Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở người bệnh vô sinh không có tinh trùng

Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở người bệnh vô sinh không có tinh trùng

Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng

hoặc ít tinh trùng Nguyễn Thị Việt Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: PGS.TS Trần Văn Khoa

Năm bảo vệ: 2012

Abstract Tổng quan về bệnh vô sinh và vô sinh ở nam giới Nghiên cứu và đánh

giá tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng Hoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y bằng kỹ thuật Multiplex PCR và phân bố mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc

thể Y ở người bệnh vô sinh do không costinh trùng hoặc ít tinh trùng

Keywords Di truyền học; Bệnh vô sinh; Nhiễm sắc thể y; Bệnh tật; Tinh trùng Content

Trong những năm gần đây, vô sinh đã trở thành một trong những vấn đề sức khỏe sinh sản gây ảnh hưởng tới cuộc sống hạnh phúc của rất nhiều cặp vợ chồng và là một vấn đề lớn của toàn xã hội Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy khoảng 10%- 15% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh Theo một nghiên cứu đa trung tâm của Tổ chức y tế thế giới, gần 50% các trường hợp vô sinh có nguyên nhân do nam giới Trong các nguyên nhân vô sinh do nam thấy có khoảng 10%- 15% trường hợp không có tinh trùng (KCTT)

và 5 % ít tinh trùng (ITT) là do bất thường về mặt di truyền

Việc chẩn đoán nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới là một trong những yêu cầu bắt buộc trước khi tiến hành điều trị và hết sức cần thiết để thực hiện tư vấn di truyền Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào và kỹ thuật nhuộm tiêu bản nhiễm sắc thể (NST), đặc biệt là kỹ thuật nhuộm băng ngày càng phát triển và cải biến không ngừng đã giúp cho các nhà di truyền học phát hiện được các biểu hiện rối loạn số lượng và cấu trúc NST Với việc áp dụng phương pháp nhuộm NST đã giúp phát hiện hội chứng Klinefelter là nguyên nhân hàng đầu gây ra vô sinh ở nam giới [53] Bên cạnh đó, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào

chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới do mất đoạn nhỏ (microdeletion) trên nhánh dài của NST Y đang trở nên phổ biến trên thế giới Mất đoạn nhỏ trên NST Y chủ yếu xảy ra ở vùng AZF (azoospermia factor) trên nhánh dài của NST Y (Yq), là nơi có chứa nhiều gen liên quan tới quá trình sinh tinh, được coi là nguyên nhân bất thường di truyền thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh ở nam giới [53] Phát hiện được những mất đoạn trên NST Y

sẽ cung cấp thêm bằng chứng và sự hiểu biết đầy đủ về bất thường di truyền liên quan đến vô sinh nam giới

Với mong muốn góp phần nhỏ vào công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản, đặc biệt trong tìm hiểu nguyên nhân vô sinh nam giới do rối loạn di truyền, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ NST Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng”

Mục tiêu:

- Đánh giá tỷ lệ bất thường NST ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng

- Hoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn vùng AZF trên NST Y bằng kỹ thuật Multiplex PCR và phân bố mất đoạn vùng AZF trên NST Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là: 264 bệnh nhân vô sinh nam giới điều trị tại Trung tâm công nghệ phôi- Học viện Quân y, Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội trong thời gian từ 09/2010 đến 12/2011

Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu: chọn những bệnh nhân vô sinh nam giới đã được xét nghiệm tinh dịch đồ và xác định là KCTT hoặc ITT, không thuộc nhóm tắc nghẽn, dị dạng ống dẫn tinh Các bệnh nhân này được xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc thể đồ Bệnh nhân nào có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình thường 46,XY sẽ được xét nghiệm ADN để phát hiện những mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST Y

Phương pháp chọn mẫu của đề tài là chọn mẫu không xác suất

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 264 bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT hoặc ITT được xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc thể đồ tại Bộ môn Y sinh học- Di truyền, trường Đại học Y

Hà Nội, Bộ môn Sinh học- Di truyền y học, Học viện Quân y Trong số 264 bệnh nhân được xét nghiệm chọn ra 248 bệnh nhân có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình thường 46,XY và không

có bất thường về cơ quan sinh dục ngoài để tiến hành xét nghiệm ADN nhằm kiểm tra và phát hiện các mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST giới tính Y

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp lâm sàng: Lập hồ sơ bệnh án

Các bệnh nhân nam giới được lập hồ sơ bệnh án và chẩn đoán vô sinh được thăm khám lâm sàng, khai thác tiền sử gia đình, tiền sử bản thân, tuổi, nghề nghiệp, môi

trường làm việc, tiền sử mắc bệnh, nhiễm độc, quai bị, chấn thương bộ phận sinh dục, kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ, nội tiết, siêu âm và các xét nghiệm khác

- Phương pháp cận lâm sàng:

+Phương pháp phân tích NST và lập nhiễm sắc thể đồ

Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A (1965) có cải biên

Nuôi cấy tế bào sau 72 giờ tiến hành thu hoạch

Tiến hành nhỏ tiêu bản

Tiến hành nhuộm băng NST

Phân tích tiêu bản NST trên kính hiển vi và lập nhiễm sắc thể đồ bằng phần mềm Ikaros

+Phương pháp phát hiện những mất đoạn vùng AZF của NSTY

Quy trình tách chiết ADN

Tiến hành đo nồng độ ADN mỗi mẫu bằng máy Nanodrop USA

Sử dụng mẫu ADN thu được của từng bệnh nhân để chạy Multiplex PCR nhằm phát hiện mất đoạn trên vùng AZF của NST Y

Sản phẩn sau khi chạy Multiplex PCR xong được tiến hành điện di trên agarose, có sử dụng Marker 100bp của hãng Invitrogen

Đánh giá kết quả thu được bằng cách nhuộm bản và đọc kết quả thu được và kết luận

Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê và tính tỷ lệ %

Thời gian từ tháng 09/2010 tới tháng 12/2011, tổng số 264 bệnh nhân vô sinh nam giới tuổi từ 18 tới 51 tuổi đã được thăm khám lâm sàng, xét nghiệm tinh dịch đồ và kết luận

là KCTT và ITT Những bệnh nhân này được xét nghiệm NST và xét nghiệm ADN, kết quả nghiên cứu được trình bày ở dạng các bảng và biểu đồ dưới các đề mục sau:

1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu

Trong tổng số 264 bệnh nhân vô sinh nam giới thu thập được có độ tuổi thấp nhất là

18 tuổi, cao nhất là 51 tuổi, tuổi trung bình của các bệnh nhân này là: 31,77 ± 5,96

Bảng 1 Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi

Tuổi Số bệnh nhân Tỷ lệ

25- 29 93 35.23%

30- 34 85 32.20%

35- 39 33 12.50%

2 Phân tích NST, lập nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới

2.1 Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới

Tất cả 264 bệnh nhân vô sinh nam giới đều được chỉ định xét nghiệm NST, phân tích

và lập nhiễm sắc thể đồ Kết quả được biểu diễn qua biểu đồ sau:

Hình 1 Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới

2.2 Phân bố bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc

Bảng 2: Phân bố về bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc của bệnh nhân vô sinh nam giới

Bất thường NST Bất thường về

số lượng NST

Bất thường về cấu trúc NST Tổng số (%)

NST thường 1 4 5 (31,25%)

NST giới tính 10 1 11 (68,75%)

Tổng số 11 5 16 (100%)

Bảng 3: Phân bố các kiểu nhiễm sắc thể đồ bất thường ở bệnh nhân vô sinh nam giới: Kiểu bất

thường Nhiễm sắc thể đồ Số lượng

Bất thường số

lượng NST NST giới tính 47,XXY 9

NST thường 45,XY, der(13:14)(q10:q10) 1

Bất thường

cấu trúc NST NST giới tính 46,XY, t(14;X) 1

NST thường 46,XY, t(2q;13q) 1

46,XY, inv(9)(p11q13) 1

46,XY,t(2;8)(q14.2; q24.1) t(3;14) (p23;q13) 1

46,XY,t(5;7;14)

3 Kết quả phát hiện mất đoạn vùng AZF của NST Y

1 Hoàn thiện quy trình Multiplex PCR nhằm phát hiện mất đoạn vùng AZF ở bệnh nhân vô sinh

- Lựa chọn các trình tự mồi:

Các STS đặc hiệu được sử dụng trong phản ứng PCR và số lượng STS cũng là một yếu tố ảnh hưởng tới tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên AZF được phát hiện Có khoảng 300 STS đặc hiệu cho vùng AZF và có thể sử dụng để chẩn đoán các mất đoạn nhỏ Tuy nhiên, không thể dùng tất cả các STS để xét nghiệm mất đoạn nhỏ vùng AZF vì giá thành xét nghiệm sẽ rất

cao và thời gian xét nghiệm sẽ rất dài Để giải quyết vấn đề này, Học viện nam học Châu Âu (EAA: European Academy of Andrology), khuyến cáo chỉ cần sử dụng 2 STS cho mỗi phân vùng AZF cũng có thể phát hiện trên 90% các mất đoạn nhỏ [56] Các STS được khuyến cáo

để chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên vùng AZF là: sY84 và sY86 cho AZFa, sY127 và sY134 cho AZFb, sY254 và sY255 cho AZFc [55] Tuy nhiên, tính đặc hiệu của các STS này đối với các mất đoạn nhỏ còn là điều gây tranh cãi

Trong nghiên cứu này, các STS được khuyến cáo bởi Học viện nam học Châu Âu được sử dụng với một sự thay đổi nhỏ Các STS cho AZFa và AZFb được giữ nguyên Để chẩn đoán mất đoạn nhỏ vùng AZFc, sY255 được thay thế bằng sY153 Một lý do cho sự thay thế này là sY255 nằm rất gần sY254 trên vùng DAZ và chúng hay bị tổn thương cùng nhau Việc chọn sY153 có thể giúp phát hiện những mất đoạn nhỏ trên AZFc ở ngoài vùng DAZ

Như vậy, đề tài sử dụng 6 cặp mồi: sY86, sY127, sY254, sY84, sY134, sY153 nhằm phát hiện mất đoạn trên các vùng AZFa, AZFb, AZFc Cùng với đó, tiến hành chạy thêm với cặp mồi SRY với vai trò là đối chứng dương nội tại

Bảng 4: Trình tự 7 cặp mồi chạy Multiplex PCR [16]

STT Kích

thước STS Vị trí Trình tự mồi

a1 472 bp SRY SRY F 5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3′

R 5′-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3′

a2 320 bp sY86 AZFa F 5-GTGACACACAGACTATGCTTC-3′

R 5′-ACACACAGAGGGACAACCCT-3 a3 274 bp sY127 AZFb F 5′-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3′

R 5′-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3′

A4 350 bp sY254 AZFc F 5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′

R 5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′ Â5 326 bp sY84 AZFa F 5′-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3′

R 5′-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3′

A6 301 bp sY134 AZFb F 5′-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3′

R 5′-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3′

-Tổ hợp các trình tự mồi trong các phản ứng Multiplex PCR:

Dựa vào đặc điểm về kích thước của các đoạn gen được nhân lên, tiến hành chia 7 cặp mồi nghiên cứu thành 2 tube để thực hiện chạy Multiplex PCR

Tube 1: Gồm có 4 cặp mổi: SRY (472 bp), sY86 (320 bp), sY127 (274 bp), sY254 (350 bp) Tube 2: Gồm có 4 cặp mồi: SRY (472bp), sY84 (326bp), sY134 (301 bp), sY153 (139 bp) Chia 2 tube dựa vào kích thước đoạn gen được nhân giúp cho việc kiểm tra kết quả sản phẩm chạy Multiplex PCR được dễ dàng hơn

-Tối ưu hóa các thành phần phản ứng:

Dựa vào đặc điểm của quá trình PCR, nhiệt độ gắn mồi của từng cặp mồi nghiên cứu

và độ dài của từng đoạn gen cần nhân lên, quy trình nhiệt của phản ứng đã được tối ưu như sau:

Hình.2 Chu trình nhiệt chạy Multiplex PCR

Qua quá trình chạy Multiplex PCR bước đầu, cũng đã có sự điều chỉnh các thành phần phản ứng để từ đó tối ưu được phản ứng nhằm hạn chế được sự tiêu tốn hóa chất nhưng vẫn đạt được kết quả như mong muốn Thành phần của từng tube được trình bày ở bảng dưới đây

Bảng 5: Các thành phần phản ứng PCR

A7 139 bp sY153 AZFc F 5′-GCATCCTCATTTTATGTCCA-3′

R 5′-CAACCCAAAAGCACTGAGTA-3′

Thành phần

phản ứng Tube 1 Tube 2

Master mix 6,25μl 6,25μl

Primer

SRY,sY86,sY127,sY254 (Mỗi cặp mồi F: 0.25 μl, R: 0.25 μl)

SRY,sY84,sY134,sY153 (Mỗi cặp mồi F: 0.25 μl, R: 0.25 μl)

Template 2-3 μl 2-3 μl

Tổng 12,5 μl 12,5 μl

2 Tỷ lệ và phân bố các mất đoạn vùng AZF ở bệnh nhân vô sinh nam giới

Với 248 bệnh nhân vô sinh nam giới đã kiểm tra là không có bất thường về nhiễm sắc thể đồ sẽ được tiến hành phân tích ADN bằng cách chạy Multiplex PCR với 7 cặp mồi giới thiệu ở trên

Hình 3 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân bị mất đoạn trên vùng AZF

3 Tỷ lệ bệnh nhân bị mất đoạn theo từng phân vùng AZFa, AZFb, AZFc

Bảng 6 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân vô sinh nam giới mất đoạn trên từng vùng AZF

Đặc điểm Số lượng Tỷ lệ

Mất đoạn vùng AZFa 6 31,58%

Mất đoạn vùng AZFb 1 5,26%

Mất đoạn vùng AZFc 11 57,89%

Mất đoạn vùng AZFa/b/c 1 5,26%

4 Tỷ lệ bệnh nhân mất đoạn theo từng STS được nghiên cứu

Bảng 7 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân vô sinh nam giới mất đoạn theo từng STS nghiên cứu

Vị trí mất đoạn Số lượng Tổng Tỷ lệ

AZFa sY84 7 8 33,33%

sY86 1

AZFb sY127 1 3 12,5%

sY134 2

AZFc sY254 1 13 54,17%

sY153 12

Qua nghiên cứu ở 264 bệnh nhân vô sinh nam giới chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

- Phát hiện 16/264 trường hợp bất thường về NST chiếm tỷ lệ 6%, trong đó bất thường NST giới tính 11/16 trường hợp (68,75%) và bất thường NST thường 5/16 trường hợp (31,25%) Bất thường về số lượng NST 11/16 trường hợp (68,75%) và bất thường cấu trúc NST 5/16 trường hợp (31,25%)

- Đã tối ưu hóa được quy trình, thành phần phản ứng Multiplex PCR nhằm phát hiện mất đoạn nhỏ trên NST Y Thay thế sY255 bằng sY153 đã giúp phát hiện tốt hơn những mất đoạn trên vùng AZFc của bệnh nhân vô sinh nam giới

- Phát hiện ra 8% trường hợp có mất đoạn trên vùng AZF của NST Y Trong đó mất đoạn nhỏ trên AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất (57,89%), tiếp đến là mất đoạn trên AZFa (31,58%), mất đoạn trên vùng AZFb và mất đoạn trên AZFa/b/c chiếm tỷ lệ thấp nhất (5,26%)

Từ các kết quả và kết luận trên chúng tôi có một số kiến nghị như sau:

-Xét nghiệm NST đối với bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT hoặc ITT không thuộc nhóm tắc nghẽn nhằm phát hiện ra những bất thường nhiễm sắc thể đồ Cần nghiên cứu sâu hơn để đánh giá mức độ ảnh hưởng của những bất thường ở NST thường đến vô sinh nam giới -Tiếp tục quy trình phát hiện mất đoạn trên vùng AZF trên số lượng lớn bệnh nhân và ở nhiều các STS hơn, để đảm bảo kiểm tra được tốt hơn các mất đoạn nhỏ trên toàn bộ vùng AZF và xác định bộ STS giúp đánh giá tốt nhất các mất đoạn

-Xét nghiệm nên được tiến hành để sàng lọc trước khi quyết định lựa chọn phương pháp điều trị cho bệnh nhân vô sinh nam giới

References

TIẾNG VIỆT:

1 Trịnh Văn Bảo (2004), Dị dạng bẩm sinh, NXB Y học

2 Nguyễn Trần Chiến, Trần Văn Khoa (2011), Di truyền y học, NXB Quân đội nhân

dân

3 Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh, Phạm Gia Khánh, Lê Văn Vệ và cs (2002),

Nghiên cứu một số vấn đề vô sinh nam giới và lựa chọn kỹ thuật lọc rửa, lưu trữ tinh trùng để điều trị vô sinh, Đề tài cấp nhà nước

4 Trung Thị Hằng (2007), Nghiên cứu đặc điểm nhiễm sắc thể đồ của những người nam

không có tinh trùng, Khóa luận tốt nghiệp bác sĩ Y khoa, Đại học Y Hà Nội

5 Trần Văn Hanh (2006), “Hệ sinh sản”, Mô học, NXB Quân đội nhân dân

6 Ngô Gia Hy (2000), Hiếm muộn và vô sinh nam, NXB Thuận Hóa

7 Nguyễn Khắc Liêu (2003), Chẩn đoán và điều trị vô sinh, Viện BVSKBMVTSS,

NXB Y học

8 Trần Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Ngọc Phượng, Nguyễn Song Nguyên, Hồ Mạnh

Tường, Vương Thị Ngọc Lan (2002), Hiếm muộn- vô sinh và kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, NXB Y học

9 Nguyễn Đức Nhự (2009), Nghiên cứu đặc điểm nhiễm sắc thể và phát hiện mất đoạn

AZFc ở bệnh nhân vô sinh nam giới, Luận văn thạc sĩ Y học chuyên ngành Y sinh

học- Di truyền

10 Nguyễn Xuân Quý (2008), “Bất thường di truyền trong vô sinh nam”, Ivf expert

meeting 4, Phú Quốc

11 Phan Văn Quyền (2000), “Khám và làm bệnh án một cặp vợ chồng vô sinh”, Lớp vô

sinh và hỗ trợ sinh sản khóa 4, tr 1- 13

12 Viện Bảo vệ sức khỏe bà mẹ và trẻ sơ sinh (1999), Chẩn đoán và điều trị vô sinh

nam, Hà Nội

TIẾNG ANH:

13 Abramsson L., Beckman G., (1982), “Chromosomal aberrations and male infertility”,

J Urol , (128), pp 52-53

14 Abyholm T, Stray-Pedersen S., (1981), “Hypospermiogensis and chromosomal

aberrations: a clinical study of azoospermic and oligozoospermic men with Norman

and abnormal nhiễm sắc thể đồ”, Int J Androl, (4), pp 546-558

15 Ali Hellani, Saad Al- Hassan (2005), “Y chromosome microdeletions in infertile men

with idiopathic oligo- or azoospermia”, Journal of Experimental & Clinical assisted reproduction 2006

16 Anurag Mitra, Rima Dsda, Rajeev Kumar, Narmada Prasad Gupta, Kiran

Kucheria and Satish Kumar Gupta (2006), “Y chromosome microdeletions in

azoospermic patients with Klinefelter‟s syndrome”, Asian J Androl 2006; 8(1),

pp 81- 88

17 Anurag Mitra, Rima Dsda, Rajeev Kumar NP.Gupta, Kiran Kucheria and S.K Gupta

(February 2008), “Screening for Y- chromosome micro deletions in infertile Indian

male: Utility of simplified mutiplex PCR”, Indian J Med Res 127, pp 124- 132

18 Arvind Rup Singh, Radek Vrtel, Radek Vodicka et al (2006), “Gentic factors in male

infertility and their implication”, Int J Hum Gent, 6(2), pp 163-169, 225- 235

19 Behulova R, Varga I, Strhakova L, et al (2011), “Incidence of microdeletions in the

AZF region of the Y chromosome in Slovak patients with azoospermia”, Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 155 (1), pp 33-38

20 Bourrouillou G, Dastugue N (1985), “Chromosome studies in 952 infertile males

with a sperm count below 10 million per ml” Hum Gent, (71), pp 366-367