CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM, NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM – PHẦN 1 pps

Ngoài ra có thể sử dụng một loại băng dính đặt vào chỗ da nhiễm nấm như lang ben rồi kéo ra soi hoặc cho vào môi trường nuôi cấy, kết quả thường cao hơn phương pháp cạo vẩy khoảng 10%..

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM,

NUÔI CẤY, PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN NẤM –

PHẦN 1

4.1 Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm:

Trong la bo xét nghiệm chẩn đoán nấm thì công việc lấy mẫu rất quan trọng, phục vụ cho việc xét nghiệm trực tiếp hoặc cho nuôi cấy phân lập Kết quả xét nghiệm phụ thuộc vào cách lấy mẫu từ bệnh nhân

+ Những điều cần lưu ý:

- Khi sử dụng những dụng cụ lấy mẫu cần phải tiệt trùng để tránh nhiễm khuẩn hoặc nấm mốc từ môi trường xung quanh, nếu không sẽ gây khó khăn cho việc xét nghiệm cũng như nuôi cấy

- Khoảng 10 ngày trước khi lấy mẫu bệnh nhân không được sử dụng thuốc chống nấm

- Khi soi phải quan sát ít nhất 30 vi trường trước khi kết luận

+ Kỹ thuật lấy bệnh phẩm ở các vị trí khác nhau:

- Bệnh phẩm ở da: cạo lấy phần da cạnh chỗ bị nhiễm, trên bờ viền thường cho kết quả tốt Ngoài ra có thể sử dụng một loại băng dính đặt vào chỗ da nhiễm nấm (như lang ben) rồi kéo ra soi hoặc cho vào môi trường nuôi cấy, kết quả thường cao hơn phương pháp cạo vẩy khoảng 10%

- Bệnh phẩm ở ngón chân: có thể dùng kéo, kẹp hoặc đầu mũi dao tù cạo lấy mẫu từ chỗ da ngón chân bị nhiễm Trong trường hợp da ngón chân không bị nứt

nẻ thì cần lấy những phần vẩy da đang bong để xét nghiệm

- Bệnh phẩm ở móng tay: cần cạo móc lấy những mảnh vụn tơi ở dưới móng bằng một dụng cụ có đầu tù để tránh bị đau

- Bệnh phẩm ở tóc, ở da đầu: cắt lấy một ít tóc, nhổ chân tóc hoặc cạo ít vẩy da

ở chỗ bị nhiễm nấm xét nghiệm

4.2 Phương pháp soi bệnh phẩm trực tiếp trong dung dịch KOH 20-30%:

+ Các bệnh phẩm là sợi tóc, mẩu vụn móng tay, vẩy da được đặt lên lam kính có 1 - 2 giọt dung dịch KOH 20%, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, dưới tác dụng của kiềm và nhiệt những đám tế bào da sẽ tách rời nhau

+ Trường hợp bệnh phẩm có nấm thì sẽ dễ dàng quan sát thấy những sợi nấm, những bào tử đốt (arthrospora) sẽ tản ra dễ phân biệt với những tế bào của động

vật Tuy nhiên cần phải chú ý phân biệt những hạt dạng sợi, hạt mỡ, những tế bào sừng với tế bào nấm để tránh nhầm lẫn trong khi xét nghiệm Kết quả soi trực tiếp xem hình 4.1

Hình 4.1: Những sợi nấm trong bệnh phẩm xét nghiệm trực tiếp

1 Ở vẩy da; 2 Ở móng

4.3 Phương pháp nuôi cấy, định loại nấm da:

+ Môi trường cơ bản Sabouraud nuôi cấy chẩn đoán nấm da:

Bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp soi bệnh phẩm dưới kính hiển vi chỉ cho biết có nấm hay không nhưng không thể biết đó là loài nấm gì, vì vậy cần phải tiếp tục nuôi cấy để phân lập nấm và định danh Môi trường hay dùng nhất là môi trường Sabouraud, thường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, sau 1-2 tuần quan sát sự phát triển của nấm có thể xác định loài Trên thực tế tỉ lệ giữa triệu chứng lâm sàng, kết quả soi trực tiếp và nuôi cấy là 3 : 2 : 1 (3 trường hợp có triệu chứng lâm sàng soi trực tiếp dương tính 2 và nuôi cấy dương tính 1)

Thành phần môi trường: Pepton 10 gam

Glucoza 40 gam

Thạch (oxoid) 10 gam

Nước cất vừa đủ 1000 ml

+ Môi trường Sabouraud có kháng sinh:

Khi phân lập nấm da thường có các vi khuẩn và nấm hoại sinh phát triển do vậy thường sử dụng môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh thích hợp ức chế

sự phát triển của vi khuẩn và các nấm mốc khác, chỉ cho nấm da phát triển Để ngăn cản vi khuẩn có trong bệnh phẩm người ta thường cho vào môi trường Sabouraud kháng sinh

- Môi trường Sabouraud có penicilin, streptomycin và actidion: tiệt trùng môi trường trong nồi hấp ở nhiệt độ 1200C trong 10-15 phút, để nguội khi nhiệt độ còn khoảng 500C cho 250.000 đơn vị penicilin, 250 mg streptomycin và 500 mg actidion vào quấy đều, đóng vào ống nghiệm hoặc hộp lồng Môi trường này được dùng để cấy những mẫu bệnh phẩm vào để phân lập xác định nấm da

- Môi trường Sabouraud có cloramphenicol và desertomycin: thành phần môi trường Sabouraud như trên Sau khi hấp tiệt trùng xong cho 50 mg cloramphenicol và

500 mg desertomycin vào quấy đều rồi cho vào ống nghiệm hoặc hộp lồng Có thể

cho vào trước khi tiệt trùng trong nồi hấp cũng được vì hai chất này chịu nhiệt Sử dụng môi trường này cũng giống như môi trường trên

- Môi trường Mycosel:

trong etanol hoặc aceton, lọc qua phễu lọc cản trùng rồi đưa vào môi trường trên,

lắc đều và cho vào ống nghiệm để nghiêng hoặc vào hộp lồng Môi trường bảo quản trong tủ lạnh dùng dần

+ Nutritional test:

Nhiều loại nấm da cần một số chất như thiamine, inositol, histidine hoặc axit nicotinic để phát triển Người ta đã ứng dụng tính chất này vào định loại nấm bằng cách cho vào môi trường cơ sở (thạch casamino axit, ammonium nitrate) những vitamine hoặc những amino axit trên, môi trường cơ sở được dùng làm chứng Khi

nuôi cấy, nấm da sẽ phát triển khi có chất thích hợp (bảng 9)

Bảng 9: Sự phát triển của nấm trên nutritional test medium

Môi trường casamino acid

Môi trường ammonium nitrate Loài

T.gallinae 3+ 4+ 4+

* Base medium: môi trường cơ sở

1 Thêm inositol 2 Thêm inositol thiamine

3 Thêm thiamine 4 Thêm nicotinic acid 5 Thêm histidine

+ Môi trường DTM (Dermatophyte Test Medium): dùng để xét nghiệm một mẫu bệnh phẩm nghi ngờ có nấm da hay không Khi nuôi cấy nấm da trong môi trường này ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần, nếu môi trường chuyển màu từ đỏ sang vàng là nấm da

Gentamycin sulfat 0,1 gam

độ 1210C và để nguội đến 470C Hòa tan 0,1 gam chlortetracycline HCl trong 25ml nước tiệt trùng, tiệt khuẩn, bổ sung vào môi trường, lắc kỹ để thuốc hòa đều trong môi trường Rót ra hộp lồng, nếu chưa dùng ngay cần để vào trong tủ lạnh

4.4 Phương pháp phân lập nấm da từ đất:

Vanbreuseghem đã đưa ra phương pháp phân lập nấm da từ đất bằng cách dùng tóc người hoặc lông của động vật (như bờm ngựa) để “bẫy nấm” Phương pháp này được coi là hoàn thiện nhất và được nhiều nhà nghiên cứu nấm da ứng dụng Từ khi phương pháp này ra đời ngừơi ta đã tìm thấy thêm một số loài nấm

da mới như T.georgiae, T.longifusum, T.vanbreuseghemii, T.gloriae và số dạng

sinh sản hữu tính của nấm da cũng được phát hiện ngày càng nhiều

Cách thực hiện:

+ Chuẩn bị tóc: lấy một ít tóc trẻ em rửa mỡ (bằng ether, acetone hay cồn), cắt nhỏ thành những đoạn 1 cm, để tóc vào hộp lồng đậy nắp và tiệt trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1200C/ 10-15 phút Tóc đã xử lý như vậy có thể để hàng năm

+ Cách lấy mẫu: đất để phân lập có thể là đất cày bừa, đất hoang, đất đồi, đất vườn… Gạt lớp đất ở phía trên và lấy ở lớp đất phía dưới sâu khoảng 3 cm đựng vào dụng cụ vô trùng

+ Nuôi cấy: đất cho vào hộp lồng mỗi hộp khoảng 20-30 gam đất Trường hợp đất khô cần làm ẩm bằng một ít nước cất vô trùng (2-4 ml) Đặt vào phía trên mặt đất một lớp tóc người đã cắt nhỏ Sau đậy nắp hộp lồng, đặt vào chỗ tối và để ở nhiệt độ phòng khoảng 20-250C, hàng tuần kiểm tra xem nấm mọc chưa

+ Kết quả: thường sau 3-4 tuần nấm phát triển tốt trên các sợi tóc, màu hơi

trắng hoặc hơi vàng nâu tùy thuộc từng loài nấm (hình 4.2) Trong một số trường

hợp dạng sinh sản hữu tính cũng được hình thành trên những sợi tóc Khi có nấm mọc thì ta dùng kẹp lấy một vài sợi tóc có nấm mọc đặt lên lam kính có một giọt nước hay lactophenol, đậy lamen rồi soi dưới kính hiển vi, dựa vào hình dạng của nấm có thể định danh được loài nấm da Tuy nhiên ta cần nuôi cấy nấm trên vào môi trường Sabouraud có chứa kháng sinh để tiếp tục định danh nấm

Hình 4.2: Nấm da phân lập từ đất, theo phương pháp bẫy tóc

1 M.gypseum, phát triển sau 5 tuần

2 T.ajelloi, phát triển sau 5 tuần

4.5 Phương pháp nuôi cấy vi thể trên lam kính (microculture):

Ballagi đã đưa ra phương pháp nuôi cấy nấm trên lam kính để nghiên cứu các

cơ quan khác nhau của nấm như các cơ quan sinh sản vô tính và các cơ quan khác

Do đó, người ta đã nghiên cứu nấm một cách rõ ràng, đầy đủ và không bị dập nát Người ta đã ứng dụng phương pháp này nhiều trong nghiên cứu phân loại xác định các loài nấm da

Phương pháp này được cải tiến như sau:

+ Chuẩn bị hộp lồng: sử dụng lam kính sạch và tiệt trùng bằng cách hơ đi hơ lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn Đặt lên một que thủy tinh uốn thành hình chữ U

ở trong hộp lồng, bên trong hộp lồng đặt một miếng bông hoặc giấy có thấm nước cất để duy trì độ ẩm tạo điều kiện cho nấm phát triển tốt

+ Chuẩn bị thạch: dùng cái khoan đục lỗ hoặc cắt thạch thành những hình vuông kích thước 5-10 mm, cao khoảng 3 mm Đặt thạch vào giữa lam kính

+ Dùng que cấy nấm vào bề mặt và xung quanh khoanh môi trường, dùng lamen đã tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội đậy vào mặt thạch

+ Để ở nhiệt độ phòng, sau 7-10 ngày nấm sẽ phát triển, lan ra xung quanh và lan ra lamen

+ Nhấc nhẹ nhàng lamen có nấm phát triển ra khỏi cục thạch đặt lên lam kính Lấy lam kính có nấm phát triển ở dưới ra đậy một lamen khác lên Cho một giọt

dung dịch không màu hay thuốc nhuộm thích hợp rồi đem soi kính hiển vi (hình

4.3)

Hình 4.3: Kỹ thuật nuôi cấy vi thể trên lam kính

1 Chuẩn bị hộp lồng,

2 Chuẩn bị thạch,

3 Đặt thạch lên lam kính,

4 Cấy nấm vào rìa của thạch,

5 Đậy lamen lên thạch, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng,

6 Lấy lamen ra đặt lên một lam kính khác có thuốc nhuộm,

7 Lấy lam kính, nhỏ thuốc, đậy một lamen khác lên, dán nhãn

4.6 Kỹ thuật nuôi cấy phát hiện cơ quan “đâm chọc” của nấm trên sợi tóc

(test xuyên tóc - hair penetration test):

Nhiều chủng T.rubrum và T.mentagrophytes rất khó phân biệt nếu chỉ dựa vào

hình thể đại thể cũng như vi thể Test xuyên tóc để phát hiện cơ quan “đâm chọc” của nấm trên sợi tóc là một phương pháp để phân biệt hai loại này Nếu thấy

những cơ quan “đâm chọc” hình chêm vuông góc với sợi tóc (hình 4.4) (test dương tính) đó là nấm T.mentagrophytes, nếu test âm tính là T.rubrum

Phương pháp: có thể tiến hành

theo một trong hai phương pháp sau

+ Phương pháp của Thammayya, Ajello, Galgoczy: dùng pipet vô trùng lấy môi trường Sabouraud có chứa kháng

Hình 4.4: Cơ quan “đâm chọc”

(cái khoan) của nấm trong sợi tóc

Hình 4.5: Test xuyên tóc (phương pháp

của Thammayya, Ajello, Galgoczy)

1 Sợi tóc; 2 Nấm được cấy vào; 3 Giọt thạch

4 Hộp lồng; 5 Miếng bông thấm ướt

sinh ở dạng lỏng, nhỏ từng giọt riêng biệt vào đáy một hộp lồng vô trùng, để cho đông lại Dùng một kẹp vô trùng đặt vào mặt giọt thạch vài sợi tóc (chuẩn bị như phương pháp bẫy tóc), sau đó cấy nấm lên trên, lật ngược hộp lồng lên và phía

dưới cũng đặt một miếng bông thấm nước để giữ ẩm môi trường (hình 4.5) Để ở

nhiệt độ phòng, hàng ngày kiểm tra sợi tóc dưới kính hiển vi để quan sát sự tạo thành cơ quan “đâm chọc” của nấm

+ Phương pháp thứ hai: cho 20-30 ml nước tiệt trùng vào hộp lồng đã có 10-20 sợi tóc, thêm 2-3 giọt dịch chiết men 10% vào hộp lồng Cấy một ít nấm vào dung dịch, đậy nắp, ghi nhãn và để ở nhiệt độ phòng Sau 2-4 tuần kiểm tra

4.7 Những phương pháp kiểm tra hình dạng vi thể của nấm:

4.7.1 Kiểm tra hình dạng nấm in situ:

Trong một số trường hợp có thể kiểm tra trực tiếp hình dạng của nấm ngay trên khuẩn lạc trong hộp lồng hoặc ngay trong ống nghiệm Với độ phóng đại và ánh sáng thích hợp có thể quan sát thấy các cơ quan của nấm và có thể nhận xét ban đầu về một loài nấm

Phương pháp: đặt ống nghiệm nằm ngang trên bàn của kính hiển vi và điều chỉnh vật kính ra rìa của ống nghiệm (có thể soi trực tiếp một khuẩn lạc nấm trong hộp lồng với một lớp môi trường mỏng) có thể thấy đầy đủ các cơ quan của nấm

như bào tử nhỏ, bào tử lớn, bào tử áo cũng như các vòng xoắn của nấm Dựa vào đặc điểm hình dạng của bào tử lớn người có thể định danh được một số loài nấm

4.7.2 Tiêu bản nấm trong nước cất:

Trong một số trường hợp có thể soi hình dạng nấm trong giọt nước Lợi ích của phương pháp này là chỉ số khúc xạ của ánh sáng đi qua tiêu bản và chỉ số khúc

xạ của nước khác nhau ít nên hình ảnh của nấm được nhìn rõ Mặt khác do sự chênh lệch về nồng độ giữa trong và ngoài tế bào nấm nên nước khuếch tán vào trong tế bào, làm tế bào nấm tăng kích thước, dễ dàng quan sát Trường hợp cần

đo kích thước thì không ứng dụng được phương pháp này

Phương pháp: trên lam kính giỏ một giọt nước, dùng que cấy lấy một ít nấm từ ống nuôi cấy hay từ hộp lồng, dùng hai đinh ghim nhỏ “xé” làm nhỏ chất nấm rồi đặt lamen lên trên, đem soi kính hiển vi

4.7.3 Tiêu bản nấm trong dung dịch glycerin:

Nhược điểm của tiêu bản trong nước là không giữ tiêu bản được lâu vì nước dễ bay hơi, làm khô tiêu bản Tiêu bản trong glycerin giữ được lâu hơn vì glycerin hạn chế sự bay hơi và hình ảnh quan sát vẫn rõ

4.7.4 Tiêu bản nấm trong dung dịch lactophenol:

Trong labo xét nghiệm nấm, dung dịch lactophenol thường được sử dụng để soi trực tiếp, với dung dịch này hình dạng và kích thước của nấm không thay đổi trong quá trình soi Dung dịch có độ nhớt, có thể quan sát với vật kính lớn mà hình ảnh của nấm không bị xê dịch Với dung dịch này có thể đo kích thước các cơ quan của nấm Tiêu bản có thể bảo quản duy trì lâu dài mà không bị khô

Nhược điểm là trong một vài trường hợp ảnh không được nét vì chỉ số khúc xạ của dung dịch lactophenol và ánh sáng có độ khác nhau lớn

Thành phần dung dịch lactophenol như sau:

Phenol tinh thể 20 gam

Axit lactic 20 gam

+ Thuốc nhuộm xanh cotton C4B:

Lactophenol 100 ml

Xanh cotton 0,5 gam

+ Thuốc nhuộm xanh cotton bão hoà Sudan:

Lactophenol bão hoà Sudan 100 ml

+ Dung dịch nhuộm Fuchin:

Fuchin bão hoà trong dung dịch cồn và nước: 4 ml

Xanh methylen bão hoà trong dung dịch cồn và nước: 2 ml

+ Dung dịch đỏ Công Gô:

Đỏ Công Gô 0,1 gam

Amonium hydroxit 10% 100 ml

Với dung dịch này dưới kính hiển vi có ánh sáng phân cực (plazizacios) thì độ dày của thành tế bào hay độ dày của bào tử áo quan sát rất rõ

4.7.7 Phương pháp PAS nhuộm nấm ở tổ chức:

Khi nhuộm tổ chức theo phương pháp hematoxylin thường không thấy rõ nấm, muốn phân biệt nấm với các tổ chức khác của cơ thể người hoặc động vật người ta thường nhuộm tiêu bản với thuốc nhuộm Schiff (còn gọi là PAS)

+ Các bước chuẩn bị thuốc nhuộm:

- Dung dịch axit Periodic (HJO4) 1%:

tủ lạnh có thể sử dụng dài ngày

- Dung dịch axit HCl 0,05N: hoà tan 0,5 gam NaHSO3 (natrihydroxisulfat) hoặc

K2S2O5 (kalimetabisulfat) vào trong 100 ml HCl 0,05N

- Dung dịch Lichgrun: hoà tan 1 gam Lichgrun vào 100 ml dung dịch axit acetic 1% được đun sôi

+ Quá trình tiến hành nhuộm tiêu bản:

- Tiêu bản kiểm tra nấm ở các tổ chức được cố định trong methyl alkohol với thời gian 2-4 phút

- Tráng tiêu bản bằng cồn 96% trong 1 phút

- Ngâm tiêu bản vào dung dịch Periodic trong 20 phút

- Rửa tiêu bản bằng nước máy chảy liên tục trong 5 phút

- Nhuộm tiêu bản trong thuốc nhuộm Schiff 15 phút

- Nhúng tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric trong 5 phút

- Nhúng lại tiêu bản vào dung dịch axit sulfuric khác trong 5 phút

- Nhúng tiêu bản vào cốc, đặt dưới vòi nước máy chảy liên tục 8 phút

- Nhúng tiêu bản vào dung dịch Lichgrun trong 2-5 phút

- Tráng tiêu bản bằng nước máy trong 1 phút

- Tráng tiêu bản bằng cồn 96% trong phút