Khảo sát tác dụng của cao lá chanh dây trên những thay đổi về vận động có liên quan đến hệ dopaminergic trên chuột nhắt trắng được gây độc bằng thuốc diệt cỏ paraquat

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là một trong những nước có nền nông nghiệp phát triển. Cùng với sự phát triển của khoa học trong lĩnh vực thuốc bảo vệ thực vật, người dân quen dần với phương thức sử dụng thuốc diệt cỏ trong sản xuất. Như hai mặt của một vấn đề, sử dụng thuốc diệt cỏ cũng có những mặt hạn chế của nó. Ngộ độc thuốc diệt cỏ, cũng như thuốc trừ sâu đang là vấn đề đáng được quan tâm hiện nay. Do có nhiều ưu điểm nổi bật nên paraquat thường được ưu tiên lựa chọn, và nhiều trường hợp ngộ độc do paraquat đã được báo cáo. Ở nồng độ cao, paraquat xâm nhập vào cơ thể thường gây độc tính cấp trên các cơ quan với các triệu chứng xảy ra nhanh chóng gây tổn thương phổi, gan, thận và dẫn đến tử vong trong thời gian ngắn. Bên cạnh đó, sự tiếp xúc lâu ngày với paraquat thường gây tổn thương trên hệ thần kinh trung ương. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, khi tiếp xúc với paraquat có thể gây mất mát chọn lọc các tế bào thần kinh dopaminergic giữa vùng chất đen (substantial nigra) và vùng thể vân (striatum), sự tổn thương này dẫn đến các biểu hiện bất thường về vận động tương tự như trong bệnh Parkinson 20. Đã có nhiều giả thuyết được đề nghị để giải thích cho độc tính thần kinh của paraquat. Một trong những nguyên nhân là do sự bùng nổ của các gốc tự do, dẫn đến tình trạng stress oxy hóa (oxidative stress), sau hàng loạt các phản ứng đưa đến cấu trúc tế bào bị tổn thương, đây cũng là cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh liên quan. Gốc tự do bình thường được tạo thành từ quá trình chuyển hóa của tế bào, giữ một vai trò nhất định trong hoạt động sống, khi thừa sẽ được trung hòa bởi hệ thống chống oxy hóa của cơ thể. Stress oxy hóa là kết quả của sự sản sinh quá mức các gốc tự do hoặc sự suy giảm của hệ thống chống oxy hóa 1. Từ đó, các nhà nghiên cứu nhận thấy tầm quan trọng của các chất chống oxy hóa trong sự sống, cũng như trong phòng và trị các bệnh có liên quan đến gốc tự do và stress oxy hóa. Chính vì thế công tác tìm kiếm và sàng lọc các chất chống oxy hóa trở nên có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Xây dựng mô hình gây tổn thương oxy hóa nói chung và mô hình gây thoái hóa hệ dopaminergic nói riêng có ý nghĩa đặc biệt cho việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh của các bệnh có liên quan. Trên cơ sở đó, chúng ta có thể tiến hành sàng lọc nhằm tìm ra các thuốc, hợp chất mới có thể áp dụng trong điều trị. Lá chanh dây từ lâu đã được sử dụng trong y học dân tộc ở các nước Châu Mỹ để trị các chứng lo âu, căng thẳng. Trong lá giàu các polyphenol, đặc biệt là flavonoid được xem là nhóm chất có tác dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên. Với những lý do nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát tác dụng của cao lá chanh dây trên những thay đổi về vận động có liên quan đến hệ dopaminergic trên chuột nhắt trắng được gây độc bằng thuốc diệt cỏ paraquat” đề tài được thực hiện với mục tiêu tổng quát là khảo sát độc tính trên tế bào thần kinh của paraquat, từ đó xây dựng nên mô hình gây tổn thương oxy hóa. Trên mô hình gây độc đã xây dựng, tiến hành công tác khảo sát tác dụng chống oxy hóa của một số thuốc, hợp chất và dược liệu. Với lợi thế về nguồn dược liệu phong phú, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.). Từ mục tiêu tổng quát chúng tôi đi sâu nghiên cứu các mục tiêu cụ thể sau: Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây. Xây dựng mô hình gây tổn thương hệ dopaminergic ở liều độc cấp của paraquat. Bước đầu khảo sát tác dụng của paraquat trên hệ serotonergic. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá chanh dây trên mô hình đã xây dựng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRẦN NGỌC TRINH

KHẢO SÁT TÁC DỤNG CỦA CAO LÁ CHANH DÂY TRÊN NHỮNG

THAY ĐỔI VỀ VẬN ĐỘNG CÓ LIÊN QUAN ĐẾN HỆ

DOPAMINERGIC TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG ĐƯỢC GÂY ĐỘC

BẰNG THUỐC DIỆT CỎ PARAQUAT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS DƯƠNG XUÂN CHỮ

Cần Thơ - 2011

  

Tôi xin cam đoan đây là công trình khảo sát và nghiên cứu của riêng tôi Các kếtquả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ côngtrình nào khác

Tác giả Trần Ngọc Trinh

LỜI CẢM ƠN

  

Trước hết, em xin kính gửi lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành nhất đến

thầy TS Dương Xuân Chữ, người thầy đã hết lòng hướng dẫn em trong suốt thời

gian thực hiện luận văn Thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết để truyền đạtcho em những kiến thức quý báu, người đã tận tình chỉ dẫn và cho em những lờikhuyên hữu ích

Em xin kính gửi lời cảm ơn đến thầy ThS Phạm Thành Suôl và các cô ThS.BS.

Cao Thị Kim Hoàng, ThS.BS Lê Kim Khánh, ThS Nguyễn Thị Hạnh và quý thầy cô

trong bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, các thầy cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện

thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin kính gửi lời cảm ơn đến cô ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh và các quý thầy cô trong bộ môn Dược liệu – Thực vật dược – Dược cổ truyền, quý thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, các thầy cô đã giúp đỡ để em có thể

hoàn thành tốt luận văn

Em xin cảm ơn hội đồng chấm luận văn và quý thầy cô phản biện đã dành nhiềuthời gian để đọc, nhận xét và góp ý cho luận văn của em hoàn chỉnh hơn

Em xin cảm ơn các anh DS Đặng Duy Khánh, DS Trần Bá Việt Quí, ThS.

Nguyễn Xuân Trường, các chị DS Mai Huỳnh Như, DS Trần Thái Phương Vy.

Cảm ơn bạn Cẩm Nghi, Yến Nhi và tập thể lớp Dược K32, cảm ơn đã giúp đỡ, động

viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Con xin kính gửi lời cảm ơn đến bà, cha mẹ, anh chị, cảm ơn gia đình luôn ởbên con, động viên và chia sẽ những khó khăn để con có thể hoàn thành tốt luận vănnày

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về hệ dopaminergic và hệ serotonergic 3

1.1.1 Hệ dopaminergic 3

1.1.2 Hệ serotonergic 3

1.2 Tổng quan về paraquat 4

1.2.1 Lịch sử 4

1.2.2 Đặc điểm về cấu trúc và tính chất lý hóa 4

1.2.3 Độc tính 5

1.2.3.1 Độc tính trên các cơ quan 5

1.2.3.2 Độc tính trên thần kinh 5

1.3 Gốc tự do và stress oxy hóa 7

1.3.1 Gốc tự do 7

1.3.2 Stress oxy hóa 9

1.3.3 Tổn thương do gốc tự do 10

1.3.3.1 Tổn thương trên lipid 10

1.3.3.2 Tổn thương trên protein 10

1.3.3.3 Tổn thương trên DNA (deoxyribonucleic acid) 12

1.4 Chất chống oxy hóa 12

1.4.1 Đại cương về chất chống oxy hóa 12

1.4.2 Đại cương về chanh dây 13

1.4.2.1 Tên gọi 13

1.4.2.3 Mô tả thực vật 14

1.4.2.4 Thành phần hóa học 14

1.4.2.5 Tác dụng và công dụng 15

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Động vật thí nghiệm 17

2.1.2 Dược liệu thí nghiệm 17

2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 17

2.1.4 Dụng cụ thí nghiệm 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Chiết xuất dược liệu và định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây 18

2.2.1.1 Chiết xuất dược liệu 18

2.2.1.2 Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây 18

2.2.2 Mô hình thí nghiệm chung 21

2.2.2.1 Giai đoạn 1: thăm dò dãy liều gây ngộ độc cấp của paraquat có tác động trên hệ dopaminergic và hệ serotonergic 21

2.2.2.2 Giai đoạn 2: khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá chanh dây với liều paraquat xác định 22

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ dopaminergic 23

2.2.3.1 Open field test 23

2.2.3.2 Rope climbing test 24

2.2.3.3 Nghiệm pháp chuột bơi gắng sức 25

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ serotonergic 26

2.2.4.1 Forced swimming test 26

2.2.4.2 Beam walking test 27

2.2.4.3 Tail suspension test 28

2.2.5 Xử lý kết quả 29

Chương 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 30

3.1.1 Hiệu suất chiết 30

3.1.2 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây 30

3.2 Kết quả thực nghiệm giai đoạn 1 33

3.2.1 Khảo sát tỉ lệ chuột chết sau 3 liều paraquat tăng dần 33

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ dopaminergic 35

3.2.2.1 Open field test 35

3.2.2.2 Rope climming test 36

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ serotonergic 37

3.2.3.1 Forced swimming test 37

3.2.3.2 Beam walking test 38

3.3 Kết quả thực nghiệm giai đoạn 2 39

3.3.1 Tỷ lệ chuột chết ở giai đoạn 2 39

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ dopaminergic và tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá chanh dây 40

3.3.2.1 Open field test 40

3.3.2.2 Rope climming test 41

3.3.2.3 Nghiệm pháp chuột bơi gắng sức 42

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ serotonergic và tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá chanh dây 43

3.3.3.1 Forced swimming test 43

3.3.3.2 Beam walking test 44

3.3.3.3 Tail suspension test 45

Chương 4 - BÀN LUẬN 47

4.1 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây 47

4.2 Xây dựng và thăm dò dãy liều gây ngộ độc cấp của paraquat tác động trên hệ dopaminergic và hệ serotonergic 47

paraquat đã xác định 50

Chương 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BBB Blood brain barrier

CNS Central nervous system

DNA Deoxyribonucleic acid

DPPH 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl

PQ Paraquat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của cây chanh dây Passiflora edulis Sim., 13

Bảng 2.1 Dịch chiết dùng để định tính các nhóm hợp chất 19

Bảng 3.1 Số lượng chuột chết từng ngày tương ứng với 3 liều paraquat 33

Bảng 3.2 Phần trăm chuột chết từng ngày tương ứng với 3 liều paraquat 33

Bảng 3.3 Số ô vuông chuột di chuyển trong open field test 35

Bảng 3.4 Thời gian chuột rơi xuống trong rope climming test 36

Bảng 3.5 Tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming test 37

Bảng 3.6 Tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test 38

Bảng 3.7 Số ô vuông chuột di chuyển trong open field test 40

Bảng 3.8 Thời gian chuột rơi xuống trong rope climming test 41

Bảng 3.9 Thời gian chuột bơi trong nghiệm pháp chuột bơi gắng sức 42

Bảng 3.10 Tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming test 43

Bảng 3.11 Tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test 44

Bảng 3.12 Tổng thời gian chuột bất động trong tail suspension test 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hệ dopaminergic 3

Hình 1.2 Hệ serotonergic 4

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của paraquat 4

Hình 1.4 Cơ chế gây tổn thương thần kinh của paraquat qua trung gian gốc tự do

6

Hình 1.5 Sự hình thành gốc tự do 8

Hình 1.6 Nguyên nhân tạo nên stress oxy hóa 9

Hình 1.7 Quá trình peroxid hóa lipid 10

Hình 1.8 Quá trình oxy hóa protein 11

Hình 1.9 Sự tấn công DNA của gốc hydroxyl 12

Hình 1.10 Chanh dây 14

Hình 1.11 Cấu trúc các flavonoid trong chanh dây 15

Hình 1.12 Cấu trúc các alkaloid trong chanh dây 15

Hình 2.1 Sơ đồ chuẩn bị dịch chiết cho quá trình định tính 18

Hình 2.2 Mô hình thăm dò dãy liều của paraquat 21

Hình 2.3 Mô hình khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cao lá chanh dây với liều paraquat xác định 22

Hình 2.4 (A,B) Mô hình thí nghiệm open field test 24

Hình 2.5 Mô hình thí nghiệm rope climbing test 24

Hình 2.6 Mô hình nghiệm pháp chuột bơi gắng sức 25

Hình 2.7 Mô hình thí nghiệm forced swimming test 27

Hình 2.8 Mô hình thí nghiệm beam walking test 28

Hình 2.9 Mô hình thí nghiệm tail suspension test 29

Hình 3.1 Định tính triterpenoid 30

Hình 3.2 Định tính flavonoid 31

Hình 3.3 Định tính alkaloid 31

Hình 3.4 Định tính polyphenol 32

Hình 3.5 Định tính tanin 32

Hình 3.6 Định tính saponin 32

Hình 3.8 Phần trăm chuột chết từng ngày tương ứng với 3 liều paraquat 34

Hình 3.9 Tổng phần trăm chuột chết tương ứng với 3 liều paraquat 34

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn số ô vuông chuột di chuyển trong open field test 35

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn thời gian chuột rơi xuống rope climbing test 36

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming test 37

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test 38

Hình 3.14 Tỷ lệ chuột chết ở giai đoạn 2 39

Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn số ô vuông chuột di chuyển trong open field test 40

Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn thời gian chuột rơi xuống trong rope climbing test

41

Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn thời gian chuột bơi trong nghiệm pháp chuột bơi gắng sức 42

Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming test 43

Hình 3.19 Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test 44

Hình 3.20 Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong tail suspension test 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

  

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là một trong những nước có nềnnông nghiệp phát triển Cùng với sự phát triển của khoa học trong lĩnh vực thuốcbảo vệ thực vật, người dân quen dần với phương thức sử dụng thuốc diệt cỏ trongsản xuất Như hai mặt của một vấn đề, sử dụng thuốc diệt cỏ cũng có những mặthạn chế của nó Ngộ độc thuốc diệt cỏ, cũng như thuốc trừ sâu đang là vấn đề đángđược quan tâm hiện nay Do có nhiều ưu điểm nổi bật nên paraquat thường được ưutiên lựa chọn, và nhiều trường hợp ngộ độc do paraquat đã được báo cáo Ở nồng độcao, paraquat xâm nhập vào cơ thể thường gây độc tính cấp trên các cơ quan với cáctriệu chứng xảy ra nhanh chóng gây tổn thương phổi, gan, thận và dẫn đến tử vongtrong thời gian ngắn Bên cạnh đó, sự tiếp xúc lâu ngày với paraquat thường gây tổnthương trên hệ thần kinh trung ương Có nhiều nghiên cứu cho thấy, khi tiếp xúcvới paraquat có thể gây mất mát chọn lọc các tế bào thần kinh dopaminergic giữavùng chất đen (substantial nigra) và vùng thể vân (striatum), sự tổn thương này dẫnđến các biểu hiện bất thường về vận động tương tự như trong bệnh Parkinson [20]

Đã có nhiều giả thuyết được đề nghị để giải thích cho độc tính thần kinh củaparaquat Một trong những nguyên nhân là do sự bùng nổ của các gốc tự do, dẫnđến tình trạng stress oxy hóa (oxidative stress), sau hàng loạt các phản ứng đưa đếncấu trúc tế bào bị tổn thương, đây cũng là cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh liênquan Gốc tự do bình thường được tạo thành từ quá trình chuyển hóa của tế bào, giữmột vai trò nhất định trong hoạt động sống, khi thừa sẽ được trung hòa bởi hệ thốngchống oxy hóa của cơ thể Stress oxy hóa là kết quả của sự sản sinh quá mức cácgốc tự do hoặc sự suy giảm của hệ thống chống oxy hóa [1] Từ đó, các nhà nghiêncứu nhận thấy tầm quan trọng của các chất chống oxy hóa trong sự sống, cũng nhưtrong phòng và trị các bệnh có liên quan đến gốc tự do và stress oxy hóa Chính vìthế công tác tìm kiếm và sàng lọc các chất chống oxy hóa trở nên có ý nghĩa đặcbiệt quan trọng

Xây dựng mô hình gây tổn thương oxy hóa nói chung và mô hình gây thoái hóa hệdopaminergic nói riêng có ý nghĩa đặc biệt cho việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinhcủa các bệnh có liên quan Trên cơ sở đó, chúng ta có thể tiến hành sàng lọc nhằmtìm ra các thuốc, hợp chất mới có thể áp dụng trong điều trị Lá chanh dây từ lâu đãđược sử dụng trong y học dân tộc ở các nước Châu Mỹ để trị các chứng lo âu, căngthẳng Trong lá giàu các polyphenol, đặc biệt là flavonoid được xem là nhóm chất

có tác dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên

Với những lý do nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát tác dụng

của cao lá chanh dây trên những thay đổi về vận động có liên quan đến hệ dopaminergic trên chuột nhắt trắng được gây độc bằng thuốc diệt cỏ paraquat” đề tài được thực hiện với mục tiêu tổng quát là khảo sát độc tính trên tế

bào thần kinh của paraquat, từ đó xây dựng nên mô hình gây tổn thương oxy hóa.Trên mô hình gây độc đã xây dựng, tiến hành công tác khảo sát tác dụng chống oxyhóa của một số thuốc, hợp chất và dược liệu Với lợi thế về nguồn dược liệu phongphú, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát tác dụng

chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.) Từ

mục tiêu tổng quát chúng tôi đi sâu nghiên cứu các mục tiêu cụ thể sau:

- Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây

- Xây dựng mô hình gây tổn thương hệ dopaminergic ở liều độc cấp của paraquat

- Bước đầu khảo sát tác dụng của paraquat trên hệ serotonergic

- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá chanh dây trên mô hình

đã xây dựng

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về hệ dopaminergic và hệ serotonergic

1.1.1 Hệ dopaminergic

Có 3 hệ thống dopaminergic chính:

- Hệ thống nhân đen thể vân (nigrostriatal

trart): chạy từ các tế bào ở nhân đen

(substantial nigra) để tới thể vân (striatum)

kiểm soát về hành động, khi các receptor

dopamin của hệ thống này bị khoá sẽ gây

ra các tổn thương về vận động Trong

bệnh parkinson hệ nhân đen thể vân bị

thoái hoá gây ra các triệu chứng bất

thường về vận động

- Hệ thống trung não hồi viền (mesolimbic), trung não vỏ não (mesocortical): chạy

từ các thân tế bào ở vùng trần trung não (ventoal tegmentalarca - VTA) nằm sátngay gần nhân đen, để tới gần hết các vùng vỏ não thuỳ trái và hệ viền

- Hệ thống u - phễu (tuberoin fundibular trart): thân tế bào nằm ở vùng các hạt nhân(arcuate nucleus) và khu vực xung quanh não thất ở dưới đồi, chạy đến vùng phễu

và thuỳ trước tuyến yên Các chất bài tiết ở đây điều hòa bài tiết nhiều hormon củatuyến yên [2]

1.1.2 Hệ serotonergic

Hệ thống serotonergic trung ương có vị trí chủ yếu của các tế bào serotonergic là ởphía trên cầu não và não giữa, đặc biệt tập trung ở nhân Raphe Các neuron nàychạy đến vỏ não, tiểu não, hệ viền, vùng dưới đồi, vùng hải mã và tủy sống

Chức năng của hệ serotonergic là kiểm soát tính khí, tâm trạng và xúc cảm, có vai

trò trong khả năng ghi nhớ, liên quan đến trạng thái thức ngủ, kiểm soát đường cảm

giác kể cả nhận cảm đau, kiểm soát thân nhiệt [2]

Hình 1.1 Hệ dopaminergic

1.2 Tổng quan về paraquat

1.2.1 Lịch sử

Năm 1882, paraquat (PQ) được tổng hợp lần đầu tiên Tuy nhiên đặc tính diệt cỏcủa PQ vẫn chưa được công nhận mãi cho đến năm 1955 Vào năm 1962, PQ lầnđầu được sản xuất với mục đích kinh doanh và được phân phối bởi ICI (ImperialChemical Industries) Ngày nay PQ là một trong những thuốc diệt cỏ thông dụng,

có một thị trường tiêu thụ lớn với khoảng 130 quốc gia trên toàn thế giới PQ chotác dụng diệt cỏ nhanh, là thuốc diệt cỏ không chọn lọc, thường được sử dụng dướidạng muối dichloride PQ được lưu thông trên thị trường với nhiều tên thương mạikhác nhau, Gramoxone sản phẩm của Syngenta là một trong những thương hiệu nổitiếng của PQ Do độc tính cao nên chế phẩm chứa PQ thường được thêm chất gâynôn, tạo màu, mùi để tránh sự nhầm lẫn

1.2.2 Đặc điểm về cấu trúc và tính chất lý hóa

Cấu tạo hóa học

Hình 1.2 Hệ serotonergic

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của paraquat

Tên thông dụng: paraquat hoặc paraquat dichloride.

Danh pháp quốc tế (IUPAC): 1,1’-dimethyl-4,4’-bipyridinium hoặc 4,4'-bi-pyridinium

N,N'-dimethyl-Tên thương mại: Crisquat, Dexuron, Esgram, Gramuron, Para-col, Pillarxone, col, Toxer Total, Cyclone, Gramixel, Gramoxone, Preeglone, Pectone

Tota-Khối lượng phân tử: dạng cation 186,3, dạng dicloride 257,2

Trạng thái: dạng bột trắng nhạt, không mùi, hút ẩm

1.2.3 Độc tính

1.2.3.1 Độc tính trên các cơ quan

PQ xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường uống, hô hấp hoặc tiếp xúc qua da,được tổ chức y tế thế giới phân loại là chất độc cấp II (moderately hazardous) Khinuốt phải, độc tính phụ thuộc vào nồng độ của paraquat trong máu biểu hiện nhưđau bụng, viêm thực quản, nuốt khó, nôn, tiêu chảy Sau một thời gian gây hoại tử

tế bào gan, làm tăng men gan, gây tổn thương đến hệ thống ống lượn và cầu thậndẫn đến thiểu niệu, vô niệu Sau cùng dẫn đến suy đa cơ quan, suy tuần hoàn cấp và

tử vong nếu không chữa trị kịp thời

Tiếp xúc qua da gây kích ứng, viêm, phồng rộp da, tiếp xúc ở móng có thể gây đốmtrắng, nứt, hoặc mất móng, gây viêm loét biểu mô giác mạc và kết mạc khi tiếp xúc

ở mắt Da là một lớp bảo vệ cơ thể tránh sự xâm nhập của PQ, khi da bị tổn thươngbiểu hiện ngộ độc giống trường hợp nuốt phải qua đường tiêu hóa

Độc tính cao khi hít phải gây chảy máu mũi, kích thích hô hấp, đau họng, phù phổicấp và có thể gây tử vong

1.2.3.2 Độc tính trên thần kinh

Những nghiên cứu về độc tính của PQ cho thấy khi tiếp xúc với liều cao PQ gâyđộc tính chủ yếu trên phổi, thường dẫn đến tử vong sớm Với liều độc mãn ảnhhưởng chủ yếu trên thần kinh, gây thoái hóa hệ dopaminergic giữa vùng chất đen(substantial nigra) và thể vân (striatum), hai vùng não quan trọng trong việc duy trìbình thường chức năng vận động [23] Nhiều nghiên cứu cho thấy mối quan hệ giữabệnh Parkinson và sự thoái hóa hệ dopaminergic [30] Bệnh Parkinson thường được

biểu hiện thông qua các triệu chứng như run khi nghỉ ở 1 hoặc 2 bên cơ thể, cứng

cơ, vận động chậm, giảm chức năng vận động và suy giảm phản xạ tư thế Do khảnăng gây độc tế bào thần kinh của PQ nên có nhiều nghiên cứu cho rằng PQ có thể

là một trong những yếu tố liên quan đến quá trình phát sinh bệnh Parkinson [34]

Khả năng gây độc tế bào của PQ được giải thích là do sự bùng nổ của các GTD đưađến quá trình stress oxy hóa PQ tham gia vào chu trình oxy hóa khử tạo ra các gốc

tự do (GTD) làm tổn hại đến protein, lipid, DNA (deoxyribonucleic acid) Cơ chếđược đề nghị là PQ ở dạng oxy hóa (PQ++) sẽ bị khử bởi các enzym reductase của tếbào, chủ yếu là bởi NADPHcytochrome P-450 reductase, NADPH-cytochrome creductase, và Complex I của ty thể được biết như NADH (Ubiquinonoxidoreductase) hình thành gốc PQ tự do hóa trị 1 (PQ monocation free radical )(PQ•+) Ngay sau đó, PQ•+ sẽ bị oxy hóa trở lại trong sự hiện diện của oxy tạo ra cácgốc superoxid (O2•−), điều này đã dần đến sự hình thành ồ ạt các reactive oxygenspecies (ROS) thứ cấp khác, chủ yếu là hydrogen peroxid (H2O2) và gốc hydroxyl(OH) Kết quả của quá trình dẫn đến sự phá hủy cấu trúc tế bào, gây ra sự chết tếbào [34]

Hình 1.4 Cơ chế gây tổn thương thần kinh của paraquat qua trung gian gốc tự do

Một đặc tính quan trọng liên quan đến độc tính của paraquat là khả năng thấm đượcqua hàng rào máu não (blood brain barrier (BBB)) để vào hệ thần kinh trung ương.

PQ là một phân tử tích điện, có cấu trúc thân nước, do đó khó qua được BBB Tuynhiên, nghiên cứu trên chuột cho thấy PQ qua được BBB và đạt nồng độ tối đa sau24h, so với các mô khác là 30 phút Điều này được giải thích là do sự hiện diện củacác hệ thống vận chuyển Ở phổi là hệ thống vận chuyển các polyamin Ở não, PQđược chuyên chở thông qua hệ thống vận chuyển các amino acid trung tính (BBBneutral amino acid transporter) gây sự tích tụ và tổn thương não Trên mô hìnhchuột thử nghiệm sự tích tụ và tổn hại của PQ trên hệ thần kinh trung ương (centralnervous system (CNS)) có thể ngăn chặn được khi sử dụng các amino acid như: L-valin, L-phenylalanin, hoặc levodopa trước khi cho chuột tiếp xúc với PQ Điều nàyđược lý giải là do các amino acid cạnh tranh với PQ trên hệ thống vận chuyển đểvào trong CNS Một chế độ ăn hợp lý được bổ sung đầy đủ các amino acid hoặc trịliệu bằng levodopa có thể điều chỉnh tổn hại của PQ thông qua cơ chế cạnh tranhvận chuyển vào trong CNS Khi vào trong CNS, PQ được chuyển hóa qua chu trìnhoxy hóa khử hình thành các GTD, gây tổn hại và làm chết tế bào

Một vài nghiên cứu được tiến hành nhằm giải thích cho sự vào được các tế bào thểvân của PQ Nhiều giả thuyết cho rằng, tương tự như hệ thống vận chuyển ở phổi,

PQ có thể được vận chuyển vào các tế bào thể vân là nhờ chất vận chuyển dopamin(dopamin transporter), vì nhận thấy sự phá hủy các tế bào dopamin thần kinh cũngnhư sự tổn hại vùng thể vân có thể được ngăn chặn bởi GBR-12909, là một chất ứcchế chọn lọc chất vận chuyển dopamin Tuy nhiên vấn đề này vẫn còn gây nhiềutranh cải [34]

1.3 Gốc tự do và stress oxy hóa

1.3.1 Gốc tự do

Gốc tự do (GTD) có thể được định nghĩa là những phân tử hay những mảnh phân tửchứa một hoặc nhiều electron độc thân trong các orbital nguyên tử hoặc phân tử.Các electron độc thân này thường làm cho các GTD có một mức độ phản ứng đáng

kể [1] Thường được chia thành 2 nhóm:

 GTD vô cơ: gốc hydroxyl (•OH), gốc hydroperoxyl (HO2•), gốc superoxid(O2•−), gốc nitrogen oxid (•NO), gốc nitrogen dioxid (•NO2).

 GTD hữu cơ: gốc peroxyl (RO2•), gốc alkoxyl (RO•)

Có những phân tử khác bắt nguồn từ oxy nhưng không phải GTD, ví dụ nhưhydrogen peroxid (H2O2) Ngoài ra, GTD còn được phân loại theo 2 dạng reactiveoxygen species (ROS) và reactive nitrogen species (RNS)

Các GTD là sản phẩm từ quá trình chuyển hóa bình thường của tế bào Chúng đượccông nhận là có vai trò hai mặt, vừa có lợi vừa có hại Chúng hữu ích khi ở nồng độtrung bình, vì liên quan đến các quá trình sinh lý như sự đáp ứng của tế bào trướccác chất độc, khả năng chống lại các tác nhân lây nhiễm, vai trò trong hệ thống tínhiệu của tế bào Mặt có hại của các GTD là gây ra tình trạng stress oxy hóa, dẫn đếncác tổn thương sinh học, phá hủy cấu trúc tế bào và làm ảnh hưởng đến hệ thốngsống [27]

Hầu hết các GTD có nguồn gốc nội sinh, là sản phẩm phụ của các phản ứng chuyểnhóa bình thường và cơ bản, chẳng hạn như phản ứng tạo ra năng lượng từ ty thểhoặc các phản ứng khử độc của hệ thống enzym Cytocrom P450 của sắc tố tế bàogan Nguồn ngoại sinh bao gồm tiếp xúc với khói thuốc lá, chất ô nhiễm môi trườngchẳng hạn như khí thải từ xe máy và các nhà máy công nghiệp, uống rượu, amiăng,tiếp xúc với phóng xạ ion hóa, nhiễm vi khuẩn, nấm, hoặc virus

Hình 1.5 Sự hình thành gốc tự do

Hình 1.6 Nguyên nhân tạo nên stress oxy hóa

1.3.2 Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là trạng thái bùng nổ của các GTD, xảy ra khi có sự sản sinh quá

mức các GTD hoặc do sự suy giảm của các chất chống oxy hóa trong hệ thống sinh

học Nói cách khác, stress oxy hóa là kết quả của các phản ứng chuyển hóa sử dụng

oxy, nó mô tả trạng thái xáo trộn cân bằng oxy hóa trong cơ thể sống Sự dư thừacác GTD có thể dẫn đến sự phá hủy các lipid, protein, hoặc DNA của tế bào, ức chế

chức năng bình thường của chúng Do đó, stress oxy hóa liên quan đến một số bệnh

ở người cũng như quá trình lão hóa Sự cân bằng giữa tác dụng có lợi và có hại củacác GTD ảnh hưởng quan trọng đến cơ thể sống, sự cân bằng này có được thôngqua cơ chế điều hòa oxy hóa khử “redox regulation” Cơ chế này bảo vệ cơ thể khỏi

các stress oxy hóa và duy trì sự ổn định nội mô oxy hóa khử “redox homeostasis”

thông qua sự kiểm soát trạng thái oxy hóa khử “redox status” trong cơ thể [27]

Hình 1.7 Quá trình peroxid hóa lipid

1.3.3 Tổn thương do gốc tự do

1.3.3.1 Tổn thương trên lipid

Quá trình oxy hóa các phân tử lipid hay còn được gọi là “sự peroxid hóa lipid” làquá trình xảy ra dưới tác dụng gây hại của các GTD trên phân tử lipid, được xem

như một sự chỉ điểm cho stress oxy hóa trong tế bào và mô Các lipid peroxid

thường không bền, bị phân hủy cho ra một loạt các hợp chất phức tạp, các peroxidcủa acid béo không no sẽ tạo ra các phân tử malondialdehyd (MDA) và 4-hydroxyalkenal (4-HDA)

Sự có mặt của các phân tử này được xem như sự biểu thị cho quá trình peroxid hóalipid và chúng thường được dùng để đánh giá mức độ của tiến trình oxy hóa lipidtrong cơ thể sống Một số aldehyd có thể phản ứng với các phân tử sinh học nhưprotein và DNA, tạo ra những sản phẩm ổn định góp phần vào cơ chế bệnh sinh củanhiều bệnh [9][33]

1.3.3.2 Tổn thương trên protein

Protein là cấu trúc chính trong thành phần của tế bào, do vậy nó cũng là mục tiêutấn công của quá trình oxy hóa Phản ứng giữa protein và các GTD tạo ra nhiều sảnphẩm khác nhau, dẫn đến sự phá hủy cấu trúc và chức năng bình thường của phân

tử protein Quá trình oxy hóa các phân tử protein diễn ra qua nhiều bước, từ đó các

sản phẩm được hình thành, trong đó phổ biến nhất là các phân tử protein carbonyl.Chúng được hình thành sớm và tương đối ổn định Vì thế, các phân tử này thườngđược sử dụng như một chất chỉ điểm sinh học cho quá trình oxy hóa protein trong

cơ thể sống [27] Thông qua việc xác định các phân tử protein carbonyl, nhiềunghiên cứu đã chứng minh được sự liên quan giữa quá trình oxy hóa protein với tiếntrình lão hóa, stress oxy hóa, và một vài bệnh lý liên quan như đái tháo đường, thiếumáu cục bộ cơ tim, thiếu máu nuôi thận [27][36] Các aminoacid của protein điều

có thể là mục đích tấn công của các GTD, đặc biệt là cystein và methionin

Hình 1.8 Quá trình oxy hóa protein

Hình 1.9 Sự tấn công DNA của gốc hydroxyl

1.3.3.3 Tổn thương trên DNA (deoxyribonucleic acid)

Nghiên cứu chứng minh rằng một tế bào của cơ thể một ngày có thể tiếp xúc vớikhoảng 1,5x105 lần tấn công từ các tác nhân oxy hóa như gốc hydroxyl hoặc cácGTD khác Gốc hydroxyl có thể phản ứng với tất cả các thành phần của phân tửDNA, tổn hại các base purin và pyrimidin, cũng như khung đường deoxyribose dẫnđến sự thay đổi vĩnh viễn của vật liệu di truyền Đây là bước đầu tiên trong quátrình dẫn đến đột biến gen, ung thư và sự già hóa

Sự tổn hại DNA gây ra bởi các GTD dẫn đến sự xuất hiện của nhiều mô ung thưkhác nhau Cho đến nay đã có hơn 100 sản phẩm từ quá trình oxy hóa DNA đãđược xác định, đặc trưng là 8-OH-G Sự phá hủy bao gồm sự sửa đổi các basepurin, pyrimidin, hoặc đường deoxyribose, tạo liên kết chéo DNA, phá vỡ cấu trúcDNA Kết quả gây ra sự ức chế hoặc cảm ứng sao mã, truyền đạt tín hiệu di truyền,lỗi trong sao mã, bất ổn cấu trúc gen, tất cả điều có liên quan đến căn bệnh ung thư[27]

1.4 Chất chống oxy hóa

1.4.1 Đại cương về chất chống oxy hóa [1]

Chất chống oxy hóa là những chất khi hiện diện với một lượng nhỏ có thể ngănchặn hoặc làm giảm đi quá trình oxy hóa các phân tử sinh học, là nhóm của cácvitamin, chất vô cơ, enzym, và những chất có nguồn gốc tự nhiên giúp bảo vệ tế bàokhỏi sự tổn hại do GTD gây ra Các chất chống oxy hóa có thể bao gồm:

- Các enzym chống oxy hóa: superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT),glutathion peroxidase (GPx), thioredoxin reductase, glutathion reductase,peroxiredoxin

- Các chất chống oxy hóa có nhóm thiol như glutathion, thioredoxin, lipoic acid

- Các vitamin chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E

- Các nguyên tố vi lượng như selenium, đồng, kẽm, mangan

- Carotenoid như beta caroten, lycopen, lutein, isozeaxanthin, canthaxanthin,astaxanthin

- Các phenol và polyphenol như các phenol đơn giản, các flavonoid, tanin, và cácpolyphenol khác

- Các chất tạo phức với ion kim loại như acid citric, EDTA (ethylen diamin tetraacetat) protein, amino acid, peptid

Các chất chống oxy hóa có tác dụng ngăn chặn các phản ứng gây độc cho cơ thể,làm mất tác dụng của các GTD, tạo thành các sản phẩm bất hoạt, quá trình thườngdiễn ra qua một loạt các phản ứng Các chất chống oxy hóa cộng tác với nhau đểloại trừ GTD Mỗi chất chống oxy hóa có tác dụng riêng với từng loại gốc tự do ởmỗi tế bào

1.4.2 Đại cương về chanh dây

1.4.2.1 Tên gọi

Tên khoa học: Passiflora edulis Sims.

Tên thường gọi: Chanh dây, chanh leo, dây mát

Chanh dây là loại cây đa niên, dài đến 15m Thân tròn cạnh, mang tua dài và lá ởmỗi đốt Lá mọc xen, mang lá kèm ở mỗi đốt Cuống lá dài 2-5 cm, mang phiến lá

có 3 thùy dài, kích thước lá 10-15 x 12-25 cm, bìa phiến có răng cưa nhỏ, tròn đầu.Hoa đơn độc, mọc từ nách lá, đường kính 7,5-10 cm với cuống dài 2-5 cm, có 5cánh hoa và 5 đài hoa trắng mọc xen nhau, bên trên là 2 lớp tràng với các sợi trắngdài 2-3 cm, ửng tím ở gốc Mỗi hoa mang 5 nhị đực với 5 chỉ dính nhau thành ống ởđáy và tách rời ở phần mang bao phấn Trái hình cầu đến bầu dục, kích thước 4-12 x4-7 cm, màu tím sậm tự rụng khi chín Trái mang rất nhiều hột có cơm mềm, mùithơm Phần cơm chứa nhiều acid được thu hoạch, thêm đường, cô đặc và chế biếnlàm nước giải khát, nước quả, rượu hay mứt

1.4.2.4 Thành phần hóa học

Một số nhóm hợp chất đã được xác định từ cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.)

[36]

 Flavonoid: là nhóm hợp chất đã được tìm thấy trong lá và thân chanh dây, có

nhiều flavonoid đã được xác định bằng phương pháp phân tích HPLC-PDA nhưvitexin, isovitexin, orientin và isoorientin

vitexinorientin

Hình 1.11 Cấu trúc các flavonoid trong chanh dây

Hình 1.10 Chanh dây

 Alkaloid: cũng là nhóm hợp chất được tìm thấy trong lá chanh dây, các alkaloid

đã được xác định như: harman, harmin, harmalol, và harmalin

Ngoài ra có có các thành phần khác như: các polyphenol, saponin, cycloartantriterpen, carbohydrat, amino acid, chất khoáng, các acid hữu cơ

1.4.2.5 Tác dụng và công dụng

Trong lá chanh dây giàu các polyphenol, chủ yếu là flavonoid được xem là nhómchất có tác dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên Khả năng chống oxy hóacủa cao chiết alcol từ lá được thử nghiệm in-vitro và ex-vivo Trong thử nghiệm ex-vivo, cao chiết từ lá của cây chanh dây có khả năng làm giảm số lượng tế bào chết

đi do sắt Ngoài ra cao chiết còn cho hiệu quả chống lại sự phá hủy protein do sắt vàglucose Đặc tính chống oxy hóa của cao chiết từ lá của cây chanh dây được giảithích là khả năng bất hoạt các gốc tự do như 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl(DPPH), superoxid, hydroxyl, hypochlorous acid (HOCl) Hoạt tính chống oxy hóa

Hình 1.12 Cấu trúc các alkaloid trong chanh dây

R = H = Harman

R = OCH3 = Harmin

R = OH = Harmalol

R = OCH3 = Harmalin

của dịch chiết ether dầu và chloroform từ lá và thân của cây chanh dây đã đượcđánh giá bằng phương pháp dọn dẹp gốc DPPH, phương pháp này được đề nghị bởiBlois (1958) DPPH thường được sử dụng như một phương pháp thuận tiện vàchính xác để đánh giá các chất chống oxy hóa tự nhiên hoặc tổng hợp Cao chiết từ

lá của cây chanh dây có thể được nghiên cứu tiếp như là một chất chống oxy hóa tựnhiên, nhiều nghiên cứu gần đây xem xét thử nghiệm cao chiết từ lá của cây chanhdây trên khả năng ngăn chặn các bệnh tiểu đường, thoái hóa thần kinh do các stressoxy hóa gây nên

Ngoài ra các kết quả nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính kháng viêm, chống lo âu,

kháng khối u và chống cao huyết áp của chanh dây Cao chiết nước từ lá cây chanh

dây ở liều 50, 100, 150 mg/kg cho hoạt tính chống lo âu Đồng thời cho hoạt tínhkháng viêm trên mô hình chuột bị viêm phổi ở liều từ 100 – 1000 mg/kg Ở liều 100mg/kg hoặc 250 mg/kg ức chế hoạt tính của myeloperoxidase và adenosinedeaminase, làm giảm C-reactive protein huyết thanh Nghiên cứu cho thấy dịchchiết nước từ cây chanh dây, ở các nồng độ khác nhau có tác dụng ức chế hoạt độngcủa gelatinase matrix metalloproteinases (MMP-2 và MMP-9), liên quan đến sự dicăn, xâm lấn và tạo mạch của khối u Các báo cáo cũng cho thấy dịch chiếtmethanol từ vỏ chanh dây, có khả năng làm giảm huyết áp tâm thu ở chuột (rat) caohuyết áp tự nhiên khi sử dụng đường uống với liều 10 mg/kg hoặc 50 mg/kg

Chanh dây được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới Nhiều nghiên cứu đã cho thấytác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, chống lo âu, và kháng khối u từ cây chanhdây Việc nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để có thể phát huy hết tiềm năng của câychanh dây trong phòng và trị bệnh [36]

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, giống Swiss đực, thể trọng từ 20-22 gram, đangtrưởng thành (4-5 tuần tuổi), do viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.Trước khi tiến hành thí nghiệm chuột được ổn định ở điều kiện tiến hành thí nghiệmtrong thời gian khoảng 1 tuần Chuột được cung cấp đủ nước và thức ăn theo tiêuchuẩn của viện Pasteur cung cấp

2.1.2 Dược liệu thí nghiệm

Lá từ cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.) được thu hái ở thôn 3, xã Đắk Nia, thị

xã Gia Nghĩa, tỉnh Đắk Nông, vào tháng 1 năm 2010

Cây được định danh bởi bộ môn Dược liệu, trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

2.1.3 Hóa chất thí nghiệm

Dung môi: cồn 96o, chloroform, ether ethylic, methanol, anhydrid acetic, …đềudùng loại do Trung Quốc sản xuất do cửa hàng hóa chất Thành Mỹ, số 2D, MậuThân, Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ cung cấp

Các hóa chất khác: acid hydrochloric, acid sulfuric, NaOH 5%, NaOH 10%, cácthuốc thử (Valse - Mayer, Bertrand, Bouchardat, Dragendroff, KOH 5%/cồn, FeCl3gelatin muối, m-dinitrobenzen 1%/cồn, xanthydrol…), magnesi kim loại do bộ mônDược liệu, khoa Dược, trường Đại Học Y Dược Cần Thơ pha chế và cung cấp.Natri chloride 0,9 %

Paraquat (Syngenta)

2.1.4 Dụng cụ thí nghiệm

Tủ sấy (Memmert), nồi cách thủy (Memmert)

Tủ Hot ESCO, Singapore

Máy cô quay Buchi

Cân kỹ thuật tự động ADAM d=0,1g, Cân phân tích OHAUS, USA, d=0,0001g.Đèn UV 254/365 nm SPECTROLINE, USA

Các mô hình thí nghiệm: open field test, beam walking test, forced swimming test,tail suspension test, rope climbing test, nghiệm pháp chuột bơi gắng sức

Cùng một số dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm: becher, erlen, bình lắnggạn, phễu, ống nghiệm, kéo, kẹp, bơm tiêm, ống đong

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất dược liệu và định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây

2.2.1.1 Chiết xuất dược liệu

Lá CD được phơi khô dưới ánh nắng mặt trời trong khoảng 7 ngày, sau đó được xâythành bột mịn Làm ẩm 2 kg bột dược liệu với dung môi là methanol, nạp bột dượcliệu vào bình ngấm kiệt, cho methanol vào ngập mặt dược liệu, tiến hành ngấm kiệt.Sau 24 giờ tiến hành rút dịch chiết với tốc độ 2 ml/phút, dịch chiết được cô quaydưới áp suất thấp để thu hồi dung môi, ta thu được cao toàn phần

2.2.1.2 Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao toàn phần từ lá chanh dây

Phương pháp định tính được tham khảo trong giáo trình “ Phương pháp nghiên cứudược liệu” của bộ môn Dược liệu, trường Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ ChíMinh [3]

Dịchether Dịch cồn

Dịch cồnthủy phân

Dịchnước

Dịch nướcthủy phânCarotenoid x

HCl 10% / cách thủy

Chiết lại bằng ether

Hình 2.1 Sơ đồ chuẩn bị dịch chiết cho quá trình định tính

HCl 10% / cách thủy

thủy phân

Hòa tan trong cồn

Hòa tan trong ether ethylic

Cao chiết methanol ban đầu

Ghi chú: x : dịch chiết dùng để định tính nhóm hợp chất

 Xác định carotenoid

Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn Thêm vào cắn vàigiọt dung dịch SbCl3 (khan) bão hòa trong chloroform (thuốc thử Carr-Price) Dungdịch có màu xanh sau đó chuyển thành màu đỏ  có carotenoid

Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn Thêm vào cắn vàigiọt H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngảsang màu xanh  có carotenoid

 Xác định triterpenoid

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách thủy đến cắn Hòa tan cắn bằng0,5 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform, chuyển dung dịchqua ống nghiệm Thêm 1-2 ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm (phản ứngLiebermann-Burchard)

Nếu nơi tiếp xúc 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch trênlớp ngăn cách chuyển thành màu xanh lục đến tím  có triterpenoid

 Xác định anthraquinon

Lấy 5 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ Thêm vào 1 ml dung dịch NaOH10%, lắc kỹ Nếu lớp kiềm có màu từ hồng đến đỏ  có anthraquinon.

 Xác định coumarin

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, bay hơi đến khô Nhỏ lên vết dịch chiết1-2 giọt KOH 10% trong và sấy nhẹ cho khô Che một nửa vết dịch chiết bằngmiếng kim loại, soi với đèn tử ngoại 365 nm Sau vài phút, lấy miếng kim loại chevết dịch chiết ra Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn nhưng sau đósáng dần lên cho tới khi có cường độ tương đương  có coumarin

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách thủy đến cắn Hòa cắn trong 2-4

ml dung dịch HCl 5% Chia dung dịch vào 5 ống nghiệm Định tính bằng các thuốcthử: Valse - Mayer, Bertrand, Bouchardat, Dragendroff

So sánh với ống chứng: nếu dung dịch đục hơn hoặc có tủa  có alkaloid

 Xác định glycosid tim

Định tính vòng lacton 5 cạnh: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách

thủy đến cắn Hòa cắn lại với 2 ml cồn, gạn vào ống nghiệm nhỏ Cho 2-3 giọt dungdịch m-dinitrobenzen 1% trong cồn, rồi thêm vào 3 giọt KOH 5% (phản ứngRaymond – Marthoud) Nếu có màu tím  có các cardenolid

Định tính đường 2-desoxy: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách thủy

đến cắn Hòa cắn lại với 5 ml thuốc thử xanthydrol, đậy ống nghiệm bằng nút bônggòn, cách thủy 5 phút Nếu có màu hồng đến đỏ mận  có đường 2-desoxy

 Xác định tanin

Lấy khoảng 2 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách thủy đến cắn Hòa tan cắn trong 4

ml nước Lọc, chia làm 2 ống nghiệm

Ống 1: pha loãng 0,5 ml dịch chiết với 1ml nước cất Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl35%, lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh đen hoặc xanh rêu  có polyphenol.

Ống 2: thêm vào dịch lọc 5 giọt gelatin muối, lắc đều so sánh với ống chứng Nếu

có tủa bông trắng  có tannin

 Xác định saponin

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào vào chén sứ, cách thủy đến cắn Hòa cắn với 5

ml cồn 25%, lọc vào ống nghiệm Pha loãng với 5 ml nước, lắc mạnh theo chiềudọc của ống trong 15 giây Nếu có bọt bền trong 15 phút  có saponin

 Xác định hợp chất khử

Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cách thủy đến cắn Hòa cắn lại với 2

ml cồn, lọc Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5

ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy 5 phút Nếu có kết tủa đỏ gạch lắng dướiđáy ống nghiệm  có các chất khử

2.2.2 Mô hình thí nghiệm chung

2.2.2.1 Giai đoạn 1: thăm dò dãy liều gây ngộ độc cấp của paraquat có tác động

trên hệ dopaminergic và hệ serotonergic

Chuột được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm từ 12-15 con:

Nhóm 1: tiêm phúc mô (IP) nước muối sinh lý, liều 0,1ml (Chứng)

Nhóm 2: tiêm phúc mô (IP) paraquat, liều 8 mg/kg (PQ 8)

Nhóm 3: tiêm phúc mô (IP) paraquat, liều 10 mg/kg (PQ10)

Nhóm 4: tiêm phúc mô (IP) paraquat, liều 12 mg/kg (PQ12)

Thực hiện quy trình tiêm thuốc trong 3 tuần liên tiếp, mỗi tuần tiêm 3 lần, quy

trình được tóm tắt trong Hình 2.2.

3h

PQ PQ

2.2.2.2 Giai đoạn 2: khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá

chanh dây với liều paraquat xác định

Chuột được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm từ 12-15 con:

Nhóm 1: nhóm được cho uống cao lá chanh dây (CD) liều 500 mg/kg và 1000

mg/kg và tiêm phúc mô nước muối sinh lý (Chứng)

Nhóm 2: nhóm được cho uống nước muối sinh lý và tiêm phúc mô paraquat liều

được chọn (Muối + PQ)

Nhóm 3: nhóm được cho uống cao lá chanh dây liều 500 mg/kg và tiêm phúc mô

paraquat liều được chọn (CD 500 + PQ)

Nhóm 4: nhóm được cho uống cao lá chanh dây liều 1000 mg/kg và tiêm phúc mô

paraquat liều được chọn (CD 1000 + PQ)

Mô hình được tóm tắt trong Hình 2.3.

Tiêm phúc mô PQ 3 tuần, mỗi tuần 3 lần, tiêm 2 giờ sau khi cho uống CD, dùng

liều tấn công CD trong 3 ngày đầu:

 CD 500 mg/kg x 3 lần/ngày x 3 ngày

 CD 1000 mg/kg x 3 lần/ngày x 3 ngày

Sau đó, dùng liều duy trì như trên chỉ 1 lần/ngày

Hình 2.3 Mô hình khảo sát tác dụng chống oxy hóa của cao lá chanh dây

với liều paraquat được chọn

2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của paraquat trên hệ dopaminergic

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự mất mất chọn lọc của các tế bào thần kinhdopaminergic giữa vùng nhân đen (substantial nigra) và thể vân (striatum) khi tiếpxúc với thuốc diệt cỏ PQ Sự tổn hại các tế bào này dẫn đến các tổn thương về vậnđộng biểu hiện giống bệnh Parkinson Trong mô hình thí nghiệm này chúng tôi đãlựa chọn open field test, rope climbing test và nghiệm pháp chuột bơi gắng sức làcác behavior test để thăm dò chức năng vận động và sức bền của động vật thửnghiệm Thông qua kết quả từ các test, làm cơ sở cho việc đánh giá độc tính của PQtrên hệ dopaminergic

2.2.3.1 Open field test

Open field test được mô tả lần đầu bởi Hall vào năm 1934 Đến năm 1976, Walsh &Cummins sử dụng open field test để thăm dò khả năng vận động và khám phá ởchuột Mục đích của open field test là khảo sát phản ứng của chuột trước môitrường mới và không quen thuộc Thông thường trước môi trường lạ, chuột thườngtăng di chuyển và vận động để khám phá mọi thứ xung quanh Tuy nhiên nếu vùngnão liên quan đến vận động bị tổn thương chuột sẽ thu mình và giảm hoạt động.Khả năng vận động và khám phá của mỗi chuột được đánh giá dựa trên số ô màchuột di chuyển, ngoài ra còn có các thông số đánh giá khác như số lần đứng lênbằng 2 chân sau, số lần vào ô trung tâm hoặc khoảng thời gian chuột ở ô trung tâm.Tần số vào ô trung tâm cao hoặc thời gian ở lại lâu thể hiện khả năng vận động vàkhám phá cao (Hình 2.2.A.) [13]

Phương pháp tiến hành:

Dụng cụ thí nghiệm là một hộp có đáy bằng nhựa màu trắng, dài 30 cm, rộng 28

cm, cao 15 cm Đáy hộp được chia thành những ô nhỏ (7,5x7cm) Hộp không nắp

và đặt dưới vùng chiếu sáng đồng đều Chuột được đặt vào vùng trung tâm, quan sát

và đếm số ô mà chuột di chuyển trong vòng 5 phút Các số ô được tính khi ít nhấthai chân trước của chuột đặt vào ô Sau mỗi lần thử nghiệm, lau sạch hộp trước khitiến hành thử nghiệm tiếp theo

A B Hình 2.4 (A,B) Mô hình thí nghiệm open field test 2.2.3.2 Rope climbing test

Rope climbing test là một trong những test thăm dò khả năng phối hợp vận động vàsức bền của động vật thử nghiệm Dụng cụ thử test tương đối đơn giản, đó là mộtsợi dây thừng có đường kính đúng yêu cầu, được treo cách mặt đất một khoảng nhấtđịnh, phía dưới có lót bông tránh làm động vật bị tổn thương khi rơi khỏi dây, phíatrên có đặt hộp thoát hiểm Khi chức năng vận động suy giảm, động vật thử nghiệm

dễ rơi khỏi dây hơn, hoặc thời gian đến được hộp thoát hiểm sẽ chậm hơn trạng tháibình thường Các thông số đánh giá trong thí nghiệm là thời gian trung bình từ khibắt đầu đến khi động vật leo đến hộp thoát hiểm, hoặc thời gian từ khi bắt đầu đếnkhi động vật rơi xuống

Phương pháp tiến hành:

Chuẩn bị một sợi dây thừng dài 1 m, đường kính 1 cm, treo cách mặt đất 60 cm,phía dưới đặt một hộp bông độn Lúc bắt đầu, đặt chuột ở giữa sợi dây, đầu hướnglên trên, ghi nhận thời gian từ đầu đến khi chuột rơi xuống

Hình 2.5 Mô hình thí nghiệm rope climbing test