Kỹ thuật nuôi thức ăn tự nhiên - Chương 2 Tảo pptx

• 1941, khi Matsue tìm ra phương pháp phân lập và nuôi cấy tảo thuần loài Skeletonema costatum thì loài tảo này đã được Hudinaga dùng làm thức ăn cho ấu trùng tôm Penaeus japonicus và

Kỹ thuật nuôi thức ăn tự nhiên

ThS Nguyễn Hữu Lộc Khoa Sinh học ứng dụng Trường Đại học Tây Đô

1 Giới thiệu

Chuỗi thức ăn tự nhiên trong nuôi trồng thủy sản

TATN

Nuôi vi tảo

• Đối với tảo, hai loài Isochrisys galbana và Pyramimonas

grossii đầu tiên được Bruce phân lập và nuôi đơn chúng dùng

làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là dùng cho

nuôi ấu trùng trai, hầu

• Tiếp theo đó, là kết quả nuôi thành công tảo khuê cho nhiều loài động vật không xương sống khác nhau của Allen và

Nelson, 1910

• 1941, khi Matsue tìm ra phương pháp phân lập và nuôi cấy tảo

thuần loài Skeletonema costatum thì loài tảo này đã được

Hudinaga dùng làm thức ăn cho ấu trùng tôm Penaeus

japonicus và đã nâng tỉ lệ sống của ấu trùng đến giai đoạn

Mysis lên 30%, thay vì 1% so với các kết quả trước đây

Nuôi vi tảo

• Mỹ: Thalasiossira pseudomonas, Skeletonema, Chaaaetoceros

calcitrans, Chaetoceros mulleri, Nannochloropsis ocula, Chlorella minutissima được nuôi để làm thức ăn cho luân trùng, ấu trùng hai

mảnh vỏ, ấu trùng tôm và cá

• Trung Quốc những loài nuôi chính bao gồm Isochrisys galbana,

Pavlova viridi, Chaetoceros muelleri, Phaeodactylum triconutum,

• Ở Đài Loan, các đối tượng nuôi chính là Nannochloropsis oculata,

Tetraselmis, Chlorella sp., dùng cho ương nuôi ấu trùng họ tôm he

(Penaeus), loài Isochrysis galbana trong ương nghêu Riêng loài

Skeletonema costatum, sản lượng nuôi có thể đạt tới 9.000 tấn/năm

• Nuôi tảo ở Nhật Chaetoceros sp., Penaeus japonicus và Metapenaues

ensis, Isochrysis sp và Pavlova lutheri dùng cho hai mảnh vỏ,

Tetraselmis sp., Nanochloropsis oculata, Chlammydomonas sp cho

luâu trùng Brachionus plicatilis.

Bảng 1: Lớp và giống tảo nuôi dùng làm thức ăn cho các đối tượng

thủy sản (Pauw và Person, 1991):

Các tiêu chuẩn cơ bản để chọn giống tảo nuôi

Khả năng nuôi sinh khối  Kích thước tế bào nhỏ  Khả năng tiêu hoá  Giá trị dinh dưỡng

Việc sản xuất tảo thường phức tạp & chi phí cao Đã có nhiều thử nghiệm nhằm thay thế tảo bằng thức ăn nhân tạo hoặc bổ sung hoặc như nguồn thức

ăn chính tuy nhiên kết quả thường không ổn định

Các loài tảo nuôi

giá trị dinh dưỡng của tảo không chỉ riêng thành phần protein mà còn là thành phần acid béo; chúng có thể là nhân tố thúc đẩy sinh trưởng của đối tượng nuôi hoặc có tác dụng lọc nước

Giới thiệu một số loài tảo nuôi

Thành phần dinh dưỡng của các loài tảo

Species METABOLITES (PERCENTAGE DRY WEIGHT OF CELLS)

Protein Carbohydrates Fat Total pigment * Ash Total Chlorophyceae

Độ muối: 0- 35%0Nhiệt độ: 25- 320C

clip

Các pha phát triển của tảo

Pha thích nghi: mật độ tảo tăng lên ít và thường kéo dài khi môi trường nuôi đựoc chuyển từ đặc sang lỏng

Pha tăng sinh: mật độ tế bào tăng nhanh

Pha tàn: Mật độ tảo giảm nhanh chóng

& mẻ nuôi bị lụi tàn

Dinh dưỡng & môi trường nuôi

• Mật độ tảo trong môi trường nuôi thường cao hơn tự nhiên do đó cần phải cung cấp dưỡng chất:

Đa lượng: Nitrate, Phosphate & Silicate

Vi lượng: Chất khoáng; vitamin (B1, B12)

• Hai loại môi trường chính: Walne & Guillard F/2

• Tảo cần sử dụng ánh sáng để tổng hợp Carbon vô cơ thành các chất hữu cơ

• Cường độ ánh sáng đóng vai trò quan trọng (phụ thuộc độ sâu & mật độ tảo nuôi)

• Đèn huỳnh quang được ưa chuộng vì phổ ánh sáng xanh & đỏ phù hợp cho quang hợp

• Thời gian chiếu sáng cần ít hơn 18h/ngày

Ánh sáng

Qui trình sản xuất tảo

Figure 2.6 Production scheme for batch culture of algae

Nguyên tố (mg/L) Nước ngọt Nước mặn

* Khi pH=7; ** Ferric citrate

Thành phần dinh dưỡng của các môi trường nuôi tảo

Nguyên tố (mg/L) Nước ngọt Nước mặn

Thành phần dinh dưỡng của các môi trường nuôi tảo sinh

khối trong ao

-Cải thiện trao đổi khí giữa môi trường nuôi & không khí bên ngoài

• Cung cấp khí CO2 nhằm:

Tránh thay đổi pH (cân bằng CO2/HCO3)

Sục khí

Nhiệt độ

•Tùy thuộc vào từng loài tảo nuôi

•Tối hảo: 20-24oC; ngưỡng: 16-27oC

• Cần kiểm soát nhiệt độ

•Nhiệt độ ảnh hưởng tới sự tích lũy dinh dưỡng trong tês bào tảo

•Các loài tảo nước ngọt chịu ảnh hưởng của sự thay đổi không bào

•Tảo nước lợ thường có sức chịu đựng tốt đối với thay đổi độ muối

• Độ muối tối hảo: 20-24 ‰

Độ muối

Điều kiện môi trường nuôi tảo

ĐK nuôi Cư?ng đ? ánh sáng (lux) Nhi?t đ? (0C) Đ? m?n (‰) pHTên gi?ng

Platymonas 5000-10000 25-28 30-35 7.5-8.5Dunaliella 2000-6000 30-40 25-28 7.5-8.5Nanno 1000-2000 25-30 30-32 7.5-8.5Chlorella 1000-2000 25-28 30-32 6.0-8.0Chaetoceros 6000-8000 25-35 20-25 8.0-9.0

3.2 Sinh trưởng

Trong thực tế tảo tàn có thể do nhiều nguyên nhân:

• thiếu hụt chất dinh dưỡng,

• oxy hoà tan,

•nhiệt độ cao,

•pH không thích hợp

•& bị lây nhiễm

Chìa khoá thành công của việc

nuôi tảo là luôn duy trì ở pha tăng

sinh

Các pha phát triển của tảo

• Pha thích nghi (Lag phase): mật độ tảo tăng lên ít và thường kéo dài khi môi trường nuôi đựoc chuyển từ đặc sang lỏng Trong pha này, trao đổi chất của tế bào dẫn đến sinh trưởng ví dụ tăng lên về các mức enzyme & trao đổi chất bao gồm phân chia tế bào & cố định Carbon

• Pha tăng sinh (exponential growth phase): mật độ tế bào tăng nhanh theo

công thức: Ct=Co.emt trong đó:

Co: là mật độ tảo tại thời điểm 0

Ct : là mật độ tảo tại thời điểm t

m: tốc độ sinh trưởng đặc trưng, m phụ thuộc loài, cường độ ánh sáng & nhiệt độ

• Pha giảm sinh (phase of declining growth rate): Phân chia tế bào chậm lại khi chất dinh dưỡng, ánh sáng, pH, CO2 hoặc các yếu tố thuỷ lý hoá bắt đầu hạn chế sinh trưởng

• Pha bão hoà (Stationary phase): nhân tố giới hạn cân bằng với tốc độ sinh trưởng dẫn đến mật độ tảo không tăng thêm nữa

• Pha tàn (death/crash phase): Trong pha này, chất lượng nướ xấu & chất dinh dưỡng cạn kiệt không thể duy trì sinh trưởng của tảo Mật độ tảo giảm nhanh chóng & mẻ nuôi bị lụi tàn

Độc tố ở tảo và các loài tảo mang độc tố

3.3 Phân lập & duy trì mẻ nuôi

• Chọn lọc dòng tảo thuần phục vụ trại ương

• Phân lập tảo thường phức tạp & được thực hiện ở phòng thí nghiệm: pha loãng, cấy liên tục trên agar hoặc tách dòng bằng pippettes mao dẫn

• Hạn chế sự phát triển của vi khuẩn bằng kháng sinh

•Tránh lây nhiễm

2/Nuôi giữ giống gốc (stock culture): trong ống nghiệm, cường độ ánh sáng thấp (~1000lux); nhiệt độ thấp:16-19oC; thời gian duy trì ~1 tháng & chuyển qua lập

1 dòng mới

Qui trình nuôi cấy tảo

Kỹ thuật nuôi vi tảo

- Lưới thu: tùy thuộc vào loài tảo sẽ thu và lượng tảo sẽ thu.

- Dây thu Ø 21 hoặc 27: dung để sin phon tảo

- Dây khí, đá bọt: cung cấp CO2, đảo đều nước, tạo dòng chảy

- Bể gây giữ giống (bình thủy tinh, hoặc hình tam giác): có kích thước từ 200- 2000 ml.

- Bể sinh khối (từ 1-3m3/bể): bể làm bằng thủy tinh, nhựa trong suốt

- Hóa chất các loại: dung dịch dinh dưỡng gây nuôi tảo, diệt tạp

• Nguồn nước sau khi đã được xử lý để loại bỏ các tạp chất, các vi sinh vật gây bệnh, và bổ sung nguồn dinh dưỡng thích hợp sẽ

được đưa vào bể nuôi

• Tại đây tảo nguyên liệu đã nuôi cấy ban đầu cũng được đưa vào

và bắt đầu quá trình nuôi cấy

• Trong suốt quá trình này nguồn dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy phải được bổ sung liên tục theo chu kỳ 12h một lần để tránh hiện tượng sốc pH và hiện tượng thay đổi áp suất thẩm thấu đột ngột

• Đồng thời trên các bể nuôi cũng được bố trí các cánh khuấy và môtơ vận hành các cánh khuấy để thường xuyên cung cấp CO2 cho tảo quang hợp

• Quá trình nuôi cấy này diễn ra khoảng từ 3 đến 5 ngày sau đó bắt đầu thu hoạch.

Các biện pháp xử lý nước

• Hấp tiệt trùng dụng cụ (15-45 min, 120oC và 20psi): đối với ống nghiệm, bình tam giác…

• Lọc (1 micron)& xử lý với acid (pH=3) hoặc chlorine

(1-2mg/L trong 24 h) sau đó trung hoà

• Khi sử dụng nước giếng khoan phải lưu ý đến sự hiện diện của ammonia và sắt.

• Dây sục khí cần phơi khô, CO2 cần được lọc qua ống lọc 0,5 micron); đối với thể tích nuôi lớn cần sử dụng bông gòn & than hoạt tính để lọc khí.

(0,3-• Nước sau khi đã xử lý sơ bộ, được bơm vào bể nuôi cấy, nước phải đảm bảo pH theo yêu cầu từ 8,5 – 10,5 bằng cách bổ sung NaHCO3 và sục khí CO2 1 –2 %

Phương pháp phân lập và thuần hoá tảo giống

• Tảo vớt tự nhiên thường lẫn nhiều tạp mùn bả hữu cơ và động vật phù du Do vậy ta phải phân lập tảo bằng lưới có kích

thước mắt lưới lớn hơn lượt qua nhiều lần và cuối cùng chỉ giữ lại phần nước có tảo trong đó.

• Có thể thực hiện việc thuần giống tảo theo các phương pháp

sau:

• Dùng ưu thế môi trường để thuần giống một cách tương đối

Nghĩa là trong điều kiện môi trường dinh dưỡng đưa vào phù hợp với sinh học phát triển của 2 giống tảo này sẽ giúp cho

chúng ưu tiên phát triển hơn Nên trải qua một thời gian 2

giống tảo này sẽ chiếm ưu thế để phát triển quần thể, chúng sẽ trở nên thuần chủng.

• - Dùng phương pháp phân lập để tách 2 giống tảo này ra để

nuôi riêng với môi trường dinh dưỡng thích hợp Sau nhiều lần phần lập chúng sẽ trở nên thuần chủng.

• - Kỹ thuật dung micropipette: dung micropipette thu

một tế bào hoặc 1 sợi tảo cần phân lập khi soi qua kính

hiển vi.

• - Kỹ thuật phun: pha loãng tảo, phun lên bề mặt thạch

nghiêng đã khử trùng Sau vài ngày có thể thu được tế

bào tảo hoặc tập hợp tế bào tảo sạch vi khuẩn và nấm

để chuyển sang cấy truyền.

• Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật thay đổi áp suất

thẩm thấu để loại bớt nguyển sinh động vật; hoặc dùng

ánh sáng, dòng điện để kích thích các loài tảo có phản

ứng với các tác nhân này

Phương pháp phân lập và thuần hoá tảo giống

Dụng cụ phân lập

• Đĩa petri, que cấy, pipet, agar, lam, lamen, bình tam giác, các ống nghiệm, đèn cồn, kính hiển vi

• - Môi trường nuôi:

• Dùng 10g agar pha trong 0,5l H20 sau đó bỏ vào đây môi trường dinh dưỡng thích hợp để

phân lập tảo, đun sôi, thạch tan ra trong suốt thì dừng lại, thạch gần đông đổ vào các hộp lồng (mỗi hộp khoảng 10 ml)

Các dụng cụ đếm tảo

Buồng đếm hồng cầu

Phân lập

trường thạch, agar)

- Phương pháp phân lập: thạch, que cấy, agar, lamen, các ống nghiệm, kính hiển vi.

- Môi trường nuôi: dùng 10g agar pha trong 0,5l H20 sau đó bỏ vào đây môi trường dinh

dưỡng để phân lập tảo, đun sôi, thạch tan

ra trong suốt thì dừng lại, thạch gần đông đổ vào các hộp lồng(mỗi hộp khoảng 10 ml)

- Phân lập: Tảo tự nhiên thu bằng lưới thực vật nổi, sau đó dùng pipet lấy một vài

giọt nước tảo đổ vào dĩa peti, dùng que

cấy tráng điều trên mặt thạch Sau 3-4

ngày thạch nổi lên các khuẩn lạc Mỗi

một loài khác nhau, khuẩn lạc có hình

dạng khác nhau, sau đó đưa khuẩn lạc vào ống nghiệm có dinh dưỡng, nuôi trong sinh khối Chu kỳ sinh trưởng của tảo lục dài hơn tảo silic

Ảnh hưởng của môi trường nuôi khác nhau lên 4 loài tảo

Hiện tượng lây nhiễm & cách sử lý

• Các đối tượng lây nhiễm tảo:

Vi khuẩnNguyên sinh động vật & các loài tảo không mong muốn khác

• Nguồn lây nhiễm:

Môi trường nuôi (nước biển & chất dinh dưỡng) Không khí (từ ống sục khí & từ bên ngoài)

Dụng cụ nuôi & từ mẻ nuôi

• Xử lý nước:

Vật lý: lọc, hấp tiệt trùng, tia UVHoá học: chlorine, acid, ozone

3.5 Kỹ thuật nuôi tảo

• Trong nhà/ngoài trời ( indoor/outdoor)

• Hở/kín (close/open)

• Thuần/không thuần

• Theo mẻ, liên tục & bán liên tục

Ưu và nhược điểm của các pp nuôi tảo

• Nuôi indoor/outdoor: Nuôi indoor cho phép kiểm soát ánh sáng, nhiệt độ, chất dinh dưỡng, sự lây nhiễm,

ngược lại nuôi outdoor rất khó khi mở rộng việc sản xuất sinh khối một loài tảo đặc trưng

• Hở/Kín: Nuôi hở trong các ao hoặc bể không được che đậy dễ bị nhiễm hơn nuôi trong các dụng cụ như ống nghiệm, bình tam giác, túi …

• Thuần (sterile)/không thuần: Nuôi thuần không có các

vi sinh vật khác và yêu cầu khử trùng nghiêm ngặt các dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi để tránh bị nhiễm.

• Theo mẻ, liên tục & bán liên tục

Các yêu cầu trong quá trình nuôi tảo

Nuôi theo mẻ (Batch culture)

Nuôi một loại tb tảo trong môi trường được cung cấp dinh dưỡng trong thời gian nhất định & thu hoạch khi quần thể tảo đạt mật độ cực đại hoặc gần cực đại

Được áp dụng rộng rãi vì đơn

giản & cơ động

Việc thu hoạch cần thực hiện

truớc pha bão hoà

Chất lượng tảo thu hoạch khó

có thể biết trước & biến động

theo thời gian thu hoạch

Phương pháp nuôi theo mẻ

• Lượng tảo cấy vào bằng 2- 10%

khối lượng nuôi cuối cùng

• Tảo nuôi từng mẻ được thu ngay

trước khi bắt đầu pha ổn định

• Một nhược điểm của hệ thống

nuôi từng mẻ là sự nhiểm bẩn,

nhiểm tạp và đòi hỏi chi phí cao

cho quá trình thu hoạch, làm

sạch, cấy tảo lại

Nuôi nhân giống

* Dung dịch 1 (tăng trưởng)

Nuôi sinh khối trong nhà

Túi nhựa 480 l

Túi 80 l có khung bao quanh

Túi PVC có luới nhựa bao quanh

Ống trụ bằng sợi thuỷ tinh 100 l

Nước biển cung cấp được lọc qua hệ thống lọc 1μm, sục khí Hàng ngày sục CO2

3 - 4 lần Sau 4 - 5 ngày tảo đạt mật độ cực đại Khi trời nắng và nhiệt độ trong khoảng 26 - 290C, tảo Isochrysis đạt đỉnh cao ở mật độ 12 - 14 triệu tb/ml, tảo Dunaliella ở mật độ 10 - 12 triệu tb/ml trong vòng 5 -6 ngày

Qui trình bán kín (Pro-Closed ) ở quy mô

công nghiệp

• Tảo được nuôi cấy trong một loạt các

dàn phản ứng sinh quang hoá

(PhotoBioReactor),

• điều kiện sinh trưởng của tảo như

dung dịch nuôi dưỡng, nhiệt độ, độ

pH, chu kỳ chiếu sáng, cường độ ánh

sáng, hàm lượng khí CO2 điều do

một hệ thống máy tính điều khiển

• và hệ thống hoàn toàn vô trùng và

khép kín, cách ly hoàn toàn với môi

trường bên ngoài

3.6 Nuôi sinh khối trong ao ngoài trời

Tóm tắt những ưu điểm, nhược điểm chủ yếu

của các kỹ thuật nuôi tảo khác nhau

Kiểu nuôi tảo Ưu điểm Nhược điểm

Dễ hơn, tương đối hiệu quả

Dễ nhất, đáng tin cậy nhất

Khó, chỉ có thể áp dụng khi nuôi với số lượng nhỏ, thiết bị phức tạp, chi phí cao

Chất lượng thất thường, ít tin cậy

Ít hiệu quả nhất, chất lượng có thể thất thường

Phương pháp nuôi ngoài trời

• Ao nuôi tảocó đáy nền đất tự nhiên

hoặc bằng cement, nhựa hoặc PVC

• Các chất dinh dưỡng có thể dựa trên

nguồn phân bón nông nghiệp;

• ao thường có độ sâu 0.25-1.0 m

• Nuôi tảo trong ao thường rẻ nhưng chỉ

thích hợp cho một số loài tảo sinh

trưởng nhanh do ao dễ bị nhiễm bởi

địch hại, ký sinh trùng và các loài

rong tảo khác

• Tại Đài loan, Skeletonema costatum

được nuôi thành công trong các ao

cement có thể tích 10-40 m3 và độ sâu

1.5-2.0 m

Một số nhân tố môi trường trong sản xuất tảo

Một số nhân tố môi trường trong sản xuất tảo

Chlorella

• Chlorella được biết đến nhiều bởi vai trò

quan trọng của nó về dinh dưỡng cũng

như là nhân tố môi trường trong nuôi

trồng thủy sản

• Việc dùng Chlorella vào trong sản xuất

đó là phương pháp nước xanh được áp

dụng rộng rãi trong sản xuất giống tôm

càng, một số loài cá và hai mảnh vỏ

• Khi ương ấu trùng tôm càng xanh, tảo

có thể thúc đẩy sự tăng trưởng của ấu

trùng tôm thông qua việc loại bỏ NH3 và

một số chất độc khác

• Sự bổ sung tảo sẽ làm cho môi trường

nước trở nên giàu dinh dưỡng, cung cấp

những hợp chất vi lượng mà thức ăn ban

đầu và thức ăn bổ sung không có

• Chlorella cũng được chú ý nhiều

trong sản xuất giống cua (Scylla

serrata)

• Tỉ lệ sống của cua cao nhất bằng

cách thêm Chlorella vào môi trường

ương

• Ở Đài Loan khi ương ấu trùng cá

măng, người ta bổ sung Chlorella

vào bể với mật độ: 50-350 x 104 tế

bào/lít để duy trì chất lượng nước và

quần thể luân trùng-thức ăn chính

của ấu trùng tôm, mặc dù tôm có ăn

trực tiếp tảo hay không chưa được

chứng minh.

• Trong ương ấu trùng cá Grey

mullet, Chlorella cũng được thêm

vào bể ấu trùng trong những ngày

đầu tiên với mật độ 500-700 x 103 tế

bào/ml.