện nay, hơn 95% sinh khối Artemia được dùng làm thức ăn nuôi

cá cảnh dưới dạng đông lạnh Thái Lan và Singapore là hai nước sử dụng nhiều nhất sinh

khối Artemia cho nghề nuôi cá cảnh

Từ đầu thập niên 80, Artemia du nhập vào Việt Nam dưới dạng thức ăn dùng cho nuôi ấu trùng tôm càng xanh, sau đó Artemia được nuôi thử nghiệm ở Cam

Ranh - Nha Trang (1982), trên đồng muối Vĩnh Châu - Bạc Liêu, Phan Thiết

(1991), Vũng Tàu (1995) Hiện nay Artemia đã trở thành một đối tượng nuôi phổ

biến ở đồng muối của diêm dân vùng ven biển Sóc Trăng - Bạc Liêu

Hiện tại các nghiên cứu về việc chế biến Artemia còn rất hạn chế Artemia chủ

yếu được sử dụng dưới dạng sinh khối tươi dùng làm thức ăn nuôi ấu trùng tôm càng xanh, cua, tôm biển và cá cảnh dưới dạng tươi sống đông lạnh Hiện Trường

Đại học Nha Trang đang thực hiện đề tài nghiên cứu “Thử nghiệm nuôi thu sinh

khối Artemia salina trong ao đất tại ruộng muối ở Cam Ranh” Kết quả bước đầu

cho thấy việc nuôi Artemia tại các đồng muối có rất nhiều triển vọng: với diện tích

thử nghiệm khoảng gần 500m2, cứ 2 ngày thu sinh khối 1 lần với khối lượng sinh

khối thu được trên 4kg Tuy vậy sinh khối Artemia chủ yếu mới dùng ở dạng trực

tiếp cho việc ương nuôi tôm giống Phần sinh khối dư thừa hiện chưa biết sử dụng

cho mục đích gì Do vậy việc “Nghiên cứu chế biến bột đạm từ sinh khối Artemia

bằng phương pháp sử dụng enzyme protease” là cần thiết với mục đích chế biến

Trang 12

sinh khối Artemia thành dạng bột đạm thủy phân nhằm tìm kiếm khả năng sử dụng

nguồn bột đạm này trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm hay các lĩnh vực khác góp phần mở rộng đầu ra cho nguồn sinh khối giàu protein này

Nội dung của đề tài:

1) Tìm biện pháp giữ tươi sinh khối Artemia thu từ các đồng muối dùng làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu

2) Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân protein của sinh khối Artemia

3) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sinh khối Artemia

để sản xuất bột đạm thủy phân

4) Đề xuất quy trình sản xuất bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia, sản xuất thử bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia và đánh giá chất lượng sản phẩm bột đạm thủy phân

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Kết quả nghiên của luận văn là các số liệu thực tế bổ sung vào kho tàng kiến thức phục vụ cho việc giảng dạy về enzyme protease tại Trường Đại học Nha Trang Mặt khác, thành công của luận văn còn là cơ sở cho việc sử dụng sinh khối

Artemia trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm - nền tảng cho việc mở rộng đầu ra

cho nghề nuôi Artemia phát triển rộng rãi

Trang 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ARTEMIA VÀ MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ARTEMIA

Artemia thuộc lớp giáp xác, có hệ thống phân loại như sau: ngành

(Arthropoda), lớp (Crustaceae), lớp phụ (Branchiopoda), bộ (Anostraca), họ (Artemiidae), giống (Artemia, Leach 1819) Trong các dòng Artemia lưỡng tính

hoặc dị hợp tử (quần thể bao gồm con đực và con cái) đã xác định có tất cả sáu loài

anh em như sau: Artemia salina gặp ở Lymington - Anh, Artemia tunisiana gặp ở Châu Âu, Artemia franciscana gặp ở Châu Mỹ (Bắc, Trung và Nam Mỹ), Artemia

perrsimilis gặp ở Argentina, Artemia urmiana gặp ở Iran, Artemia monica gặp ở

Mono Lake, CA-USA (Theo P Sorgeloos,1986) Vì thế theo các nhà khoa học nên

sử dụng tên Artemia để gọi các quần thể Artemia mới chỉ khi chúng có đủ bằng

chứng về sinh hoá, di truyền tế bào hoặc hình thái để định rõ tên loài thì mới gọi theo tên loài

Artemia được biết đến vào những năm đầu thập niên 30 khi người ta phát hiện

ra chúng là loại thức ăn sống có giá trị dinh dưỡng cao dùng cho việc ương nuôi các giống thủy sản như tôm cá và động vật thân mềm Người ta ước tính mỗi năm trên

thế giới sử dụng khoảng 2.000 tấn trứng Artemia khô và nhu cầu ngày càng tăng

cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành nuôi trồng thủy sản trên toàn cầu Mặc

dù Artemia phân bố rộng trên toàn thế giới nhưng không phải nơi nào cũng có Trong tự nhiên Artemia chỉ có ở một số vùng như: vịnh San Francisco, hồ muối

Greate (Great Salt Lake - Mỹ), vịnh Bohai (Trung Quốc)…

Artemia được thu từ hai nguồn chính: khai thác tự nhiên và ương nuôi ở các

ruộng muối hoặc các hồ nước mặn Cho đến nay, nguồn cung cấp Artemia chủ yếu

là Mỹ và Trung Quốc Năm 2000 sản lượng trứng Artemia ở Mỹ đạt 8200 tấn và

duy trì ở mức 8314 tấn trong các năm 2001, 2002 Trong khi đó sản lượng thu hoạch ở hồ Urmia xấp xỉ 100 tấn và ở vịnh Bohai từ 800 – 1.000 tấn Tuy nhiên

theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì sản lượng Artemia ở các vùng này ngày

càng giảm mạnh [17, 30] Do tình hình khai thác ngoài tự nhiên không ổn định nên

một số nước như Brazil, Australia, Philippine và Thái Lan đã du nhập Artemia và

Trang 14

ương nuôi trên ruộng muối Việc du nhập Artemia nuôi trên ruộng muối nhìn chung

đã mang lại một số lợi ích thiết thực Một số khu vực của Đông Nam Á có diện tích

sản xuất muối lớn nhưng không có Artemia phân bố tự nhiên như Thái Lan, Philippine và Việt Nam thì việc chủ động di giống và thuần hóa dòng Artemia thích

hợp cho việc nuôi trên ruộng muối sẽ làm tăng thêm nguồn thu nhập, đáp ứng phần

nào nhu cầu về trứng và sinh khối Artemia phục vụ cho nghề nuôi

Tại Philippine, vào tháng 2 năm 1977 từ 80g trứng Cyst dòng SFB được ấp nở

và đưa vào nuôi ở các ao có độ mặn 140ppt đến cuối năm 1978 đã thu được 35kg

trứng khô và 30 - 40kg Artemia sinh khối tươi Nephetonia A Jumalon (1987) đã

mô tả hệ thống chảy kết hợp - IFTS (Intergrated Flow Through System) đang được

ứng dụng và mang lại nhiều thành công cho nghề nuôi Artemia ở Philippine [ 20] Tại Thái Lan, Artemia được thả nuôi trên ruộng muối từ năm 1979, năng suất

bình quân trong 4 tháng là 75kg trứng khô/ha và 500 - 1000kg sinh khối tươi/ha/tháng W Tarnchalanukit và L Wongrat (1987) mô tả mô hình kết hợp tôm

- Artemia - muối (SAS, Shrimp Artemia Salt) cho năng suất trứng đạt 76,6 kg

khô/ha/vụ và 420kg sinh khối tươi/ha/vụ [ 73]

Đầu những năm 1980, Việt Nam hầu như chưa nghiên cứu về việc chế biến

Artemia Artemia được du nhập vào Việt Nam dưới dạng thức ăn dùng cho ấu trùng

tôm càng xanh Sau đó, Artemia bắt đầu được thả nuôi thử nghiệm ở Cam Ranh -

Nha Trang (1982), Bạc Liêu - Sóc Trăng (1982), Phan Thiết (1991) và Vũng Tàu

(1995) Mặc dù được thả nuôi thử nghiệm ở nhiều vùng nhưng Artemia được nuôi

khá thành công ở vùng ven biển Sóc Trăng - Bạc Liêu nhờ vào kỹ thuật nuôi

Artemia của Viện Khoa học Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ thông qua trại

thực nghiệm đặt tại Vĩnh Châu từ năm 1985 Lợi nhuận từ Artemia mang lại cao

gấp 2-3 lần so với nghề muối truyền thống, giúp khắc phục hạn chế của nghề muối vốn có năng suất thấp của Sóc Trăng - Bạc Liêu

Lê Thị Ngọc Anh và Dương Thị Thuận (1978) đã tiến hành thử nghiệm nuôi

Artemia trong phòng thí nghiệm, sử dụng thức ăn là lòng đỏ trứng gà và cám sấy

nghiền nhỏ, rây kỹ pha theo tỷ lệ 1g/l - môi trường cám cho Flagella được hấp thanh trùng bằng nồi Autolave ở 1200C trong 30 phút Nước dùng để thí nghiệm là nước biển tự nhiên có độ mặn 30-35 ppt, môi trường được khấy đảo liên tục bằng máy

Trang 15

sục khí, 3 ngày thay nước một lần Nhiệt độ môi trường từ 280C – 310C, ban ngày

được chiếu sáng bằng ánh đèn neon 1,2m (500lux) Kết quả cho thấy ấu thể Artemia

mới rời vỏ trứng dài khoảng 500µm, sau 2 đến 3 giờ đạt 600µm, sau 24 giờ đạt 1000µm Sau 10 ngày nuôi có thể phân biệt đực cái, cá thể trưởng thành bắt đầu giao phối khi chiều dài đạt 6,5- 7mm, con dài nhất đạt 11,5mm Thời gian khép kín vòng đời là 15-20 ngày Trong môi trường cám gạo, ấu thể đạt chiều dài trung bình 3,72mm sau 7 ngày nuôi Ngoài ra, thí nghiệm cũng xác nhận sự phát triển của một loại tảo đơn bào có kích thước trung bình 6µm là loại thức ăn chất lượng cho

Artemia [1]

Việc đưa Artemia vào đồng muối cũng được nhiều trung tâm nghiên cứu: Viện

Nghiên cứu Biển Nha Trang (Vũ Đỗ Quỳnh và Nguyễn Thị Diệu Huyền, 1983); Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I (Vũ Dũng,1984); Trường Đại học Cần Thơ

(Trương Quan Trí và cộng tác viên, 1983) [2, 3] Sau đó, quần thể Artemia đã được

thuần hóa vào đồng muối Cam Ranh và phát triển trong điều kiện tự nhiên ở các

đồng muối lân cận Hiện ba dòng Artemia từ Macau, Great Salt Lake và Tientsin

(Trung Quốc) đã được thuần hóa và đưa vào ruộng muối để kiểm tra khả năng thuần

hóa và thu trứng bào xác tại Việt Nam Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Artemia

- tôm (Đại học Cần Thơ) đã có những khảo sát chi tiết về ảnh hưởng của thức ăn,

nhiệt độ, độ mặn đến tuổi thọ, chu kỳ sống của các dòng Artemia này

Năm 1991, Vũ Dũng tiến hành xây dựng quy trình nuôi Artemia ở đồng muối Ninh Hải, Cà Ná Tác giả đã nuôi bảy dòng Artemia khác nhau trong bể kính 30 lít

bằng thức ăn tảo và kiểm tra các chỉ tiêu sinh học chọn dòng tốt để đem ra nuôi ở

ruộng muối Kết quả cho thấy dòng Artemia từ vịnh San Francisco có kích thước

Cyst và Nauplius nhỏ, thành thục sớm, sức sinh sản cao, thích hợp nuôi ở miền

Trung Độ muối trên 80‰ kích thích các dòng Artemia đẻ con, độ muối từ

80-120‰ cho năng suất trứng cao nhất và độ muối là một trong các yếu tố chi phối

việc đẻ con hay đẻ trứng của Artemia [14]

Năm 1997, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Vũ Đỗ Quỳnh, Nguyễn Văn Hoà, Peter

Beart [3] tiến hành đánh giá tiềm năng thu sinh khối Artemia trên ruộng muối Vĩnh

Châu Năm 1998, Nguyễn Ngọc Lâm và Vũ Đỗ Quỳnh đã nghiên cứu sinh sản

Artemia trong điều kiện tự nhiên ở đồng muối Cam Ranh Kết quả nghiên cứu cho

Trang 16

thấy rằng độ muối ảnh hưởng rất lớn đến sinh sản của Artemia Khi độ muối giảm

sản lượng trứng bào xác giảm dần, mật độ cá thể cái tham gia sinh sản thấp, sức sinh sản kém…

Năm 1999, Trương Sĩ Kỳ và Nguyễn Tấn Sỹ đã nuôi Artemia franciscana

trong ao đất tại Đồng Bò, Nha Trang, thu sinh khối làm thức ăn cho sản xuất giống

và nuôi thương phẩm cá ngựa đen Mật độ cấy giống 100 con/ 1 lít, nuôi trong ao đất diện tích 300m2, độ sâu 0,5 - 0,8m, độ muối 70 - 80‰

1.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PROTEASE

Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (- CO - NH-) trong phân tử protein, polypeptid và các cơ chất tương tự theo cơ chế sau:

H2N - CH - CO - NH - CH - CO - … - NH - CH - COOH + (n-1)H2O

H2N - CH - COOH + NH - CH - COOH + …+ H2 N - CH - COOH

Trong các protease thì nhóm protease tiêu hóa được nghiên cứu sớm và nhiều hơn cả Ngay từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học Reomur đã phát hiện ra trong dạ dày của chim có tác nhân xúc tác cho quá trình thủy phân protein Sau đó vào năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động thủy phân protein của tác nhân có trong dịch

vị và 30 năm sau người ta tách được thủy phân protein mà ngày nay gọi là pepsin [7, 10]

Năm 1857, Corvisat tách được trypsin từ dịch tụy đây là protease tách được dưới dạng chế phẩm, nhưng chưa được tinh sạch Năm 1861, Bruke tách được pepsin ở dịch dạ dày chó dưới dạng tương đối tinh khiết [27]

Năm 1862, Danivevski đã tách được trypsin, amylase tụy tạng bằng phương pháp hấp phụ [15]

Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật, thực vật

và đặc biệt từ vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu [34, 35] Trong thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về các protease vi sinh vật

và đã đạt được nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực này

Protease

Trang 17

Năm 1970, Kerry T Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết

protease trung tính từ môi trường nuôi B.subtilis theo phương pháp bán rắn và nhận

thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động,

có pHopt từ 6,5-7,5, t0opt là 570C Protease này bị ức chế bởi Cu2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+,

Cd2+,Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ thì enzyme này có thể bền trong khoảng pH từ 5,5-10 [51]

Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease tách

từ Bacillus megaterim ATCC 14945 và nhận thấy protease này có thể bị kết tủa

bằng amonium sulphate, có pHopt 7,5, nhiệt độ tối thích 550C, protease này cần có ion Ca2+ và bị ức chế mạnh bởi EDTA [41]

Lin Fa Wan và Devenish Rj (1993) tiến hành chuyển gen (nprE) tổng hợp

protease trung tính của vi khuẩn B.subtilis vào nấm men S.cerevisiae [53]

Gonchar Am và Auslender VI (1996) đã tiến hành nghiên cứu cố định các

protease của vi khuẩn B.subtilis trên 1,4 – polyalkylene oxid bằng phương pháp

chiếu chùm tia electron và chỉ ra rằng các protease cố định bền với nhiệt hơn các protease dạng tự nhiên [45]

Năm 1994, Bombara và một số tác giả khác đã nghiên cứu về protease trung

tính ở A.oryzae và nhận thấy rằng đó là một protease kiềm, trong cấu trúc có 3 cầu

disunfid nội phân tử Enzyme này không bền sau 10 phút xử lý ở 750C cho đến

1000C Đặc tính bền nhiệt này của enzyme là do các liên kết disulfid trong enzyme quyết định [36]

Để tăng độ bền nhiệt của protease kiềm từ A.oryzae các nhà khoa học Nhật

Bản đã tiến hành gây đột biến ở chủng nấm mốc này để tạo ra một liên kết disunfid

trong phân tử protease Kết quả là protease ban đầu của nấm mốc A.oryzae có nhiệt

độ tối thích ở 510C nhưng sau khi gây đột biến ở đoạn Cys 169 và Cys 200 thì enzyme này có nhiệt độ tối thích ở 560C

Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu về protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme này trong các

Trang 18

lĩnh vực đời sống Hiện nay số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới ở các nước phát triển chủ yếu là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD Hàng năm trên thế giới có khoảng 600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật, trong đó khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản,

Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng prortease từ vi sinh vật Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzyme nói chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ Chính vì thế nhịp độ sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng từ 5% ÷15% Ngày nay nhờ ứng dụng các kỹ thuật mới mà người ta có thể sản xuất các enzyme protease cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng lại enzyme nhiều lần Vì vậy mà việc ứng dụng enzyme protease ngày càng gia tăng [15, 31]

Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng protease, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh chế, nghiên cứu một số đặc tính của enzyme… Một số công trình nghiên cứu về protease tại Việt Nam như:

Nguyễn Lân Dũng, Đào Trọng Hùng và Ngô Khắc Truy (1964) đã nghiên cứu

sử dụng protease A.oryzae cho thấy có thể sử dụng enzyme này để rút ngắn thời

gian chế biến nước mắm Sau đó tác giả Nguyễn Lân Dũng và Phạm Văn Ty (1967)

còn tiến hành trộn trực tiếp một số chủng nấm mốc Aspergillus có khả năng sản

xuất protease với cá và giữ ở 550C trong khoảng 1 - 3 ngày, kết quả nghiên cứu cho thấy cá được thủy phân nhanh hơn [18]

Một số cán bộ Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng (1975) đã nghiên cứu cho

thấy khi bổ sung 1% protease B.pumillus vào hỗn hợp cá làm nước mắm thì sau 24

giờ dịch thủy phân có màu cánh dán, vị ngọt và có hàm lượng đạm cao hơn mẫu đối

chứng Như vậy có thể dùng protease B.pumillus để làm tăng nhanh quá trình thủy

phân cá trong sản xuất nước mắm

Trang 19

Năm 1983 Phạm Thị Trân Châu công bố các nghiên cứu về protease

B.pumillus cho thấy từ môi trường nuôi cấy B.pumillus có thể thu được hai protease:

một protease kiềm điển hình hoạt động ở pH 10,7 và một protease trung tính nhạy cảm với DFP gọi là serine- metalo - proteinase hoạt động ở pH 7,0 Mặt khác các nghiên cứu của tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease này trong chế biến cá đem lại hiệu quả kinh tế cao [11]

Phạm Thị Trân Châu và cộng sự (1987) đã nghiên cứu một số tính chất của bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa có chứa 2 protease và bromelain chồi dứa có hoạt tính cực đại ở pH 6,5, nhiệt độ tối thích 600C Tới năm

1997, Lê Thị Thanh Mai tiếp tục nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain đã cho thấy có thể thu nhận bromelain theo kết tủa bằng aceton hay

cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton cũng như có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp lọc gel sephadex G-75 với hiệu suất cao Các nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm [12]

Năm 1992, Nguyễn Thị Vĩnh và cộng sự nghiên cứu về protease dịch chiết thịt rắn hổ mang đã thu được 2 protease là: một protease kim loại gọi là proteinase P-I

có pH tối thích 7,0 bị kìm hãm bởi EDTA và có thể phục hồi 71 % hoạt tính sau kìm hãm bằng Zn2+ hay hỗn hợp Zn2+ và Ca2+ Protease thứ hai là một proteinase – thiol gọi là proteinase P-II có pH thích hợp 6,0 và có thể tinh sạch enzyme này qua cột SE-sephadexG-50 [31]

Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự (1993) đã nghiên cứu và cho thấy có thể dùng

môi trường nuôi chứa protease của nấm mốc A.oryzae 29A để rút ngắn thời gian chế

biến nước mắm [18]

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm cho thấy khi tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex G-75 thu được hai protease có nhiệt độ thích hợp ở 500C, 600C và pH thích hợp tương ứng là 8,5 và 7,5 Tác giả còn cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm trong thủy phân thu bột đạm từ phế liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [21]

Trang 20

Tác giả Đặng Văn Hợp (2000) công bố nghiên cứu về protease của A.oryzae A4 cho thấy có thể thu nhận protease từ môi trường nuôi cấy A.oryzae A4 theo

phương pháp bề mặt và thu chế phẩm protease kỹ thuật từ canh trường nuôi theo cách chiết rút bằng nước cất rồi kết tủa bằng amonium sunphate [18]

Năm 2003, Vũ Ngọc Bội công bố các nghiên cứu về protease của B.subtilis S5 cho thấy khi nuôi B.subtilis S5 theo phương pháp nuôi bán rắn với môi trường nuôi

chứa: bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc và khoáng chất; nhiệt độ nuôi ban đầu là 30

320C; thời gian nuôi cấy 41 giờ trong điều kiện có thông gió và giữ ẩm Sau khi ngừng quá trình nuôi sấy khô ở nhiệt độ 500C thu được canh trường chứa protease

B.subtilis S5 có hoạt độ enzyme là 33UI/g Protease B.subtilis S5 có pHopt 6,0  6,5;

topt 550C và không bền ở nhiệt độ từ 600C trở lên Tác giả đã sử dụng sử dụng

protease B.subtilis S5 trong thủy phân cá cơm để sản xuất nước mắm ngắn và nhận thấy khi sử dụng protease B.subtilis S5 có thể rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm

mà hiệu suất thu nước mắm cao đạm cao hơn phương pháp truyền thống Còn khi

sử dụng protease B.subtilis S5 để thủy phân cá mối thì thời gian thủy phân ngắn và

bột đạm thu được có hàm lượng acid amin tự do cao hơn các phương pháp sản xuất

sử dụng các enzyme protease khác [6, 7]

Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) công bố các nghiên cứu về protease đầu tôm

bạc nghệ (Metapenaeus brevicornis) cho thấy protease đầu tôm bạc nghệ có pHopt

9,0; t0opt 500C và không bền ở nhiệt độ từ 550C trở lên Nghiên cứu này cũng cho thấy có thể sử dụng protease này trong sản xuất bột đạm thủy phân từ thịt cá mối với tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân là 4%, tỷ lệ nước bổ sung thích hợp là 20% và tỷ lệ muối ăn bổ sung thích hợp là 2% Bột đạm thu được có hàm lượng acid amin tự do cao, mùi thơm và hoàn toàn đạt tiêu chuẩn vi sinh vật [31]

Đỗ Văn Ninh (2004) công bố các nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng

cá và gan mực cho thấy chế phẩm protease thu được từ nội tạng cá và gan mực là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ thích hợp từ 50  550C và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thủy phân cơ thịt cá để sản xuất dịch đạm thủy phân ứng dụng trong sản xuất pasta cá cũng như bột dinh dưỡng [27]

Trang 21

Các công trình nghiên cứu trên đã góp phần thúc đẩy lĩnh vực nghiên cứu về protease ở nước ta phát triển Tuy nhiên với mỗi lọai nguyên liệu khác nhau lại cần một lọai enzyme protease cũng như điều kiện thủy phân khác nhau … Chẳng hạn

để tăng quá trình thủy phân rút ngắn thời gian chế biến nước mắm người ta đã tiến hành tạo nhiệt độ thích hợp cho protease hoạt động hay làm giảm độ mặn ban đầu của khối cá cũng như làm tăng diện tích tiếp xúc giữa protease với cá bằng cách xay nhỏ cá Các nghiên cứu ứng dụng protease trong chế biến thủy sản đặc biệt là trong chế biến nước mắm đã tiến hành nghiên cứu từ giai đoạn thô sơ nhất như bổ sung

đu đủ xanh, vỏ dứa, ruột lợn, ruột cá để tăng quá trình thủy phân nước mắm Sau đó

đến giai đoạn nghiên cứu bổ sung thêm hỗn hợp nuôi cấy B.subtilis, rồi dùng dung dịch nuôi cấy B.pumilus, tiến tới giai đoạn cao hơn dùng chế phẩm enzyme thêm

vào quá trình thủy phân như: thêm chế phẩm bromelain, thêm chế phẩm protease

A.oryzae, thêm chế phẩm protease từ đầu tôm, thêm chế phẩm protease thu nhận từ

canh trường nuôi B.subtilis S5 hay chế phẩm protease thu nhận từ nội tạng cá hay

gan mực,… Những kết quả nghiên cứu trên đều cho thấy khi bổ sung thêm protease vào hỗn hợp thịt cá thì quá trình thủy phân nhanh hơn Vì vậy có thể nói việc nghiên cứu sử dụng protease nói chung và protease từ vi sinh vật nói riêng trong chế biến Thủy sản đã đạt được những thành công đáng khích lệ cần được tiếp tục đẩy mạnh nghiên cứu hơn nữa để có thể ứng dụng trong thực tế sản xuất Tuy vậy để ứng dụng enzyme protease một cách hiệu quả cần các nghiên cứu cụ thể cho từng loại nguyên liệu

1.3 GIỚI THIỆU VỀ BỘT ĐẠM THỦY PHÂN [7, 27, 31]

Cá là đối tượng thích hợp để sản xuất bột đạm thủy phân Bột đạm thủy phân

từ cá thường có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid, khoáng chất và vitamin,

… Đặc biệt, protein cá có chứa đầy đủ các acid amin không thay thế với số lượng

và tỉ lệ cân đối Lipid của động vật thủy sản nhất là cá rất dễ tiêu hóa và hấp thụ do giàu acid béo không thay thế Trong cá còn có rất nhiều phosphat, iod… là những chất chỉ có nguồn gốc từ biển Vì thế bột đạm từ cá thường có hàm lượng protein khoảng 70%, lipid khoảng 0,55% và có độ ẩm <10% Bột cá thường có tỷ lệ nitơ dễ

Trang 22

hấp thụ cao chiếm tới 25 ÷ 90% so với nitơ toàn phần, trong khi đó thức ăn thực vật chỉ có khoảng 30 ÷ 40% là nitơ dễ tiêu hoá Do vậy về mặt dinh dưỡng bột cá thực phẩm là loại thực phẩm tương đối đầy đủ chất dinh dưỡng và khá hoàn hảo Vì thế bột cá đạm thủy phân từ cá thường dễ tiêu hóa và rất hữu ích cho cơ thể con người

từ trẻ em tới người lớn tuổi Bột đạm từ cá thường được chia làm hai loại:

- Loại cao cấp dùng cho con người, đặc biệt là trẻ em

- Loại kém phẩm chất dùng cho thức ăn gia súc

Thực chất quá trình sản xuất bột đạm từ cá hay các nguyên liệu khác bằng phương pháp sử dụng enzyme protease là quá trình thủy phân protein tạo thành các acid amin dưới tác động của hệ protease nội tại và protease bổ sung từ bên ngoài Tuỳ điều kiện thủy phân và thời gian thuỷ phân và mà người ta có thể thu được peptid hay acid amin Quá trình thủy phân thường chịu ảnh hưởng của các yếu tố sau:

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thường có thể ảnh hưởng tới hoạt tính của nó Cũng như các enzyme khác, protease chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định, nhiệt độ thích hợp với đa số protease nằm trong khoảng 400C  500C Ở nhiệt độ lớn hơn 700C đa số protease bị mất hoạt tính Do vậy nhiệt độ 700C gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme Khi nhiệt

độ thấp hơn 00C protease bị biến tính thuận nghịch Trong phạm vi thích hợp nếu nhiệt độ tăng 100C thì tốc độ thủy phân tăng từ 1  2 lần

 Ảnh hưởng của pH môi trường

Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH môi trường Mỗi enzyme nói chung và protease nói riêng chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích pH tối thích của đa số protease nằm trong vùng trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu, chỉ có rất ít protease có thể hoạt động trong vùng rất acid chẳng hạn pepsin hay rất kiềm như trypsin

Trang 23

Thịt cá có thể bị thủy phân bởi protease bổ sung thêm từ bên ngoài và bị thuỷ phân bởi các protease nội tại có sẵn trong nguyên liệu như: cathepsin, pepsin, trypsin, chymotrypsin… Vì thế chúng ta phải chọn xem protease nào đóng vai trò là enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trường có pH thích hợp cho protease này Mặt khác giá trị pH sử dụng lại phải ít ảnh hưởng đến các protease khác

 Ảnh hưởng của nồng độ muối ăn

Trong quá trình thủy phân chúng ta thường bổ sung muối ăn bởi vì muối ăn có tác dụng ức chế hoạt động của vi sinh vật gây thối rữa và các loại vi sinh vật không chịu muối Nhưng nếu nồng độ muối bổ sung vào quá cao sẽ làm mất hoạt tính của protease, vì bản chất của enzyme cũng là protein nó cũng bị biến đổi bởi muối trung tính ở nồng độ cao Mặt khác khi bổ sung muối ăn với nồng độ cao sẽ làm sản phẩm

có vị mặn Vì vậy để chọn được nồng độ muối thích hợp bổ sung vào quá trình thủy phân, ta phải tiến hành thí nghiệm trên nhiều mẫu bổ sung các nồng độ muối khác nhau

 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc

Khi thủy phân, diện tích tiếp xúc giữa protease và cá cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân Để tạo điều kiện cho protease hoạt động người ta thường dùng lực cơ học như: xay nhỏ, đập dập, cắt khúc cá Khi diện tích tiếp xúc giữa protease với protein càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược lại

 Ảnh hưởng của nồng độ protease

Nếu chúng ta tăng nồng độ protease thì quá trình thủy phân xảy ra mãnh liệt Khi lượng protease bằng với nồng độ cơ chất, dù tăng tỷ lệ protease bổ sung thêm vào hỗn hợp thuỷ phân bao nhiêu đi nữa nhưng vận tốc của quá trình thủy phân rất

ít thay đổi

Trang 24

 Ảnh hưởng của thời gian

Thời gian thủy phân kéo dài hoặc rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân do tác động của protease Thời gian thuỷ phân càng dài thì protease càng có điều kiện để thuỷ phân protein thịt cá một cách triệt để Nhưng nếu thời gian thủy phân quá dài sẽ dẫn tới vi sinh vật hoạt động làm sản sinh ra các chất thứ cấp như: NH3, H2S, indol, scaptol, …, đồng thời khi thời gian thủy phân kéo dài dẫn tới hiệu quả kinh tế kém, chỉ thích hợp cho sản xuất ở quy mô thí nghiệm, trong sản xuất lớn khó áp dụng Thời gian thủy phân rút ngắn, sự thuỷ phân protein chưa triệt để, hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu

 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân

Nước là môi trường thuận lợi cho quá trình thuỷ phân protein bằng protease và nhưng nước cũng làm tăng hoạt động của vi sinh vật Do vậy, trong quá trình thủy phân thịt cá nếu ta bổ sung nước với tỷ lệ quá thấp thì hạn chế sự hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời cũng hạn chế sự hoạt động của protease làm giảm hiệu suất thủy phân Nhưng nếu bổ sung nước với tỷ lệ quá cao thì chính nước là môi trường thuận lợi để cho vi sinh vật hoạt động và phát triển làm phân huỷ sản phẩm thành các chất thứ cấp như: indol, scaptol, NH3, H2S,… làm ảnh hưởng đến chất lượng bột đạm Vì vậy để xác định lượng nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân người ta thường tiến hành thí nghiệm trên nhiều mẫu bổ sung nước với tỷ lệ khác nhau và từ kết quả thí nghiệm sẽ chọn được tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

 Loài cá

Mỗi loài cá khác nhau sẽ có hàm lượng protein khác nhau Cá có giá trị dinh dưỡng cao khi có đầy đủ các acid amin không thay thế với tỷ lệ cân đối Cá càng nhiều mỡ (cá béo) thì bột cá thành phẩm càng khó bảo quản dễ bị ôi hoá Do đó việc lựa chọn loại cá thích hợp rất quan trọng trong việc sản xuất bột đạm Thường người ta chọn những loại cá có giá trị kinh tế thấp cấu trúc cơ thịt lỏng lẻo như các loại cá tạp, nhưng có hàm lượng protein cao làm nguyên liệu để sản xuất bột đạm

Trang 25

thủy phân Bột đạm sản xuất từ những loại cá này có giá trị dinh dưỡng cao nhưng lại có giá thành rẻ hơn do cá tạp có giá trị kinh tế thấp hơn nhiều so với các loại nguyên liệu cá khác

 Độ tươi của nguyên liệu

Độ tươi của nguyên liệu có vai trò quan trọng quyết định chất lượng bột cá

Độ tươi nguyên liệu giảm thì làm giảm chất lượng của bột đạm thành phẩm Khi cá

ở giai đoạn thối rữa có sự phân hủy acid amin tạo thành những sản phẩm thứ cấp như: indol, scaptol, H2S, NH3,… vì thế làm giảm chất lượng của bột đạm Mặt khác, chất béo trong cá chứa nhiều acid béo chưa bão hoà, vì vậy bột cá sản xuất từ cá ươn dễ bị oxy hoá hơn so với bột cá sản xuất từ cá tươi Do đó ở giai đoạn tiếp nhận nguyên liệu phải kiểm tra kỹ lưỡng đảm bảo độ tươi để sản phẩm bột cá thành phẩm

có chất lượng cao

Ngoài ra, chất lượng bột đạm thủy phân từ thịt cá còn phụ thuộc vào chế độ sấy sản phẩm Khi sấy sản phẩm dịch đạm ở nhiệt độ cao và thời gian kéo dài sẽ làm bột đạm có mùi khét, màu sẫm lại do tạo ra phản ứng melanoidin và do phần lớn các acid béo chưa bão hoà bị oxy hoá Vì vậy phương pháp sấy sẽ ảnh hưởng đến chất lượng bột cá

Từ những phân tích ở trên cho thấy để có thể thu nhận được bột đạm thủy phân từ cá bằng phương pháp sử dụng protease cần phải tiến hành các nghiên cứu

từ lựa chọn loại enzyme protease phù hợp cho quá trình thủy phân đến nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, nhằm đảm bảo cho quá trình thủy phân đạt hiệu quả về công nghệ Như vậy quá trình nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia cũng phải tiến hành các bước nghiên cứu tương tự

Trang 26

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

* Nguyên liệu Artemia: Đề tài sử dụng sinh khối Artemia salina tươi (hình 2.1)

được thu nhận từ các đồng muối tại Cam Ranh, sản phẩm của đề tài “Thử nghiệm

nuôi thu sinh khối Artemia salina trong ao đất tại ruộng muối ở Cam Ranh” Sinh

khối Artemia salina sau khi thu nhận, bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí

nghiệm Công nghệ Sinh học - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang dùng làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu Từ các

trang sau của luận văn để cho tiện sử dụng tên Artemia salina được chúng tôi gọi tắt

là Artemia

Hình 2.1 Hình ảnh về sinh khối Artemia salina

* Enzyme protease: Luận văn sử dụng các chế phẩm protease thương mại của

hãng Novo - Đan Mạch bao gồm Neutrase, Flavourzyme và Protamex Neutrase có

t0opt 40 - 500C và pHopt: 7; Protamex có t0opt 500C và pHopt: 7- 8; Flavourzyme có t0opt

50 - 550C và pHopt: 6 - 7,5 Đây là các enzyme thương mại hiện đang có bán và được

sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam [6, 7, 10, 27, 30]

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các phương pháp phân tích

+ Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry

+ Định lượng peptid theo phương pháp dựa vào đường chuẩn tyrosine

+ Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjehldal

+ Xác định Naa theo phương pháp Sorensen

Trang 27

+ Xác định NNH3 theo phương pháp chưng cất lôi cuốn bằng hơi nước

+ Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet

+ Xác định thành phần các acid amin và acid béo bằng phương pháp sắc ký khí

+ Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C tới khối lượng không đổi theo TCVN 3700- 90

+ Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật theo TCVN

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.2.1 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sinh

khối Artemia bằng enzyme protease

Để có thể tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sinh khối

Artemia bằng enzyme protease của hãng Novo - Đan Mạch, tiến hành các thí

nghiệm như sau:

* Chọn loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân

Tiến hành bố trí thí nghiệm chọn lọai protease phù hợp cho quá trình thủy

phân sinh khối Artemia như sau:

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại protease thích hợp cho quá trình

Trang 28

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân sinh

khối Artemia bằng các loại enzyme protease khác nhau trong điều kiện cố định các

thông số: nhiệt độ, pH, tỷ lệ nước bổ sung, tỷ lệ enzyme bổ sung Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu phân tích: đánh giá cảm quan và xác định một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3

Từ đó lựa chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân

* Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ phù hợp cho quá trình thủy phân như sau:

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy

phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân

Artemia bằng protease đã lựa chọn ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau (nhiệt độ

thường (300C); 450C; 500C; 550C) với các thông số cố định như: pH, tỷ lệ nước bổ sung, tỷ lệ enzyme bổ sung Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3 Từ đó lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân

Protease đã lựa chọn

Trang 29

* Xác định ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

Để chọn được pH phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối Artemia, tiến

hành bố trí thí nghiệm như sau:

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu

sinh khối Artemia ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác

như: nhiệt độ, tỷ lệ enzyme: 0,3%, tỷ lệ nước bổ sung: 5% Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3 Từ đó lựa chọn pH thích hợp cho quá trình thủy phân

* Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân

Để chọn được tỷ lệ enzyme phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối

Artemia, tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:

Trang 30

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp cho quá

trình thủy phân

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu

thí nghiệm sinh khối Artemia ở các tỷ lệ enzyme khác nhau trong điều kiện cố định

các thông số khác như : nhiệt độ, pH, tỷ lệ nước bổ sung Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3 Từ đó lựa chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

* Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến quá trình thủy phân

Để chọn được tỷ lệ nước bổ sung phù hợp cho quá trình thủy phân sinh khối

Artemia, tiến hành bố trí thí nghiệm như hình 2.6 Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này,

đề tài sẽ tiến hành 4 mẫu thủy phân sinh khối Artemia ở các tỷ lệ nước bổ sung khác

nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và

NNH3 Từ đó lựa chọn tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân

Trang 31

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá

Từ sơ đồ bố trí thí nghiệm này, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu thủy phân 4 mẫu sinh

khối Artemia ở các tỷ lệ ethanol bổ sung khác nhau trong điều kiện cố định các

thông số khác như: nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme và tỷ lệ nước bổ sung Sau các thời điểm 0; 2; 4;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3 Từ

Trang 32

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ ethanol bổ sung thích hợp

* Xác định thời gian thủy phân

Để xác định thời gian thủy phân chúng tôi tiến hành thí nghiệm thủy phân sinh

khối Artemia bằng enzyme protease ở các điều kiện đã lựa chọn ở trên Sau các

khoảng thời gian: 2, 4, …, 20 h thủy phân, lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học như hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa và NNH3 Từ đó lựa chọn tỷ lệ thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân

2.2.2.2 Thử nghiệm sản xuất bột đạm thủy phân từ sinh khối Artemia

Sau khi chọn được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, tiến hành thử sản xuất bột đạm theo điều kiện tối ưu đã lựa chọn và phân tích đánh giá chất lượng của bột đạm qua các chỉ tiêu: thành phần hóa học, thành phần acid amin và thành phần acid béo của bột đạm sản xuất được

Trang 33

2.3 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM VÀ HÓA CHẤT

- Luận văn sử dụng các thiết bị hiện có trong phòng thí nghiệm: cân điện tử Shimazu (Nhật), loại 3200g và 220g độ chính xác 10-6 (g); Máy ly tâm lạnh Rotina - Đức; Lò nung Hàn Quốc (12000C); Máy sấy hút chân không - Hàn Quốc; Máy sắc

ký khí ;… Một số hình ảnh về thiết bị:

Hình 2.8 Hình ảnh về máy so màu UV/VIS

Hình 2.9 Hình ảnh về máy li tâm lạnh Rotina – Đức

Trang 34

Hình 2.10 Hình ảnh về máy sấy hút chân không - Hàn Quốc

Hình 2.11 Hình ảnh về máy sắc ký khí

- Các loại hóa chất sử dụng cho các phân tích sử dụng kỹ thuật cao như phân tích acid amin, peptid, acid béo, phân tích vi sinh đều là hóa chất tinh khiết của Merck - Đức Các hóa chất thông dụng: NaOH, HCl,… là hóa chất tinh khiết của Trung Quốc

Trang 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SƠ BỘ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN SINH KHỐI ARTEMIA

3.1.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu Artemia

Tiến hành lấy mẫu sinh khối Artemia để xác định thành phần hóa học cơ bản,

thành phần acid béo và thành phần acid amin Kết quả phân tích được thể hiện ở các bảng từ 3.1 3.3

Bảng 3.1 Thành phần acid amin của sinh khối Artemia STT Thành phần acid amin Hàm lượng (mg/kg)

Trang 36

Bảng 3.2 Thành phần hóa học cơ bản của sinh khối Artemia

(% so với trọng lượng khô)

Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy sinh khối Artemia có chứa hàm lượng

protein rất cao tới 68,8% và hàm lượng khoáng chất 10,2% tổng trọng lượng khô (bảng 3.2) Mặt khác, kết quả phân tích thành phần acid amin (bảng 3.1) cho thấy

sinh khối Artemia rất giàu acid amin không thay thế, đặc biệt là giàu Tyr, Lys, đây

là những acid amin kích thích tiêu hóa tạo cảm giác ngon miệng, thèm ăn ở con người và động vật nuôi Thêm vào đó khi phân tích thành phần acid béo (bảng 3.3 )

cho thấy sinh khối Artemia rất giàu các acid béo không thay thế mà đặc biệt là các

acid béo không no có nhiều nối đôi - thành phần rất cần thiết cho sự phát triển của

trẻ em và động vật nuôi còn non Kết quả này cho thấy sinh khối Artemia là nguồn dinh dưỡng quý Vì thế việc nghiên cứu chế biến sinh khối Artemia thành bột đạm

là cần thiết nhằm nâng cao khả năng sử dụng nguồn dinh dưỡng quý báu này

3.1.2 Nghiên cứu bảo quản sinh khối Artemia

Tiến hành thu sinh khối Artemia nuôi trong các ao đất tại ruộng muối ở Cam Ranh theo kỹ thuật đã được đề tài “Thử nghiệm nuôi thu sinh khối Artemia salina

trong ao đất tại ruộng muối ở Cam Ranh” nghiên cứu như sau: sau khi vớt sinh

khối Artemia bằng lưới, tạm thời giữ sinh khối thu được trong lưới đặt ở trong

Trang 37

ruộng nuôi, tiến hành sục khí mạnh để cung cấp oxy cho Artemia sống trong lưới

Sau đó rửa nhẹ sinh khối bằng nước biển và chuyển sinh khối đã rửa vào các thùng chứa có nước biển với mật độ tối đa là 500g sinh khối/lít nước biển Dùng nước đá

để hạ nhiệt độ của sinh khối xuống 5-100C và giữ sinh khối ở nhiệt độ này trong điều kiện có sục khí Phương pháp này cho phép giữ sinh khối với mật độ cao tỷ lệ sống > 90% trong vòng 1 đến 3 giờ để làm thức ăn sống nuôi động vật thủy sản Tuy thế nếu thu sinh khối theo kỹ thuật này để dùng làm nguyên liệu sản xuất bột

đạm sẽ cần thiết bị vận chuyển tốn kém Còn nếu thu sinh khối Artemia và ướp đá

vận chuyển về phòng thí nghiệm thường xảy ra hiện tượng sinh khối bị chuyển sang

mầu xám đen Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu bảo quản sinh khối Artemia Tiến hành 2 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 0,5kg sinh khối Artemia tươi bảo quản bằng

2 phương pháp: mẫu 1 bảo quản bằng đá cách ướp đá để giữ nhiệt độ mẫu  40C, mẫu 2 bảo quản lạnh ở nhiệt độ  40C có bổ sung thêm NaHSO3 (0,1%) Sau khi bảo quản 2, 4,…, 8 giờđánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hóa học Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.4 và 3.5

Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các

mẫu bảo quản sinh khối Artemia tươi

Mẫu bảo quản lạnh bằng nước

đá có bổ sung thêm NaHSO 3

0,1%

0 Sinh khối Artemia có màu vàng

tươi, có mùi tanh tự nhiên

Sinh khối Artemia có màu vàng

tươi, có mùi tanh

hơi xám, có mùi tanh

xám, có mùi tanh

8 Sinh khối Artemia có màu xám,

có mùi tanh

Trang 38

Bảng 3.5 Kết quả phân tích hàm lượng N NH3 và N aa của sinh khối Artemia theo

thời gian bảo quản

Thời gian (giờ)

Trang 39

Nhận xét:

Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy sau 8 giờ bảo quản thành phần NNH3

và Naa ở 2 mẫu sinh khối Artemia bảo quản bằng hai phương pháp khác nhau thay

đổi không nhiều nhưng mầu sắc của mẫu thì thay đổi đáng kể Ở mẫu bảo quản theo phương pháp truyền thống - bảo quản bằng nước đá thì sau 8 giờ bảo quản sinh khối

Artemia có hiện tượng chuyển mầu mạnh, mầu của Artemia chuyển sang mầu xám

(bảng 3.4) Vì thế khi dùng sinh khối Artemia bảo quản theo kỹ thuật này để sản xuất bột đạm thì bột đạm rất đen (hình 3.2) Còn khi bảo quản sinh khối Artemia

bằng nước đá có bổ sung NaHSO3 (0,1%) thì sinh khối Artemia có mầu sắc tốt, hầu

như không bị chuyển màu sau quá trình bảo quản vận chuyển về phòng thí nghiệm

(hình 3.1) Ngòai ra khi sử dụng sinh khối Artemia bảo quản theo phương pháp này

để sản xuất bột đạm thủy phân thì bột đạm thu được có mầu sáng hơn Do vậy

chúng tôi sử dụng phương pháp này để bảo quản sinh khối Artemia dùng làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu

3.2 CHỌN LOẠI ENZYME PROTEASE THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN

Tiến hành 4 mẫu thủy phân sinh khối Artemia bằng các loại protease khác

nhau với tỷ lệ enzyme bổ sung 0,3% so với nguyên liệu Trong đó, mẫu 1: không

bổ sung enzyme (đối chứng), mẫu 2: bổ sung Flavourzyme, mẫu 3: bổ sung Neutrase, mẫu 4: bổ sung Protamex Tất cả các mẫu thủy phân đều tiến hành ở nhiệt

độ 500C, pH tự nhiên của sinh khối Artemia với tỷ lệ nước bổ sung là 5%, mỗi mẫu

thủy phân đều chứa 200g sinh khối Sau các thời điểm 0; 2;…; 10 giờ lấy mẫu đánh giá cảm quan và phân tích một số chỉ tiêu hoá học như: hàm lượng protein hòa tan, hàm lượng peptid, hàm lượng Naa, hàm lượng NNH3, theo thời gian thủy phân Kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 và các hình 3.3  3.6

Trang 40

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của loại enzyme tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của

các mẫu thủy phân sinh khối Artemia

Mẫu thủy phân bổ sung enzyme protease

Flavourzyme Neutrase Protamex

Artemia, dịch sệt

Hỗn hợp màu vàng tươi, có mùi tanh tự nhiên của

có mùi hơi tanh

tự nhiên, dịch sệt

Hỗn hợp màu vàng hơi sẫm,

có mùi hơi tanh

có mùi tanh hơi thơm, dịch sệt

có mùi tanh hơi thơm, dịch sệt, nhuyễn

có mùi hơi thơm, dịch hơi loãng

Hỗn hợp lỏng,

có màu vàng sẫm, mùi thơm đặc trưng

Hỗn hợp lỏng,

có màu nâu vàng, mùi thơm đặc trưng

Tiêu đề	Nghiên cứu chế biến bột đạm từ sinh khối Artemia bằng phương pháp sử dụng enzyme protease
Người hướng dẫn	TS. Vũ Ngọc Bội, Phó Giám đốc - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, TS. Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, TS. Nguyễn Anh Tuấn - Trưởng khoa Chế biến, GS. TS. Trần Thị Luyến, TS. Nguyễn Thị Nga, PGS.TS. Ngô Đăng Nghĩa
Trường học	Trường Đại học Nha Trang
Chuyên ngành	Kỹ thuật Sinh học
Thể loại	Nghiên cứu khoa học
Thành phố	Nha Trang

Định dạng
Số trang	101
Dung lượng	2,41 MB