nghiên cứu tìm chế độ thủy phân thích hợp để thu dịch đạm giàu acid amine từ protein cá nục gai bằng hỗn hợp enzyme protamex và flavouzyme

Vì thế có thể thủy phân cá nục gai thu dịch đạm acid amine từ đó có thể ứng dụng bổ sung vào nhiều loại thực phẩm khác tăng giá trị dinh dưỡng như bánh kẹo, nước mắm, các sản phẩm chức n

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình Để hoàn thành được đồ án tốt nghiệp này em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ nhiều phía Qua đây, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Trước hết em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Nha Trang, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp

đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt cho em những kiến thức trong suốt quá trình học tập

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô ở các phòng thí nghiệm: phòng Hóa sinh, Công nghệ chế biến, Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình em thực hiện đồ án

Thầy Nguyễn Anh Tuấn người trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em trong quá trình làm đồ án Những kiến thức và kinh nghiệm mà thầy truyền đạt đã giúp em rất nhiều trong quá trình làm nghiên cứu Sự thành công của đồ án này không thể thiếu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC SƠ ĐỒDANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ NỤC 3

1.2.1 Tổng quan về enzyme protease 6

1.2.2 Ứng dụng của enzyme protease trong thực tế 12

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng thủy phân protein bằng enzyme protease 16 1.2.5 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân 18

1.3 MỘTSỐNGHIÊNCỨUTRONGVÀNGOÀINƯỚCVỀTHỦYPHÂNCÁ BẰNGENZYME 19

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 19

1.3.3 Các nghiên cứu nước ngoài 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22

2.1.1 Cá nục gai 22

2.1.2 Enzyme Protamex và Flavouzyme 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu chung 23

2.2.2 Xử lí số liệu 24

2.2.3 Phương pháp phân tích 24

2.3 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁ NỤC GAI 40

3.1.1 Kết quả 40 3.1.2 Nhận xét và thảo luận 40 3.2 KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM THĂM DÒ 40 3.2.1 Kết quả xác định tỉ lệ hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme thích hợp 40

3.2.2 Kết quả xác định tỉ lệ E/S thích hợp 44 3.2.3 Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp 48 3.2.4 Kết quả xác định thời gian thủy phân thích hợp 52 3.3 TỐI ƯU CÔNG ĐOẠN THỦY PHÂN CÁ NỤC GAI BẰNG HỖN HỢP ENZYME PROTAMEX VÀ FLAVOUZYME 56 KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của cá nục 5

Bảng 2.1 Mức thí nghiệm của các yếu tố 39

Bảng 2.2 Bảng bố trí thí nghiệm ở giá trị biên 39

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án 39

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của cá nục gai 40

Bảng 3.3 Đánh giá chất lượng cảm quan của dịch đạm thủy phân theo tỉ lệ E/S 44

Bảng 3.4 Đánh giá chất lượng cảm quan của dịch đạm thủy phân theo nhiệt độ thủy phân 48

Bảng 3.5 Đánh giá chất lượng cảm quan của dịch đạm thủy phân theo thời gian thủy phân 52

Bảng 3.6 Ma trận quy họach thực nghiệm 56

Bảng 3.7 Ma trận quy hoạch thực nghiệm có biến ảo 56

Bảng 3.8 Kết quả thí nghiệm ở tâm phương án 57

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra mức ý nghĩa của các hệ số hồi quy 57

Bảng 3.10 Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân cá nục gai bằng hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme 58

Bảng 3.9 Thành phần acid amine của dịch đạm thủy phân 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.5 Cá nục gai 4

Hình 1.2 Quá trình thủy phân protein 15

Hình 2.1 Cá nục gai 22

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp enzyme đến lượng Naa và lượng Nts trong dịch đạm thủy phân 41

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp enzyme đến tỉ lệ Naa/Nts trong dịch đạm thủy phân 42

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp enzyme đến hiệu suất thu hồi 42

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp enzyme đến hàm lượng TVB_N 43

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến lượng Naa và lượng Nts trong dịch thủy phân 45

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến tỉ lệ Naa/Nts trong dịch thủy phân 45

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến hiệu suất thu hồi dịch đạm thu hồi 46

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ E/S đến TVB_N trong dịch đạm thủy phân 46

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến lượng Naa và lượng Nts trong dịch thủy phân 49

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến tỉ lệ Naa/Nts trong dịch thủy phân 49

.Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi 50

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến lượngTVB_N trong dịch 50

thủy phân 50

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến lượng Naa và lượng Nts trong dịch thủy phân 53

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến tỉ lệ Naa/Nts trong dịch thủy phân 53

Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 54

Hình 3.17 Quy trình sản xuất dịch đạm giàu acid amine từ cá nục gai bằng hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme dự kiến 59

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 thu và xử lí mẫu 25

Sơ đồ 2.2 bố trí thí nghiệm tổng quát 27

Sơ đồ 2.3 xác định thành phần hóa học của cá nục gai 29

Sơ đồ 2.4 bố trí thí nghiệm thăm dò tỉ lệ hai enzyme Protamex và Flavouzyme 30

Sơ đồ 2.5 bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzyme trên cơ chất 32

Sơ đồ 2.6 bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân 34

Sơ đồ 2.7 bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân 36

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay khi xã hội đang trên đà phát triển mạnh mẽ kèm theo đó nhu cầu của con người cũng ngày càng phát triển trong mọi lĩnh vực Một trong các vấn đề đáng được quan tâm qua các thời kì đó chính là thực phẩm Con người từ “ăn no mặc ấm” dần hướng tới cuộc sống được “ăn ngon mặc đẹp” và sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng hơn Từ đó, nhu cầu về thực phẩm an toàn vệ sinh, giàu chất dinh dưỡng dễ hấp thụ càng tăng cao và được nhà sản xuất cùng người tiêu dùng quan tâm tới Các mặt hàng thực phẩm hiện nay rất phong phú: thực phẩm chức năng, hàng đông lạnh, đồ hộp…rất tiện lợi cho người sử dụng Một trong các thực phẩm được ưa chuộng từ trước đến nay chính là thủy sản vì chúng dễ tiêu hóa

và chứa đầy đủ một số loại acid amine cần thiết cho cơ thể Vùng biển Việt Nam có rất nhiều các loài thủy hải sản phong phú và giàu dinh dưỡng: tôm, mực, cá, rong biển Cá nục gai là một loại cá biển có sản lượng thu hoạch hàng năm rất cao, giàu chất dinh dưỡng nhưng mới chỉ dừng ở các sản phẩm ăn tươi hay phơi khô mà chưa

có hướng tạo chúng thành các chất dễ hấp thụ cho cơ thể và có thể tạo ra sản phẩm mới ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nữa Vì thế có thể thủy phân cá nục gai thu dịch đạm acid amine từ đó có thể ứng dụng bổ sung vào nhiều loại thực phẩm khác tăng giá trị dinh dưỡng như bánh kẹo, nước mắm, các sản phẩm chức năng…

Xuất phát từ thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của thầy TS Nguyễn Anh Tuấn em

thực hiện đề tài “Nghiên cứu tìm chế độ thủy phân thích hợp để thu dịch đạm

giàu acid amine từ protein cá nục gai bằng hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme”

Mục tiêu của đề tài: tìm ra được chế độ thích hợp để thủy phân cá nục gai thu dịch

đạm giàu acid amine bằng hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme

Nội dung của đề tài:

- Xác định thành phần hóa học cơ bản của đối tượng cá nục gai

- Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân trong quy trình thu nhận dịch đạm giàu acid amine bằng hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme,

đề xuất chế độ thủy phân thích hợp

- Thử nghiệm chế độ thủy phân, đánh giá kết quả Đề xuất quy trình thu nhận dịch đạm giàu acid amine từ cá nục gai bằng hỗn hợp enzyme Protamex và Flavouzyme

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

Kết quả nghiên cứu của đề tài là dẫn liệu khoa học về việc sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá nục gai và mở ra một hướng mới về sử dụng hỗn hợp enzyme thủy phân

Từ dịch đạm thủy phân có thể ứng dụng bổ sung vào nhiều sản phẩm khác làm tăng giá trị dinh dưỡng và dễ hấp thụ làm phong phú thêm cho ngành thực phẩm ngày nay

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ NỤC

Họ cá nục (Decapterus) là họ cá sống ở cả 2 tầng: tầng trên và giữa dọc suốt ven

vùng biển cạn, nơi có mặt của nhiều bùn và phiêu sinh vật làm thức ăn

Từ tháng 5 đến tháng 9: cá nục lên tầng mặt để đẻ và kiếm mồi Tháng 3, 4 là mùa đẻ rộ; tháng 11 đến tháng 3 cá lặn xuống sâu hơn Vì vậy, mùa đánh bắt cá nục chia làm 3 giai đoạn: tháng 2, 3 là mùa sớm; tháng 4  8 là vụ chính và tháng

11 là mùa muộn

* Sản lượng khai thác và chế biến cá nục

+ Trên thế giới, cá nục phân bố rộng khắp chủ yếu ở các vùng biển của Ấn Độ Dương, từ Đông Phi tới Indonesia và ở phía tây Thái Bình Dương, từ Nhật Bản đến

Úc Loài này cũng đã được tìm thấy ở đông Địa Trung Hải (Golani 2006) Đây cũng

là một trong những loài cá nổi ven biển phổ biến nhất ở Đông Nam Á như: Campuchia; Malaysia; Indonesia; Thái Lan; Việt Nam…

+ Cá nục là một loài có tính thương mại cao đối với các nước mà vùng biển loài cá phân bố nhiều Loài này là rất quan trọng trong khu vực biển Nam Trung Quốc như

là một nguồn giá rẻ của protein, đặc biệt là cho các nhóm thu nhập thấp

+ Cá nục chủ yếu được đánh bắt bằng lưới, lưới vây và lưới kéo Trong 10 năm qua

đã có thống kê toàn cầu của loài này như sau: 1997 – 150,027 tấn, 1998 – 145,747 tấn, 1999 – 162,437 tấn, 2000 – 182,99 tấn, 2001 – 171,701 tấn , 2002 – 195,422 tấn, 2003 – 179,011 tấn, 2004 – 168,625 tấn, 2005 – 167,975 tấn, 2006 – 175,770 tấn, 2007 – 164,016 tấn (FAO – FIGIS 2008) Tổng sản lượng đánh bắt loài này để báo cáo cho FAO cho năm 1999 là 159863 tấn Các quốc gia với sản lượng đánh bắt lớn nhất là Thái Lan (82 000 tấn) và Malaysia (70160 tấn)

+ Các nước trên thế giới thường sử dụng loài cá này ở dạng tươi hoặc có thể được sấy khô hoặc ướp muối, cũng được bán đông lạnh và đóng hộp… + Ở nước ta, vì cá nục có thịt ngon và giàu dinh dưỡng được nhiều người ưa thích

Các loài cá nục có giá trị kinh tế là cá nục sò (D maruadasi) sống ở tầng mặt và cá nục đỏ (D kurroides), ngoài ra còn có cá nục thuôn (D lajang) Cá nục thường

phân bố ở các vùng biển Trung Bộ, Đông và Tây Nam Bộ, thường bắt gặp cá nục

gai với sản lượng lớn ở các tỉnh Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh

Hòa…Theo báo thủy sản tỉnh Phú Yên thì ngư trường cá nục chỉ cách xa bờ từ 25

đến 30 hải lý ở vùng biển Tuy An, Phú Yên Bình quân một đêm đi biển, mỗi tàu

thuyền có thể đánh bắt được từ 1,2 đến 1,8 tấn cá nục, có thuyền đánh bắt được hơn

2,5 tấn Cá nục đánh bắt được ở đây chủ yếu là cá nục thuôn và cá nục gai Từ đầu

năm đến nay, đây là lần thứ hai ngư dân ở đây trúng đậm cá nục, đưa sản lượng từ

đầu năm đến nay khai thác hải sản ở huyện Tuy An lên hơn 4.950 tấn, đạt 48% so

với kế hoạch năm và tăng 5% so với cùng kỳ năm ngoái [21]

* Cá nục gai [23]

Hình 1.5 Cá nục gai (Decapterus russelli)

Tên khoa học: Decapterus ruselli (Rüppell, 1830)

Tên tiếng anh: Indian scad

Loài cá nục gai: Decapterus ruselli

Tên tiếng Việt: cá nục gai

+ Đặc điểm hình thái: thân hình thoi dẹp bên, có gai vây lưng, vây lưng mềm (tổng

cộng): 28 – 31, gai hậu môn: 3; tia mềm vây hậu môn: 25 – 28 Phần đường cong

phía dưới lưng mềm và với 30 – 44 vảy, màu hơi xanh xanh ở trên, màu bạc ở dưới,

vây đuôi để màu vàng, vây lưng trắng trong, trên lưng da màu sẫm

+ Phân bố: cá nục gai phân bố rộng ở Việt Nam chủ yếu vùng biển Trung Bộ, Đông và Tây Nam Bộ

+ Mùa vụ khai thác: quanh năm

+ Ngư cụ khai thác: lưới vây, lưới kéo, mành

+ Kích thước khai thác: 100 ÷ 200 mm

+ Dạng sản phẩm: đông lạnh tươi, cá khô, đóng hộp, làm mắm [22]

Thành phẩm cá nục hiện nay khá đa dạng: cá nục tươi (ăn liền trong ngày), có cung cấp đông nguyên con (làm mồi câu để xuất khẩu), cá nục hấp khô bẻ đầu, bỏ nội tạng, cá nục mới hấp xong cho đóng thùng 3kg bảo quản kho lạnh (bán từ từ ra thị trường)

Một mảng tiêu thụ lớn là vùng đất Tây Nguyên từ Bảo Lộc lên Đăk Nông, Buôn

Mê Thuột ra tới Gia Lai, Kon Tum Tại sao người có thu nhập thấp mua cá nục khô

ăn nhiều nhất? Bởi vì, cá nục khô có thể để lâu trong bếp ăn dần dần từ 3 – 4 ngày (thuận tiện về thời gian, không có áp lực phải ăn liền như cá tươi), số con/kg của cá nục khô nhiều hơn gấp 2 – 3 lần nục tươi (7 con so với 22 – 23 con/kg), giá cả hợp túi tiền với người có thu nhập từ 1 – 1,5 triệu đồng/tháng

Bên cạnh đó thì cá nục có thành phần dinh dưỡng rất phong phú đảm bảo cho sức khỏe con người, cung cấp đầy đủ các acid amine, vitamin và các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của cá nục [23]

Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY

PHÂN 1.2.1 Tổng quan về enzyme protease

1 Định nghĩa, cấu tạo [15][14]

Protease là enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide (– CO –NH –) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất protein, có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống cũng như xảy

ra ở ngoài tế bào

Enzyme được cấu tạo từ các L – α – acid amine liên kết với nhau qua liên kết peptide Dưới tác dụng của các peptide hydrolase, acid hoặc kiềm các enzyme bị thủy phân tạo thành các L – α – acid amine, trong nhiều trường hợp ngoài các acid amine còn nhận được các chất khác

2 Các loại tên và phân loại enzyme [15]

a Cách gọi tên

Tên gọi đầy đủ, chính xác theo qui ước quốc tế – tên gọi hệ thống của enzyme được gọi theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng

mà nó xúc tác, cộng thêm đuôi “ase”

Tên gọi hệ thống gồm hai phần:

+ Phần thứ nhất là tên gọi cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau bằng dấu hai chấm);

+ Phần thứ hai chỉ một cách khái quát bản chất của phản ứng xúc tác

Ví dụ: tên thông dụng: urease

tên hệ thống: cacbamit – amidohydrolase

Dựa vào tính đặc hiệu của phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Các thứ tự này là cố định cho mỗi lớp:

1 - Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử

2 - Transpherase: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

3 - Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân

4 - Liase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi

5 - Isomerase: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

6 - Ligase: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP…

a Phân loại enzyme

Việc phân loại enzyme protease có thể dựa vào các tiêu chí: cơ chế phản ứng của enzyme tham gia, pH tối thích cho hoạt động của enzyme, nguồn thu protease, và tính đặc hiệu của enzyme

Theo phân loại quốc tế enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ: + Aminopeptidase: enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ở đầu nitơ của mạch polypeptide

+ Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ở đầu cacbon của mạch polypeptide

+ Dipeptihydrolase: xúc tác sự thủy phân các dipeptide

+ Proteinase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptide nối mạch

Theo Barett và Donald (1956) protease được phân thành 2 nhóm lớn là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase

Nhóm 1: endopeptidase hay (endopeptide hydrolase, hay proteinase) là các enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch polypeptide, các enzyme nhóm này gồm các phân nhóm:

+ Phân nhóm 1: proteinase – serin là những protease mà trung tâm hoạt động của nó có nhóm (– OH) của acid amine xerin Phân nhóm này gồm các enzyme như: trysin, chymotrypsin

+ Phân nhóm 2: protease – xistein là những protease mà trung tâm hoạt động của nó có nhóm thiol (– SH) của acid amine xisten Nhóm này gồm các enzyme cathepsin

+ Phân nhóm 3: protease – aspartis là những protease mà trung tâm hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (– COOH) của acid amine aspartis Nhóm này gồm các enzyme như pepsin

+ Phân nhóm 4: protease – kim loại là những protease mà trung tâm hoạt động của nó có các ion kim loại Enzyme này hoạt động trong môi trường trung tính như: enzyme colagenase

Nhóm 2: exopeptidase hay (peptidase) Các enzyme thuộc nhóm này gồm: cacboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase Các exopeptidase có khả năng thủy phân các liên kết peptide ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu amine, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amine ra khỏi chuỗi polypeptide

3 Cơ chế tác dụng của enzyme [15][14][10]

Xét tổng thể thì 1 phản ứng hóa học xảy ra phải hội đủ 2 điều kiện:

- Va chạm đúng vị trí (đúng liên kết)

- Các chất tham gia phải ở trạng thái hoạt động

Enzyme phải thể hiện phản ứng qua 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: enzyme kết hợp với cơ chất tạo phức enzyme cơ chất

E + S E – S P + E

Phản ứng này không bền, xảy ra nhanh, năng lượng hoạt hóa thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa các enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết Vandecvan

+ Giai đoạn 2: có sự biến đổi sâu sắc trong chính phức enzyme cơ chất, liên kết bị kéo căng và bị phá vỡ, lúc này dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động Giai đoạn này năng lượng hoạt hóa cũng rất thấp

+ Giai đoạn 3: phức enzyme cơ chất giải phóng sản phẩm, trả lại enzyme ban đầu

P + E E – S

Cả 3 giai đoạn trên năng lượng cần là rất ít so với một phản ứng mà không có chất xúc tác hoặc dùng chất xúc tác vô cơ [4]

4 Tính đặc hiệu của enzyme [14][15]

Tính đặc hiệu của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Sự tác dụng có tính chọn lọc cao này gọi là tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu này thể hiện:

+ Đặc hiệu kiểu phản ứng: là enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng nhất định để chuyển hóa một chất nhất định

+ Đặc hiệu cơ chất: mỗi enzyme chỉ xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định Với cơ chất enzyme đòi hỏi 2 mức độ:

- Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối: enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu liên kết nhất định và đòi hỏi rất khắt khe các nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà enzyme tác dụng

- Đặc hiệu cơ chất tương đối: enzyme chọn một kiểu liên kết để xúc tác nhưng đòi hỏi không quá khắt khe các nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà enzyme tác dụng

+ Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất

+ Đặc hiệu nhóm: enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định

5 Nguồn thu nhận enzyme protease [3][5][12]

Enzyme protease là protein được sinh vật sinh tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme Nhưng chủ yếu là từ ba nguồn: động vật, thực vật và

vi sinh vật

* Từ động vật

Trong các enzyme protease, enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Enzyme từ động vật chủ yếu là các enzyme từ nội tạng bao gồm các enzyme như: trypsin, pesin, cathepsin, chyotrypsin…

* Từ thực vật

Enzyme protease thực vật được phát hiện muộn hơn Protease thực vật gồm các enzyme như: papain, ficin, bromelanin Papain được thu từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ Bromelanin thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa Các enzyme này được

sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein

Hiện nay, enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng nguồn enzyme vi sinh vật Enzyme thu từ các nguồn này thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao, trong khi nguồn enzyme thu từ vi sinh vật có nhiều

ưu điểm:

+ Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng lớn cơ chất, lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm

+ Enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính cao

+ Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng sinh khối lớn

+ Trong quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài

+ Nguồn nguyên liệu để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền, dễ kiếm

+ Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau + Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn nhiều

* Từ vi sinh vật

Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn

+ Vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme sử dụng

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hay exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptid trong phân tử protein

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus

subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus Thermorpoteoliticus, và một số giống

thuộc Clostridium Trong đó Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease

mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu (pH 5 –

8) và khả năng chịu nhiệt thấp

+ Nấm mốc

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease

được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae,

Aspergillus terricola, Aspergillus fumigatus, Aspergillus saitoi, Penicillium chysogenum…các loại nấm này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid,

kiềm, trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3

+ Xạ khuẩn: về phương diện tổng hợp protease xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc, đã tìm được một số chủng có khả năng tổng

hợp protease cao như: Streptomyces grieus, Streptomyces fradiae, Streptomyces

trerimosus

1.2.2 Ứng dụng của enzyme protease trong thực tế [1][6][14]

Các nghiên cứu ứng dụng của enzyme ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả cao Để sử dụng emzyme trong thực tế có thể tiến hành theo hai cách chủ yếu

sau đây :

- Điều hòa định hướng tác dụng của enzyme trong các nguyên liệu chứa nó

- Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các quá trình sản xuất

Sử dụng enzyme theo cách thứ nhất trong nhiều trường hợp có thể đơn giản hơn Ví

dụ : có thể dùng yếu tố nhiệt độ để điều chỉnh hoạt độ một số enzyme trong cá, chè, thuốc lá… để làm tăng rõ rệt hương vị Tuy nhiên cách này hạn chế phạm vi ứng dụng enzyme vì nó chỉ có thể dùng enzyme đối với quy trình chế biến chính nguyên liệu của nó

Sử dụng enzyme theo cách thứ 2 thường có hiệu quả cao hơn vì chế phẩm enzyme nhận được có thể sử dụng rộng rãi tùy theo yêu cầu Hơn nữa có thể điều khiển hoạt động của enzyme theo ý muốn và cho phép đề ra quy trình sản xuất

Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản xuất được hơn 100.000 tấn chế phẩm enzyme, trong đó Nhật Bản là nước đi đầu và có truyền thống lâu đời trong lĩnh vực này với hơn 20 hãng sản xuất Sau Nhật là một số nước khác như Mỹ, Anh, Pháp, Đan Mạch, Thụy Điển Hiện Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu phát triển mạnh công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme Tuy nhiên số lượng và chất lượng enzyme còn ở mức thấp

Các chế phẩm của enzyme đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như :

+ Trong hóa phân tích: dùng để định tính và định lượng các chất

+ Trong y học: có thể dùng enzyme để chữa bệnh, sản suất các sinh tố và các chất kháng sinh Ví dụ: có thể dùng enzyme để tăng thêm lượng enzyme cho cơ thể, chữa các bệnh thiểu enzyme bẩm sinh hoặc dùng làm các nội quan nhân tạo, dùng enzyme để chữa các bệnh tiêu hóa kém hoặc để loại bỏ các phần mô bị hỏng, bị thối

ở các ổ viêm, các vết thương hoặc hòa tan các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch

máu Ngoài ra cũng có thể dùng enzyme để phân giải thuốc khi cơ thể bị dị ứng với thuốc

+ Trong công nghiệp:

Trong công nghiệp xà phòng dùng làm chất tấy rửa dầu mỡ công nghiệp

Sử dụng enzyme amylase để khử hồ trên vải trong công nghiệp

Sử dụng protease của Asp – oryzea 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp thuộc

da, cho hiệu suất cao hơn phương pháp vôi sunfua

Dùng cellulase thủy phân bào mòn màng cellulose để trích ly các chất keo trong rong biển

Dùng enzyme để sản xuất bột giấy và giấy

- Ứng dụng trong thực phẩm: chế phẩm enzyme được sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm

- Trong công nghiệp chế biến thịt: protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân protein trong thịt

- Trong chế biến thủy sản, chế biến nước mắm ngắn ngày rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao hiệu quả kinh tế

- Trong công nghiệp sữa: protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ tác dụng làm đông tụ sữa

- Trong sản xuất bánh mì, bánh quy: thêm protease làm giảm thời gian nhào trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và độ nở tốt hơn

- Trong sản xuất nước giải khát: làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Làm trong và ổn định nước quả, rượu vang

+ Trong nông nghiệp:

Có thể dùng enzyme sản xuất thức ăn cho động vật nhằm tăng giá trị dinh dưỡng cho thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn Các enzyme được sử dụng với mục đích này thường là các enzyme thủy phân như amylase, protease, đặc biệt là cellulose, hemicellulose Chúng thủy phân các phân tử lớn thành dạng dễ hấp thụ hơn nên thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn lên khoảng 10%, tăng trọng gia súc trung bình 10 – 15%

+ Ứng dụng trong xử lý phế liệu: ngày nay tốc độ ô nhiễm môi trường đang gia tăng, các phương pháp xử lý hóa học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm này Do đó, những phương pháp

xử lý nhanh hơn, rẻ hơn, đáng tin cậy hơn được đưa vào áp dụng Hiện nay người ta

đã biết nhiều loại enzyme khác nhau của thực vật và vi sinh vật Số lượng enzyme

đã biết đạt tới con số hơn 3000 enzyme

+ Ứng dụng trong thủy sản: trong quá trình chế biến cá: khi làm nước mắm, sản xuất bột cá…Protease vốn có trong cá sẽ thuỷ phân một phần protein của cá Tuy nhiên quá trình này thường sảy ra rất chậm và yếu Đưa thêm protease từ ngoài vào

sẽ làm tăng quá trình thuỷ phân rút ngắn thời gian chế biến Do protein của cá bị thuỷ phân mạnh nên quá trình loại mỡ, loại xương khỏi phần thịt cá đã bị thuỷ phân (trong sản xuất bột cá) được dễ dàng hơn, lượng mắm cốt thu được cũng nhiều hơn hẳn Thêm protease làm biến đổi nhanh chóng cấu tạo của mô cá do đó muối và các chất gia vị dễ dàng thấm vào rút ngắn thời gian muối cá, thời gian xông khói cũng như thời gian xử lý nhiệt Trong nhiều trường hợp khi thêm enzyme protease còn làm tăng hương vị của sản phẩm Sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thuỷ phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da…

1.2.3 Các phương pháp thủy phân

1 Thủy phân hóa học

Thủy phân hóa học là phương pháp cổ điển Thủy phân có thể thực hiện trong môi trường acid (HCl hoặc H2SO4) hoặc trong môi trường kiềm (NaOH) Điều kiện thủy phân khá tốn kém: nhiệt độ cao (1000C) và thường là trong môi trường áp suất thấp Thủy phân bằng acid có bất lợi là phá hủy một phần acid amin

và đặc biệt là trytophane

Thủy phân trong môi trường kiềm bằng xút sẽ phá hủy cystein, cystine, arginin và methionin Đặc biệt, thủy phân trong môi trường kiềm là nguyên nhân gây ra sự biến đổi L – axit amin thành D – axit amin con người không thể hấp thụ được, điều này làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm

2 Phản ứng thủy phân protein bằng enzyme protease [11][14]

Thủy phân bằng enzyme có thuận lợi là dễ kiểm tra hơn thủy phân hóa học, cho phép giữ giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu ban đầu và không cần xử lí hóa học

để loại bỏ các tác nhân thủy phân sau khi thủy phân (enzyme dễ dàng bị bất hoạt bởi nhiệt độ tương đối) Ngoài ra, enzyme có hoạt lực xúc tác cao gấp hàng trăm hàng ngàn lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường khác

Protein là một chuỗi polymer dài, mà bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi các liên kết peptide Phản ứng liên quan đến việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein

Hình 1.2 Quá trình thủy phân protein

Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptide sẽ được tách ra do sự tấn công nucleophilic bởi phân tử nước, tạo thành acid carboxylic và amine Theo Aleder – Nisin, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có liên quan đến

sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (– NH2) có thể cũng hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết peptid Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra amino RCOO- và cation R

– NH3+ Vì vậy, trong quá trình thủy phân protein, các nhóm amino tự do hình thành cũng hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein Sự thủy phân protein diễn ra rất chậm

ở điều kiện bình thường Ví dụ: pH trung tính và nhiệt độ phòng Sử dụng enzyme chắc chắn sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch chuỗi peptide triệt

để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn, ví dụ: các amino acid chính Enzyme mà xúc tác cho sự thủy phân protein là protease hay proteinase

Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là protein, glucid, lipid… Đặc điểm chung của những cơ chất này là có “liên kết bị thủy phân” do các nguyên tử

tích điện dương tạo nên Người ta gọi liên kết này là: “liên kết nhị dương” Enzyme

sẽ tấn công vào các liên kết nhị dương Nhờ các liên kết nhị dương bị cắt đứt mà phản ứng thủy phân xảy ra

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng thủy phân protein bằng enzyme protease [4][8][9][14][15]

Tốc độ thuỷ phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, cụ thể là:

* Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất lớn, vận tốc thuỷ phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng thuỷ phân tăng đến một giá trị giới hạn v = vmax thì nếu nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ phản ứng thuỷ phân bởi enzyme tăng không đáng kể, thậm chí không tăng

* Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn tới tốc

độ phản ứng thuỷ phân, khi càng tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thuỷ phân càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng thuỷ phân đạt đến giới hạn v = vmax, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng thuỷ phân hầu như không tăng

* Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính Với mỗi enzyme ta có các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy khi sử dụng enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm của nó để điều chỉnh phản ứng

* Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá: chất hoạt hoá là những chất khi có mặt trong phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hoá học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ Tuy nhiên các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ xác định Khi dùng quá nồng

độ cho phép, hoạt độ enzyme sẽ giảm

* Ảnh hưởng của nhiệt độ: enzyme là protein có hoạt tính xúc tác nên kém bền với nhiệt, chúng chỉ có hoạt tính trong khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng biến tính Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ửng thuỷ phân tăng Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng thuỷ phân do enzyme xúc tác được đặc trưng bằng hệ số:

Vùng nhiệt độ tạo cho enzyme có hoạt độ cao nhất gọi là vùng nhiệt độ thích hợp của enzyme, trong đó có một giá trị nhiệt độ mà ở đó, tốc độ enzyme đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Với đa số enzyme, vùng nhiệt độ thích hợp trong khoảng 40 – 500C Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, đa số enzyme có nhiệt độ tới hạn khoảng 700C; với các enzyme bền nhiệt (bromelin, papin…), nhiệt độ tới hạn có thể cao hơn Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có sự thay đổ khi có sự thay đổi về pH, nồng độ cơ chất…

* Ảnh huởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme

vì pH ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, ion hoá enzyme và đến độ bền của protein enzyme Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5 – 9 Với nhiều protease, pH thích hợp ở vùng trung tính nhưng cũng có một số Protease có pH thích hợp trong vùng acid (pepsin, protease – acid của vi sinh vật…) hoặc nằm trong vùng kiềm (tripsin, subtilin,…) Với từng enzyme, giá trị pH thích hợp có có thể thay đổi khi nhiệt độ, loại cơ chất thay đổi …

* Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: thời gian thủy phân cần thích hợp để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thuỷ phân nhằm đảm bảo hiệu suất thuỷ phân cao,chất lượng sản phẩm tốt Thời gian thuỷ phân dài, ngắn khác nhau tuỳ thuộc vào loại enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, sự có mặt của chất hoạt hoá, ức chế… Trong thực tế, thời gian thuỷ phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thuỷ phân cụ thể

* Ảnh hưởng của lượng nước: nước vừa là môi trường để phân tán enzyme

và cơ chất lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc độ và chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thuỷ phân bởi enzyme

1.2.5 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân [2][5]

Thủy phân protein là nhằm phân giải các nguyên liệu có chứa các thành phần protein ở trạng thái phân tử lượng lớn (khó tiêu hóa) về thành các peptide ngắn mạch hay amino acid dễ hấp thụ cho các cơ thể sống Sản phẩm của quá trình thủy phân protein là dịch đạm thủy phân Thành phần chủ yếu của dịch đạm thủy phân là các acid amine, các peptide, polypeptide tan Ngoài ra trong dịch đạm thủy phân còn chứa một lượng nhỏ khoáng và lipid Dịch đạm thủy phân của cá có màu vàng nhạt, trong suốt, có mùi thơm đặc trưng, thoảng mùi cá, với tôm là màu vàng xám

hoặc nâu đen tùy chất lượng ban đầu

Sản phẩm thủy phân có thể được thực hiện bằng chính enzyme nội tại hoặc

bổ sung enzyme từ ngoài vào Sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm: dịch đạm thủy phân, bột đạm thủy phân, lipid, bột khoáng Hiện nay, dịch đạm được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:

Trong y dược: dùng sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch Sản xuất dịch đạm truyền cho người bệnh suy kiệt, người không tự ăn uống được, người bị chấn thương nặng, bệnh nhân phải phẫu thuật lớn Trong hương liệu mỹ phẩm, người ta trộn một lượng nhỏ enzyme protease vào kem thoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc…làm cho da, tóc mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già

Dịch đạm thủy phân có ứng dụng rất rộng rãi trong sản xuất thực phẩm thông thường cũng như thực phẩm chức năng Và có thể bổ sung vào quá trình làm nước mắm do có hàm lượng acid amine cao, làm tăng độ đạm của nước mắm Ngoài ra cũng có thể dùng trong sản xuất nước mắm công nghiệp khi thêm hương vị của nước mắm, rút ngắn thời gian sản xuất mà hàm lượng đạm acid amine trong đó lại cao Bên cạnh đó có thể bổ sung vào chao, bánh kẹo…

Trong nông nghiệp: dùng làm phân bón cải tạo đất…

Trong chăn nuôi: dùng làm tăng độ tiêu hóa, bổ sung đạm vào thành phần thức ăn giúp động vật tăng trưởng tốt nhằm rút ngắn thời gian nuôi Khi nuôi thủy sản người nuôi còn dùng dịch thủy phân làm chất tăng vị kích thích bắt mồi cho động vật thủy sản, đặc biệt là dùng khi thời tiết thay đổi hay khi sử dụng kháng sinh trị bệnh (cá biếng ăn)

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ THỦY PHÂN

CÁ BẰNG ENZYME

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước

Đỗ Văn Ninh (2004), nghiên cứu về protease thu nhận từ nội tạng cá và gan mực cho thấy enzyme thu được là một hỗn hợp gồm nhiều protease có nhiệt độ hoạt động thích hợp là 50 – 55 0C và hoàn toàn có thể sử dụng protease này trong thủy phân ứng dụng sản xuất các sản phẩm thủy phân từ cá cũng như bột đạm để ứng dụng trong các lĩnh vực khác [12]

Lâm Tuyết Hận (2009), nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá chẽm có điều kiện hoạt động là pHopt = 7,5 – 8, topt = 350C, muối ăn ở nồng độ càng cao thì hoạt độ enzyme càng giảm Từ đây đã sử dụng enzyme được thu nhận này ứng dụng vào nghiên cứu thủy phân cá nục thuôn và thu được kết quả

về các thông số ảnh hưởng đến sự thủy phân: pH = 8, tỉ lệ nước 20%, NaCl = 2%, E/S = 2%, t = 500C, T = 14 giờ Kết quả thu được bột đạm cá nục thuôn có hàm lượng protein thô là 79,93%, protein hòa tan 13,45%, Naa = 16,65%, bột đạm hòa tan là 89,65%, bộ đạm không hòa tan là 10,35% [7]

Vũ Ngọc Bội (2004), nghiên cứu về protease B subtilis S5 cho thấy có thể dùng nước cất để thu nhận protease với hoạt tính cao từ canh trường nuôi cấy B

subtilis S5 theo phương pháp bán rắn và thu nhận chế phẩm protease kỹ thuật bằng

cách dùng ethanol để gây kết tủa Protease thu được có nhiệt độ hoạt động thích hợp

là 550C và pH thích hợp là 6 Protease có thể sử dụng rất tốt trong thủy phân cá tạp

để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày [1]

1.3.3 Các nghiên cứu nước ngoài

Năm 2003, Bjorn Liaset và cộng sự đã nghiên cứu thủy phân phế liệu (phần xương sau khi phile tách thịt) cá hồi bằng enzyme Protamex ở điều kiện nhiệt độ

550C, pH tự nhiên là 6,5, nồng độ enzyme là 11,1 AU/kg protein thô với tỷ lệ phế liệu trên nước là 1,14 Sau 6 giờ thủy phân, kết quả thu được thủy phân giàu các acid amin thiết yếu và acid béo có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực [19]

Năm 2004, Suthasinee Nilsang và cộng sự ở trường ĐH Mahidol – Thái Lan

đã dùng hai loại enzyme protease là Flavouzyme 1000L và Kojizyme 800L bổ sung

để thủy phân dịch thải từ quy trình cá ngừ đóng hộp để sản xuất dịch đạm Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu khi sử dụng Flavouzyme 1000 L bổ sung vào thủy phân là 450C, nồng độ enzyme là 50 LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w) ở tại pH tự nhiên của nguyên liệu (5,9 – 6), thời gian thủy phân là 6 giờ thì DH đạt 62% Đối với Kjoizyme 800L điều kiện tối ưu là ở 500C,nồng độ enzyme là 40 LAPU/g protein (5%), nồng độ cơ chất 20% (w/w) ở pH tự nhiên, thời gian thủy phân là 6 giờ thì DH đạt 68% [20]

Năm 2011, tạp chí Nghiên cứu lương thực quốc tế công bố nghiên cứu của khoa Khoa học và công nghệ trường Đại học Kebangsaan Malaysia, Malaysia về nghiên cứu tối ưu hóa thủy phân phụ phẩm cá hồi (da, xương, đầu) bằng enzyme Acalase 2,4L Đề tài đã đưa ra các thông số của quá trình thủy phân, nghiên cứu điều kiện tối ưu là nhiệt độ 55,300C và độ pH của 8,39 và được tìm thấy là điều kiện tối ưu để có được mức độ cao nhất của thủy phân (77,03%) khi sử dụng Alcalase Sản phẩm thu được có thành phần chủ yếu là các acid amine và có cả các amino acid Protein thủy phân từ da cá hồi có thể phục vụ trong công nghiệp như các nguồn protein khác từ thủy sản Bên cạnh đó lại tận dụng được nguồn phụ phẩm giàu protein với số lượng lớn phổ biến ở đất nước này [17]

Năm 2010, M Ali cùng cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng bằng cách sử dụng enzyme Neutrase Sử dụng nghiên cứu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Mức độ thủy phân được ước tính dựa theo các điều kiện: hoạt độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân Qua quá trình nghiên cứu các tác giả đã có kết luận rằng hoạt độ enzyme là 39,61 AU/ kg

protein, nhiệt độ là 530C và thời gian thủy phân là 141 phút là điều kiện tối ưu Sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein tương đối cao là 74,56%, lipid là 1,86% Đánh giá chất lượng cho thấy sản phẩm thủy phân này có thể đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho người trưởng thành [16]

Năm 2001, Bjorn Liaset và cộng sự đã nghiên cứu thu hồi nitơ trong cá hồi Đại Tây Dương bằng cách thủy phân bởi enzyme Protamex Nghiên cứu cho thấy ở thí nghiệm thứ nhất bố trí thí nghiệm ở pH = 5,4 – 7,7, nhiệt độ 36 – 500C, tỉ lệ E/S

= 30 – 90 AU/kg protein Qua nghiên cứu quá trình thủy phân cho thấy tỉ lệ E/S =

90 AU/kg protein, nhiệt độ là 500C, pH = 7,7, thời gian là 121 phút thì thu hồi nitơ cao nhất là 76% Ở thí nghiệm thứ 2 nghiên cứu ở điều kiện pH = 6,5 – 7,6, nhiệt độ

= 50 – 560C còn các yếu tố khác tương ứng thì thấy hiệu suất thu hồi nitơ có xu hướng giảm Thí nghiệm 3 nhiệt độ tối ưu là 500C, pH = 6,5 sau thời gian thủy phân

là 60 phút thấy thu hồi nitơ đạt 43 – 61 % bằng cách thay đổi E/S từ 10 – 90 AU/ kg protein thì thấy ở tỉ lệ E/S = 90 là cao nhất nếu tăng thời gian thì hiệu suất thu hồi tăng không đáng kể [18]

Nhận xét: qua phần tổng quan đã nêu lên được các yếu tố liên quan tới vấn

đề nghiên cứu như: tổng quan về cá nục, tổng quan về enzyme, các phương pháp thủy phân…Nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng thủy phân protein bằng enzyme là có khả năng thu được sản phẩm có chất lượng tốt Khi sử dụng một enzyme đơn lẻ thì

có thể sẽ không hiệu quả bằng kết hợp Nhóm nghiên cứu kết hợp thủy phân cá nục gai bằng cả enzyme đơn lẻ và kết hợp Riêng đề tài này nghiên cứu kết hợp hai enzyme Protamex và Flavouzyme để thủy phân đối tượng cá nục gai Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ thêm về hướng sử dụng hỗn hợp enzyme để thủy phân protein cá có thể sử dụng trong thủy phân cá

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Cá nục gai

Hình 2.1 Cá nục gai (Decapterus ruselli)

Tên khoa học: Decapterus ruselli (Rüppell, 1830)

Tên tiếng anh: Inidian scad

Tên tiếng việt: Cá nục gai

Bộ cá vược: Perciformes

Họ cá khế: Carangidae

Giống cá nục: Decapterus

Loài cá nục gai: Decapterus rusell

Đối tượng nghiên cứu là cá nục gai được mua ở cảng Hòn Rớ Thành phố Nha Trang – Khánh Hòa Kích thước trung bình từ 18 – 22 cm, size 8 – 10 con/kg,

cá được khai thác vào tháng 3 năm 2012 tại vùng biển Khánh Hòa Cá nục gai mua

về trạng thái còn nguyên vẹn, tươi, cá có màu xanh sáng đẹp, mùi tanh tự nhiên của

cá, không có mùi lạ, không lẫn các loại cá khác Loài cá này có sản lượng khai thác lớn, các sản phẩm còn chưa đa dạng chưa có nhiều hướng ứng dụng mà lại giàu protein nên thích hợp làm đối tượng nghiên cứu thủy phân

2.1.2 Enzyme Protamex và Flavouzyme

Đồ án sử dụng enzyme thương mại của hãng Novo – Đan Mạch là Protamex và Flavouzyme

Enzyme Protamex là protease có nguồn gốc từ vi sinh vật Bacillus của công ty

Novozyme thành phố Hồ Chí Minh được tổ chức FAO/WHO cho phép sử dụng Enzyme hoạt động thích hợp trong khoảng pH = 5,5 – 7,5, nhiệt độ 45 – 650C, có hoạt độ là 1,5 AU/g Enzyme Protamex bị mất hoạt độ trong 10 phút ở 850C hoặc cao hơn khi pH = 8 Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là 0 – 50C

Enzyme Flavouzyme 500 MG là hỗn hợp protease/peptidase bao gồm

endoprotease và exoprotease được sản xuất từ Aspergillus oryzae bằng quá trình lên

men chìm Enzyme này hoạt động tốt nhất ở môi trường trung tính hay acid nhẹ khi thủy phân protein Chọn enzyme này để thủy phân thì sản phẩm thủy phân cũng sẽ không có vị đắng với liều lượng 5-10 LAPU/g protein và để kéo dài sự thủy phân thì liều lượng nên dùng là 10 – 50 LAPU/g protein Nhiệt độ bảo quản tốt nhất của enzyme này là 0 – 100C

Điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme Flavouzyme là:

- pH từ 5,5 – 7,5

- Nhiệt độ từ 40 – 650C

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu chung

Phương pháp nghiên cứu là phương pháp thực nghiệm kết hợp giữa qui hoạch cổ điển và qui hoạch thực nghiệm[8]

Phương pháp cổ điển thực hiện thí nghiệm thăm dò nhằm mục đích rút gọn khoảng giá trị biên để tiến hành tối ưu hóa

Qui hoạch thực nghiệm là tiến hành tối ưu thực nghiệm theo đường dốc nhất tìm ra các điểm tối ưu

- Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C theo TCVN 3700-1990

- Xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN

3705-1990 Hàm lượng protein = 6.25 x hàm lượng Nitơ tổng số

- Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600 0C

- Xác định hàm lượng Nitơ Amoniac bằng phương pháp chưng kéo hơi nước theo TCVN 3706-90

- Xác định hàm lượng Nitơ Focmon bằng phương pháp Focmon

- Hàm lượng Nitơ axit amin = Hàm lượng Nitơ Focmon - Hàm lượng Nitơ Amoniac

2.3 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Sơ đồ 2.1 thu và xử lí mẫu

Mục đích: tất cả các mẫu đưa vào làm thí nghiệm đều có chung nguồn gốc trong

cùng một lô nguyên liệu

Tiến hành: cá nục gai được mua ở cảng Hòn Rớ Nha Trang được rửa sơ bộ sau đó

vận chuyển về phòng thí nghiệm công nghệ chế biến thủy sản bằng thùng xốp, nhiệt

độ đảm bảo ≤ 40C Sau đó cá được rửa sạch và xay nhỏ với kích thước lỗ sàng lần

Nguyên liệu cá nục gai mua

tại cảng

Rửa

Xay

Chia mẫu Vận chuyển về PTN

Trích mẫu

một là d = 12 mm, lần hai d = 4,5 mm, tiếp theo tiến hành chia mẫu, cân mỗi mẫu 100g cho vào bì PE cột chặt Tiến hành làm đông sau đó trữ đông cá ở tủ đông của PTN công nghệ chế biến nhiệt độ – 20 ± 20C

Kết quả: các kết quả thu được là đúng phương pháp và có thể so sánh được

Sơ đồ 2.2 bố trí thí nghiệm tổng quát

Thuyết minh quy trình: cá nục gai được thu và xử lí mẫu như sơ đồ 2.1 + Rã đông: theo nguyên tắc cấp đông nhanh rã đông chậm, cá nục gai đã xay nhuyễn được trữ ở tủ đông với nhiệt độ – 20 ± 20C Trước khi đi thủy phân cá được

rã đông trong ngăn lạnh của tủ lạnh có nhiệt độ từ 0 – 40C

Lipid Chất lơ lửng Cặn

Xác định Nts

Bã

pH tự nhiên, tỷ lệ W/S (1/1)

Tỉ lệ 2 loại En Nồng độ E/S Nhiệt độ Thời gian

Cá NL được xử lí theo sơ

+ Thủy phân: cá sau khi được rã đông thì các túi PE được trộn đều vào nhau sau đó cân vào các bình tam giác chịu nhiệt mỗi bình 100g mẫu Sau đó tiến hành bổ sung nước cất với tỉ lệ H2O/NL = 1:1 rồi bỏ vào bể ổn nhiệt Khi nhiệt độ tâm đạt yêu cầu thì tiến hành bổ sung enzyme và khuấy đều cho enzyme tan trong hỗn hợp rồi bắt đầu tính giờ Trong quá trình thủy phân thường xuyên lắc bình để thủy phân được đồng đều

+ Bất hoạt enzyme: khi thủy phân đạt thời gian yêu cầu ta tiến hành bất hoạt enzyme Tiến hành lấy bình tam giác cho vào lò vi sóng quay khi đạt 900C rồi cho vào bể ổn nhiệt ở cùng 900C trong 15 phút

+ Lọc: sau khi bất hoạt lọc qua ray lọc, bỏ bã bao gồm xương và thịt cá chưa thủy phân hết

+ Ly tâm: tiến hành ly tâm dịch lọc với vận tốc 4000 vòng/ phút trong 30 phút Kết thúc quá trình ly tâm dịch phân thành bốn lớp trên cùng là lớp lipid, thứ hai là lớp chất lơ lửng, lớp ba là lớp dịch đạm và cuối cùng là lớp cặn Hớt bỏ lớp lipid và lớp chất lơ lửng, gạn lấy dịch lọc cho vào hũ sữa chua bảo quản đông

+ Dịch thủy phân được bảo quản trong tủ đông ở – 20 ± 20C và được đưa đi xác định các chỉ tiêu cần thiết: Naa, Nts, TVB _ N, hiệu suất thu hồi

Sơ đồ 2.3 xác định thành phần hóa học của cá nục gai

Mục đích: biết được thành phần hóa học ban đầu của cá nục gai để sau khi

tiến hành thí nghiệm có thể so sánh với mẫu thủy phân để biết được ở chế độ nào thì thu được dịch đạm với hàm lượng cao nhất đồng thời có thể so sánh cá với các mùa

vụ khác để chọn được nguyên liệu giàu nguồn dinh dưỡng

Tiến hành: cá nục gai nguyên con được thu và xử lí theo sơ đồ 2.1 đi tiến

hành xác định các thành phần hóa học cở bản theo các phương pháp phân tích ở mục 2.2.3

Kết quả: thu được các thành phần hóa học cơ bản của cá nục gai từ đó có thể

so sánh được với thành phần hóa học chung của cá nục

Nguyên liệu cá nục gai trích từ sơ đồ 2.1

Lấy mẫu đại diện

Kết quả Xác định thành phần hóa học;

protein, tro, khoáng, lipid, nước

Sơ đồ 2.4 bố trí thí nghiệm thăm dò tỉ lệ hai enzyme Protamex và Flavouzyme

Mục đích: bố trí sơ đồ theo quy hoạch cổ điển để tìm ra tỉ lệ giữa hai

enzyme thích hợp để tiến hành các thí nghiệm thăm dò tìm ra các vùng biên và điểm thích hợp cho quá trình tối ưu công đoạn thủy phân cá nục gai

Tiến hành: mẫu được xử lí theo sơ đồ 2.1 thu và xử lý mẫu, lấy bảy túi mẫu

đem rã đông rồi tiến hành trộn đều với nhau, một lượng nhỏ để xác định Nts, còn lại cân 100g cho vào các bình tam giác chịu nhiệt tiến hành thủy phân với các yếu tố cố định là: tỉ lệ H2O/NL = 1:1, pH tự nhiên của cá 6,3 – 6,5, nhiệt độ 500C, T = 3 giờ,

Kết quả: thông qua các chỉ tiêu hóa học đã xác định chọn ra được tỉ lệ giữa 2

loại enzyme thích hợp để đi nghiên cứu thăm dò các thông số thủy phân

Sơ đồ 2.5 bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzyme trên cơ chất

Mục đích: tìm ra vùng biên tốt nhất để tiến hành nghiên cứu tối ưu trong

khoảng biên đã được thăm dò bằng thực nghiệm vì kết hợp hai enzyme sẽ có sự khác so với sự thủy phân protein của một enzyme

Tiến hành: mẫu được xử lí theo sơ đồ thu và xử lý mẫu 2.1, lấy năm túi mẫu

đem rã đông rồi tiến hành trộn đều với nhau, một lượng nhỏ để xác định Nts, còn lại cân 100g cho vào các bình tam giác chịu nhiệt tiến hành thủy phân với các yếu tố cố định là: tỉ lệ H2O/NL = 1:1, pH tự nhiên của cá 6,3 – 6,5, nhiệt độ 500C, T = 3 giờ,

tỉ lệ giữ hai loại enzyme thích hợp

Tiến hành cho mẫu vào bình tam giác cho vào bể ổn nhiệt khi bể đạt 500C, tiếp tục đo nhiệt độ thông qua nhiệt kế Khi tâm của mẫu đạt 500C thì bổ sung

Kết quả: dựa vào các chỉ tiêu hóa học ta chọn được tỉ lệ E/S thích hợp để cố

định tiến hành thăm dò các yếu tố tiếp theo