Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhãn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl) (tóm tắt)

Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC



TRƯƠNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN

(Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.)

Chuyên ngành : Hóa học hữu cơ

Mã số: 62.44.27.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2014

Công trình được hoàn thành tại:

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam

Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Phan Văn Kiệm

2 GS TS Nguyễn Văn Tuyến

Phản biện 1: GS.TSKH Trần Văn Sung

Phản biện 2: GS TS Đinh Thị Ngọ

Phản biện 3: PGS TS Lê Mai Hương

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại:

Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi giờ ngày tháng 8 năm 2014

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt nam

Thư viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam Thư viện Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan

trọng Đến nay, đã có hàng trăm cây thuốc đã được chứng minh về giá

trị chữa bệnh của chúng

Cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) là

một cây thuốc thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) thường được sử dụng trị

một số bệnh như: trị tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp, viêm

thận, phù thũng, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa, eczema Nhằm

mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của cây dấu dầu lá nhẵn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần

giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này, chúng tôi lựa chọn

đề tài: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây

dấu dầu lá nhẵn Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.”

2 Đối tượng nghiên cứu của luận án

Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm: mẫu lá và mẫu vỏ thân

của cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) thuộc chi Tetradium, họ Cam quýt (Rutaceae)

3 Những đóng góp mới của luận án

3.1 Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học mẫu lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn thuộc chi Tetradium mọc ở

Việt nam Từ lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn, bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập được hai sáu hợp chất, trong đó có một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên, là tetraglabrifolioside

và mười năm hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium

3.2 Đã đánh giá hoạt tính kháng lao của các hợp chất được phân lập từ

cây dấu dầu lá nhẵn Kết quả cho thấy 3 amide là N-isobutyl-2E,4E-

tetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E-decadienamide(TG19),

kháng lao, trong đó: hợp chất TG18 ức chế chủng lao thử nghiệm

3.3 L ần đầu tiên phân lập được epimedoside C (TG12) với khối lượng

lớn từ lá cây dấu dầu lá nhẵn (21,54g) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào: ung thư đại tràng (SW480), ung thư phổi (LU-1), ung thư tiền liệt tuyến (LNCaP) với giá trị IC50 lần lượt là: 10,47; 7,73; 6,69 µg/mL và thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt (58,74 mL)

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm: 155 trang với 37 bảng số liệu, 94 hình, 144 tài liệu tham khảo và 17 phụ lục Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (27 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (9 trang); Chương 3: Thực nghiệm và kết quả (11 trang); Chương 4: Kết quả và Thảo luận (87 trang); Kết luận (1 trang); Kiến nghị (1 trang); Các công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (52trang)

II NỘI DUNG LUẬN ÁN

MỞ ĐẦU

Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:

- Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của chi Tetradium;

- Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium;

- Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ chi Tetradium;

- Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật

Mẫu vỏ thân và mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn được thu hái vào tháng 6 năm 2011 tại Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp phân lập các chất

Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu chủ yếu gồm: Sắc ký lớp mỏng (TLC); Sắc ký lớp mỏng điều chế; Sắc ký cột (CC)

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học được kết hợp giữa xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại gồm: Điểm

nóng chảy (MP); Độ quay cực [α]D; Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS); Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều NMR): 1H-NMR, 13C-NMR và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC

(1D-2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 6 dòng tế bào: SW480 (ung

thư tuyến đại tràng ở người), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư

tiền liệt tuyến), KB (ung thư tế bào biểu mô), F1 (ung thư màng tử cung)

và RD (ung thư màng tim)

Hoạt tính kháng lao: M bovis và M smegmatis

Hoạt tính chống oxi hóa (theo phương pháp DPPH);

Hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: 3 chủng vi khuẩn gram (+); 3 chủng gram (-); 2 chủng nấm mốc và 2 chủng nấm men

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn

Phần này trình bầy cụ thể quá trình phân lập các hợp chất từ mẫu

lá và mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn

Lần lượt mẫu lá (3,5kg) và mẫu vỏ thân (2,4 kg ) đã được phơi khô, nghiền bột và chiết bằng methanol sau đó chiết phân bố lần lượt

với n-hexane và ethylacetate Các dịch chiết n-hexane, ethylacetate và

lớp nước được cất thu hồi dung môi và được phân lập trên cột chiết và các hệ dung môi thích hợp thu được 11 hợp chất từ mẫu lá và 15 hợp

chất thu được từ mẫu vỏ Các quy trình phân lập mẫu lá và mẫu vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn được trình bầy trong hình 2 và hình 3 dưới đây

3.2 H ằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất này

4.1 Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn

4.2 Xác định cấu trúc các hợp chất

Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 26 hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn, Trong số đó,

có một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên và 15 hợp

chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium,

Phân lập các hợp chất từ mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn

Hình 2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn

Phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn

Hình 3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ cây dấu dầu lá nhẵn

Dưới đây trình bày phương pháp xác định cấu trúc của 3 hợp chất điển hình

HO HO

OH

COOH O

O OH

2

4

1 1'

O OH

TG1

O

O HO

Hình 1 Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất TG1

và cấu trúc của hợp chất tham khảo TG1a

Hợp chất TG1 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng

Công thức phân tử được xác định là C16H28O10 Dựa trên phổ khối lượng phân giải cao HR ESI MS (Error! Reference source not found.) xuất

hiện pic ion giả phân tử tại m/z 379,1609 ([M–H]–

) (tính toán lý thuyết cho công C16H27O10: 379,1604)

Trên phổ 1

H-NMR của TG1 xuất hiện tín hiệu của một proton

anome tại δH 4,34 (d, J = 8,0 Hz), một nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,36 (s), một nhóm methyl bậc 2 tại δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và một nhóm

methyl bậc một tại δH 0,96 (t, J = 7,5 Hz) Phổ 13

C-NMR và DEPT của

TG1 cho thấy sự xuất hiện của hai nhóm cacbonyl tại δC 172,63 (C-1′′)

và 178,50 (C-5′′), một cacbon bậc bốn tại 70,88 (C-3′′), 6 nhóm oxymethine tại δC 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′), 75,26 ′ (C-2), 77,92 (C-3′), 79,07 (C-2) và 103,93 (C-1′); bốn nhóm methylen tại δC 30,25 (C-3), 46,99 (C-2′′), 47,26 (C-4′′) và 64,73 (C-6′); ba nhóm methyl tại δC 9,98 (C-4), 21,48 (C-1) và 27,81 (C-6′′) Các tín hiệu cacbon tại δC 103,93 (C-1′), 75,26 (C-2′), 77,92 (C-3′), 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′) và 64,73 (C-6′) cùng với hằng số tương tác của proton JH- 1′-H-2′ = 8,0 Hz lớn, gợi

ý sự có mặt của một đơn vị đường β-D-glucopyranoside Thủy phân hợp

chất TG1 trong môi trường acid để thu phần đường; sau đó thực hiện

phản ứng với trimethylsilylimidazole Cô quay sản phẩm phản ứng và

rồi chiết phân bố trong n-hexane và H2O thu được phân lớp n-hexane

Lớp n-hexane này được phân tích trên máy GC với điều kiện: cột SPB-1

(0,25 mm × 30 m); detector FID, nhiệt độ cột 210 °C, nhiệt độ buồng bơm 270 °C, nhiệt độ buồng bơm 300 °C, khí mang heli (tốc độ dòng 2 mL/phút) đã thu được một pic tín hiệu tại thời gian lưu 14,11 phút Tiến hành tương tự cho các mẫu chuẩn D-glucose và L-glucose thu được thời gian lưu của persilylated D-glucose và L-glucose lần lượt là 14,11 và 14,26 phút Bằng các so sánh thời gian lưu đã xác định được chính xác

phần đường trong hợp chất TG1 là D-glucose

B ảng 8 Dữ kiện phổ NMR của TG1 và hợp chất tham khảo

4,45 (dd, 1,5, 11,5)

1′′, 4′, 5′ 1′′, 4′, 5′ 1′′ 173,6 172,63 C -

2′′ 48,0 46,99 CH2 2,64 (d, 15,0)

2,68 (d, 15,0) 1′′, 3′′, 4′′, 6′′ 3′′ 71,7 70,88 C

4′′ 48,7 47,26 CH2 2,48 (d, 15,0)

2,59 (d, 15,0)

2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 5′′ 180,9 178,50 C -

6′′ 28,7 27,81 CH3 1,36 (s) 2′′, 3′′, 4′′

#δC thu được từ hợp 1-[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid [119], * tín hi ệu chập

-D-Hình 6 Phổ 1H-NMR của TG1

Hình 9 Phổ 13C-NMR của TG1

Trên phổ HMBC thấy có tương tác giữa δH 1,36 (s) với C-3′′ (δC

70,88)/C-2′′ (δC 46,99)/C-4′′ (47,26); proton của nhóm methylen tại δH

2,64 (d, J = 15,0 Hz)/2,68 (d, J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C-1′′ (δC

172,63); proton của nhóm methylen tại δH 2,48 (d, J = 15,0 Hz)/2,59 (d,

của một nhánh 3-hydroxy-3-methylglutaric acid [118] Các tín hiệu còn

lại trên phổ đặc trưng cho nhóm 2-butyl với các tín hiệu của hai nhóm methyl tại C-1 (δC 21,48)/δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và C-4 (δC 9,98)/δH

0,96 (t, J = 7,5Hz); một nhóm methylen tại δC 30,25 (C-3)/δH 1,50 (m)

và 1,62 (m) và một nhóm oxymethine tại C-2 (δC 79,07)/δH 3,74 (m) và được khẳng định thêm bằng các tương tác trên phổ HMBC Tương tác HMBC giữa proton anome H-1′ (δH 4,34) và C-2 (δC 79,07); giữa H-2 (δH 3,74) và C-1′ (δC 103,93) cho phép khẳng định nhóm 2-butyl liên kết

với C-1 của đường qua cầu oxy Vị trí este hóa của nhánh glutaric acid

tại C-6′ được khẳng định bởi tương tác giữa các proton H-6′ (δH 4,21 và 4,45) và cacbonyl C-1′′ (δC 172,63) Từ các bằng chứng phổ nêu trên,

hợp chất TG1 được xác định là 2-butyl-O-β-D-hydroxyl-3-methylglutaric acid Cấu hình tương đối của TG1, được xác

glucopyranosyl(1→6)-3-định trên cơ sở sự phù hợp về giá trị độ dịch chuyển hóa học 1

H- và 13

C-NMR cũng như giá trị hằng số tương tác của các proton của TG1 với

các số liệu tại các vị trí tương đồng đã được công bố của hợp chất

1-[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β

-D-glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3-methyl-glutaric acid (TG1a) [119] là hợp chất có cấu trúc

tương tự TG1 chỉ khác ở chỗ thay gốc 2-butanol bằng gốc

(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol Như vậy, TG1 được xác định là

(2R*,3S*)-2-butyl-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid, một hợp chất mới lần đầu phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên

O

O OH

O O

O

OH O

O

1

3 19

4

5 10 7 9

11 13

15

18 20 21 22

24 25

26 24

17

O O

O O

OH O O

C-NMR và phổ DEPT của TG7 xuất hiện tín hiệu của 26

nguyên tử cacbon trong đó có 11 cacbon bậc bốn, 8 cacbon methine, 3 cacbon methylen và 4 cacbon methyl Những tín hiệu trên phổ NMR của

TG7 gợi ý đây là một hợp chất có khung dạng limonoid Vị trí của

HSQC Cấu trúc của TG7 được khẳng định dựa trên kết quả phân tích

phổ HMBC Các tương tác HMBC giữa H-1 (δH 4,08) với C-3 (δC

169,83)/C-19 (69,31); tương tác giữa proton Ha-2 (δH 2,92)/ Hb-2 (δH

2,78) với C-1 (δC 79,00)/ C-3 (δC 169,83)/C-10 (δC46,87) cho phép dự

đoán trong TG7 có vòng ester nội phân tử tại C-3/C-19

Các nguyên tử cacbon của vòng epoxy-lacton cũng được xác định

C-16 (δC 166,59) và giữa H-17 (δH 5,46) với C-13 (δC 42,14)/ C-14 (δC64,90)/ C-18 (δC 12,91) Tương tác giữa proton methyl H-18 (δH 0,86) với C-12 (δC 65,95)/ C-13 (δC 42,14)/C-14 (δC 64,90)/C-17 (δC 76,63)

(δH 7,74) với C-20 (δC 119,74)/C-22 (δC 110,45)/ C-23 (δC 142,93); tương tác giữa H-22 (δH6,50) với C-20 (δC 119,74)/ C-21 (δC 141,71)/ C-23 (δC 142,93); tương tác giữa proton H-23 (δH7,62) với C-20 (δC

một vòng furan Vòng furan này được xác định liên kết với vòng

epoxy-lacton tại vị trí C-17 thông qua các tương tác HMBC giữa H-17 (δH5,46) với C-20 (δC 119,74)/ C-21 (δC141,71)/ C-22 (δC110,45)

B ảng 14 Dữ kiện phổ NMR của TG7 và hợp chất tham khảo

phù hợp tại tất cả các vị trí tương ứng Đặc biệt, cấu hình lập thể của

hằng số tương tác J với hợp chất 12α-hydroxyevodol Từ các phân tích

trên, hợp chất TG7 được xác định là 12α-hydroxyevodol, một hợp chất

đã được phân lập từ loài Tetradium rutacarpum thuộc chi Tetradium.

Hình 34 Phổ 1

H-NMR giãn của TG7

Hình 35 Phổ 13

C-NMR của TG7

7 9 10

O

OH O

OH

O O

OH

HO HO

Hình 60 C ấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG12

Hợp chất TG12 thu được ở dạng tinh thể hình kim, mầu vàng

Phổ 1

H-NMR (Phụ lục 5) của TG12 thấy có xuất hiện tín hiệu của hai

cặp proton vòng thơm thế para tại δH 6,94 (d, J = 9,0 Hz) và 8,05 (d, J =

9,0 Hz) và một proton thơm tại δH 6,59 (s) cho phép dự đoán đây là một

hợp chất dạng flavone Đồng thời, trên phổ còn quan sát thấy tín hiệu

của một proton anome tại δH 4,99 (d, J = 7,5 Hz) đặc trưng cho sự có

mặt của một phần đường glycoside và sự xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại δH 5,21 (t, J = 7,0 Hz), hai nhóm methyl bậc ba tại δH

1,62 (s) và 1,76 (s) cho phép dự đoán sự có mặt của một đơn vị isopren Trên phổ 13

C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, trong đó có 11 nguyên tử cacbon bậc 4, 11 nhóm methine, 2 nhóm methylene và 2 nhóm methyl Trong đó tín hiệu đặc trưng cho phân tử đường glucose với tín hiệu cacbon oximethine anome tại δc

100,50 và 2 tín hiệu đặc trưng cho một vòng thơm thế 1,4 tại δc 129,55

và 115,49 Sự xuất hiện của tín hiệu cacbon methine tại δc 97,43 và tín

hiệu cacbon bậc 4 tại δc 135,77 cho phép khẳng định sự xuất hiện của 1 nhóm thế tại vị trí C-8 và sự có mặt của nhóm thế hydroxy tại vị trí C-3

Vị trí liên kết của phân tử đường và nhánh isoprenyl được khẳng định lại dựa trên kết quả phân tích phổ 2 chiều HSQC và HMBC Trên

phổ HMBC, thấy xuất hiện tương tác giữa 2 tín hiệu proton methilen tại

δH 3,43/3,64 (H-1′′′) với C-7 (δc 160,07)/ C-8 (δc 108,08)/ C-9 (δc

152,70) cho phép khẳng định nhánh isoprenyl liên kết với C-8